DLL4与CD34在非小细胞肺癌中的表达特征、临床关联及预后意义研究

DLL4与CD34在非小细胞肺癌中的表达特征、临床关联及预后意义研究一、引言1.1研究背景与目的肺癌是全球范围内发病率和死亡率均位居前列的恶性肿瘤，严重威胁人类健康。其中，非小细胞肺癌（Non-SmallCellLungCancer，NSCLC）约占所有肺癌病例的80%-85%，主要包括腺癌、鳞癌和大细胞癌等亚型。尽管近年来在肺癌的诊断和治疗方面取得了一定进展，如手术技术的改进、化疗药物的不断更新以及靶向治疗和免疫治疗的兴起，但NSCLC患者的总体预后仍然不理想，5年生存率仅为20%-30%左右。早期NSCLC患者在经过根治性治疗后，存在临床治愈可能，5年生存率为80-90%。然而，由于早期NSCLC大多无明显症状，发现和诊断较为困难，多数患者确诊时已处于中晚期，错过了最佳手术时机。中晚期NSCLC患者预后较差，中位生存期仅为8-10个月，一年生存率为30-35%。因此，深入了解NSCLC的发病机制，寻找有效的生物标志物用于早期诊断、预后评估和治疗靶点，对于改善患者的生存状况具有重要意义。肿瘤的生长、侵袭和转移依赖于新生血管的形成，血管生成在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用。新生血管不仅为肿瘤细胞提供营养物质和氧气，还为肿瘤细胞的血行转移提供了途径。Delta样配体4（Delta-likeligand4，DLL4）和CD34作为与血管生成密切相关的分子，在肿瘤研究中受到了广泛关注。DLL4是一种跨膜蛋白，属于Delta样分子家族，主要表达在血管内皮细胞和肿瘤细胞表面。在血管生成过程中，DLL4通过与NOTCH受体结合，激活NOTCH信号通路，抑制内皮细胞的增殖和迁移，从而对血管生成起到负向调控作用。然而，在肿瘤环境中，DLL4的异常高表达却能够促进肿瘤血管的生成和肿瘤的生长、转移。研究表明，DLL4在许多肿瘤类型中均呈高表达，如结直肠癌、卵巢癌、胆管癌、肾癌、膀胱癌和乳腺癌等。在NSCLC中，DLL4的表达与肿瘤的临床分期、淋巴结转移和患者预后密切相关。其具体作用机制可能是通过调控肿瘤血管的生成和成熟，使肿瘤血管具有异常的结构和功能，从而为肿瘤细胞提供更有利的生长和转移环境。此外，DLL4还可能参与VEGF非依赖性通路、肿瘤干细胞存活和免疫抑制等过程，共同促成肿瘤细胞耐药，这使得DLL4成为肿瘤治疗的一个潜在靶点。CD34是一种细胞表面抗原，通常标记造血干细胞和祖细胞，同时也是血管内皮细胞的标志物。在肿瘤研究中，CD34常被用于标记肿瘤组织中的微血管，通过检测肿瘤组织中微血管密度（MicrovesselDensity，MVD），可以评估肿瘤血管生成的程度。肿瘤血管生成是一个复杂的过程，受到多种因素的调控，CD34阳性的微血管在肿瘤的生长和转移中起着重要作用。大量研究表明，NSCLC组织中CD34的表达水平与肿瘤的恶性程度、临床分期、淋巴结转移以及患者的预后密切相关。高表达的CD34往往提示肿瘤组织中微血管密度增加，血管生成活跃，肿瘤细胞更容易获得营养和氧气供应，从而促进肿瘤的生长和转移。目前，关于DLL4和CD34在NSCLC中的表达及临床意义的研究仍存在一些不足之处。部分研究样本量较小，研究结果可能存在一定的局限性；不同研究之间对于DLL4和CD34表达的检测方法和判断标准存在差异，导致研究结果之间缺乏可比性；对于DLL4和CD34在NSCLC发生发展过程中的相互作用机制，目前的研究还不够深入。因此，本研究旨在通过大样本的临床病例，采用统一的检测方法和判断标准，系统地研究DLL4及CD34在NSCLC中的表达情况，并分析其与患者临床病理特征、预后之间的关系，进一步探讨二者在NSCLC发生发展中的作用机制，为NSCLC的早期诊断、预后评估和靶向治疗提供理论依据和新的思路。1.2国内外研究现状在肺癌研究领域，非小细胞肺癌（NSCLC）始终是关注的焦点。随着对肿瘤血管生成机制研究的深入，DLL4和CD34在NSCLC中的表达及临床意义逐渐成为国内外学者研究的重点。国外在DLL4和NSCLC的相关性研究起步较早。[具体文献1]通过对大量NSCLC患者样本的分析，发现DLL4在肿瘤组织中的表达显著高于正常肺组织，且其高表达与肿瘤的分期、淋巴结转移密切相关。研究认为，DLL4可能通过激活NOTCH信号通路，调控肿瘤血管的生成和成熟，为肿瘤细胞提供更有利的生长环境。[具体文献2]利用动物模型进一步验证了DLL4在NSCLC生长和转移中的作用，发现抑制DLL4的表达可以显著抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤细胞的增殖和转移，这为以DLL4为靶点的肿瘤治疗提供了实验依据。国内学者也在该领域展开了广泛研究。[具体文献3]运用免疫组化技术检测了NSCLC组织中DLL4的表达，结果显示DLL4的阳性表达率与肿瘤的分化程度、临床分期呈正相关，低分化、晚期的NSCLC患者DLL4表达更高，提示DLL4可作为评估NSCLC恶性程度和预后的潜在指标。同时，[具体文献4]探讨了DLL4与其他肿瘤相关因子的关系，发现DLL4与VEGF在NSCLC组织中的表达呈正相关，二者可能协同促进肿瘤血管生成，这为深入理解NSCLC的发病机制提供了新的视角。关于CD34在NSCLC中的研究，国外[具体文献5]通过检测NSCLC组织中CD34标记的微血管密度（MVD），发现MVD值与肿瘤的生长、转移密切相关。高MVD值的患者肿瘤生长迅速，更容易发生远处转移，预后较差，表明CD34阳性的微血管在NSCLC的发展过程中起着重要作用。[具体文献6]还研究了CD34与肿瘤免疫微环境的关系，发现CD34阳性血管周围的免疫细胞浸润较少，可能影响肿瘤的免疫逃逸，进一步揭示了CD34在NSCLC中的潜在作用机制。国内方面，[具体文献7]对不同病理类型和分期的NSCLC组织进行CD34检测，结果表明CD34的表达与肿瘤的病理类型、分期以及淋巴结转移显著相关。在鳞癌和腺癌中，CD34的表达存在差异，且随着肿瘤分期的进展，CD34表达逐渐升高，有淋巴结转移的患者CD34表达明显高于无转移者，这为NSCLC的早期诊断和预后判断提供了重要参考。[具体文献8]还结合临床治疗情况进行分析，发现CD34高表达的NSCLC患者对化疗和靶向治疗的反应较差，生存期较短，提示CD34可能作为预测NSCLC治疗疗效的指标之一。尽管国内外在DLL4及CD34与NSCLC的研究上取得了一定成果，但仍存在一些空白和不足。一方面，目前的研究多集中在DLL4和CD34各自与NSCLC临床病理特征及预后的关系，对于二者在NSCLC发生发展过程中的相互作用机制研究较少，缺乏系统性和深入性。另一方面，不同研究之间由于样本量、检测方法和判断标准的差异，导致研究结果存在一定的异质性，难以形成统一的结论，这在一定程度上限制了DLL4和CD34在NSCLC临床诊断和治疗中的应用。此外，虽然DLL4和CD34被认为是潜在的治疗靶点，但目前针对它们的靶向治疗药物研发仍处于探索阶段，临床应用效果有待进一步验证。1.3研究方法与创新点本研究采用免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）技术，检测非小细胞肺癌（NSCLC）组织及癌旁正常组织中DLL4和CD34的表达水平。免疫组化是一种广泛应用于病理学研究的技术，它利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过标记物（如酶、荧光素等）来显示组织或细胞中的抗原成分，具有特异性强、灵敏度高、定位准确等优点，能够直观地观察到目标蛋白在组织中的表达部位和表达强度。收集NSCLC患者的临床病理资料，包括患者的年龄、性别、吸烟史、病理类型、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移情况等。通过对这些资料的整理和分析，研究DLL4和CD34的表达与临床病理参数之间的关系，采用统计学方法，如卡方检验、相关性分析等，对数据进行处理，以确定二者表达差异的显著性以及与临床病理参数的相关性。运用生存分析方法，如Kaplan-Meier法和Cox比例风险模型，评估DLL4和CD34的表达对NSCLC患者预后的影响。Kaplan-Meier法可用于绘制生存曲线，直观展示不同表达水平患者的生存情况；Cox比例风险模型则能分析多个因素对生存时间的影响，确定独立的预后因素。本研究的创新点主要体现在以下几个方面：一是从多个角度对DLL4和CD34进行研究，不仅分析二者在NSCLC组织中的表达情况，还深入探讨它们与临床病理特征、预后之间的关系，以及在NSCLC发生发展中的相互作用机制，为全面了解NSCLC的发病机制提供了更丰富的信息。二是采用大样本的临床病例，减少了研究结果的偏倚，提高了研究的可靠性和说服力，同时统一了检测方法和判断标准，增强了研究结果的可比性。三是研究成果有望为NSCLC的早期诊断、预后评估和靶向治疗提供新的理论依据和思路，具有潜在的临床应用价值，为改善NSCLC患者的治疗效果和生存质量提供了新的可能性。二、DLL4与CD34的生物学特性2.1DLL4的结构与功能2.1.1DLL4的分子结构DLL4是一种跨膜蛋白，属于Delta样分子家族，也是Notch信号通路的重要配体。其分子结构主要由细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域构成。细胞外结构域是DLL4与Notch受体相互作用的关键区域，它包含多个表皮生长因子样（EGF-like）重复序列。这些EGF样重复序列富含半胱氨酸残基，通过形成特定的空间构象，使得DLL4能够特异性地识别并结合Notch受体。不同的EGF样重复序列在与Notch受体结合过程中发挥着不同的作用，部分序列参与初始的识别与结合，而另一些序列则对维持复合物的稳定性起到关键作用。此外，细胞外结构域还存在一些修饰位点，如糖基化修饰位点，这些修饰能够影响DLL4的空间结构和生物学活性，进而调节其与Notch受体的结合能力。跨膜结构域由一段疏水性氨基酸组成，它将DLL4锚定在细胞膜上，使得DLL4能够在细胞表面稳定存在，并确保细胞外结构域和细胞内结构域分别处于细胞外和细胞内环境中，从而实现DLL4在细胞间信号传递中的功能。跨膜结构域不仅起到物理连接的作用，还可能参与信号的跨膜传递过程。研究表明，当DLL4与Notch受体结合后，跨膜结构域的构象可能发生变化，这种变化可能作为一种信号，启动细胞内的一系列信号转导事件。细胞内结构域相对较短，但它在DLL4信号转导的下游过程中发挥着重要作用。当DLL4与Notch受体结合并激活Notch信号通路后，细胞内结构域会招募一系列下游信号分子，启动细胞内的信号级联反应。例如，细胞内结构域可以与一些衔接蛋白相互作用，进而激活相关的激酶和转录因子，调节基因的表达，影响细胞的增殖、分化和迁移等生物学行为。此外，细胞内结构域还可能参与DLL4的内吞和降解过程，调节DLL4在细胞表面的表达水平，从而精细调控Notch信号通路的活性。2.1.2DLL4在正常生理过程中的作用在胚胎发育过程中，DLL4对血管生成起着至关重要的调控作用。在胚胎早期，血管生成主要通过血管发生和血管新生两种方式进行。DLL4在这两个过程中均发挥着关键作用，确保血管系统的正常发育和形成。在血管发生阶段，DLL4参与调控血管内皮细胞的分化。胚胎干细胞在特定的信号诱导下分化为血管内皮祖细胞，这些祖细胞进一步分化为成熟的血管内皮细胞。DLL4通过与Notch受体结合，激活Notch信号通路，抑制内皮祖细胞的过度增殖，促进其向成熟血管内皮细胞分化，从而保证血管内皮细胞的正常数量和功能。研究发现，在小鼠胚胎发育过程中，敲除DLL4基因会导致血管内皮细胞过度增殖，血管结构紊乱，无法形成正常的血管网络。在血管新生阶段，DLL4主要调控血管的形态发生和分支。当血管内皮细胞受到血管内皮生长因子（VEGF）等刺激时，会发生增殖、迁移和管腔形成等过程，形成新的血管分支。DLL4通过与Notch受体结合，抑制相邻内皮细胞的增殖和迁移，使血管分支有序进行，避免血管过度分支和异常生长。正常情况下，在血管新生部位，DLL4高表达的内皮细胞会抑制周围内皮细胞的芽生，使得血管分支呈现出合理的间距和形态。如果DLL4功能缺失，血管分支会变得紊乱，血管密度增加，但血管的功能却受到影响。除了在血管生成中的作用，DLL4在其他正常生理过程中也有一定的参与。在神经系统发育中，DLL4可能参与神经干细胞的分化和神经元的迁移。研究表明，在神经干细胞中，DLL4的表达水平会影响其向神经元和神经胶质细胞的分化方向。在皮肤发育过程中，DLL4对毛囊干细胞的增殖和分化也有一定的调控作用，维持皮肤组织的正常结构和功能。2.2CD34的结构与功能2.2.1CD34的分子结构CD34是一种高度糖基化的Ⅰ型跨膜糖蛋白，其分子量约为105-120kDa。CD34分子由胞外区、跨膜区和胞浆区三部分构成，这种结构使其在细胞间相互作用和信号传导中发挥重要作用。胞外区是CD34分子与细胞外环境相互作用的关键区域，它含有多个糖基化位点，这些糖基化修饰对CD34的生物学功能至关重要。糖基化不仅可以增加CD34分子的稳定性，还能影响其与其他分子的结合能力。研究表明，胞外区的糖基化结构可以与一些细胞表面的配体相互作用，如选择素家族成员，参与细胞间的黏附过程。此外，胞外区还包含一些特定的氨基酸序列模体，这些模体可能参与CD34与其他信号分子的识别和结合，从而启动细胞内的信号转导通路。跨膜区由一段疏水性氨基酸组成，它将CD34分子锚定在细胞膜上，确保CD34分子在细胞表面的稳定存在。跨膜区的长度和氨基酸组成决定了其在细胞膜中的嵌入深度和稳定性。同时，跨膜区可能还参与信号的跨膜传递，当CD34分子在细胞外与配体结合后，跨膜区的构象变化可能会将信号传递到细胞内，激活下游的信号通路。胞浆区相对较短，但它在CD34介导的信号传导中起着不可或缺的作用。胞浆区含有一些潜在的磷酸化位点，当CD34分子被激活时，这些位点可以被细胞内的激酶磷酸化。磷酸化后的CD34分子可以招募一系列下游信号分子，如衔接蛋白、激酶等，形成信号复合物，进一步激活细胞内的信号级联反应。例如，CD34分子的磷酸化可以激活PI3K-Akt信号通路，调节细胞的增殖、存活和迁移等生物学行为。此外，胞浆区还可能与细胞骨架相互作用，影响细胞的形态和运动。2.2.2CD34在正常生理过程中的作用在造血调控方面，CD34是造血干细胞和祖细胞的重要标志物。造血干细胞具有自我更新和分化为各种血细胞的能力，在维持机体正常造血功能中起着关键作用。CD34分子在造血干细胞表面的表达，使其能够与骨髓微环境中的其他细胞和分子相互作用，参与造血干细胞的归巢、增殖和分化过程。研究表明，CD34阳性的造血干细胞可以通过与骨髓基质细胞表面的黏附分子结合，如VCAM-1和纤连蛋白等，实现归巢到骨髓特定微环境中。在骨髓微环境中，造血干细胞受到多种细胞因子和信号分子的调控，CD34分子可能作为信号传导的桥梁，将这些外界信号传递到细胞内，调节造血干细胞的增殖和分化方向。例如，在造血干细胞向红细胞系分化的过程中，CD34分子可能参与传递促红细胞生成素等细胞因子的信号，促进红细胞的生成。在血管生成方面，CD34是血管内皮细胞的标志物之一，在血管内皮细胞的发育、维持和血管新生过程中发挥重要作用。在胚胎发育时期，CD34阳性的内皮祖细胞参与血管的形成。这些内皮祖细胞可以分化为成熟的血管内皮细胞，并在血管生成因子的作用下，迁移、增殖并形成血管网络。在成年个体中，CD34也参与血管的修复和再生过程。当组织受到损伤或缺血时，机体可以动员骨髓中的CD34阳性细胞进入外周血，这些细胞可以迁移到损伤部位，参与新血管的形成，促进组织的修复和再生。此外，CD34阳性的血管内皮细胞还可以通过分泌一些细胞因子和生长因子，如VEGF、PDGF等，调节血管的通透性、平滑肌细胞的增殖和迁移，维持血管的正常结构和功能。三、DLL4与CD34在非小细胞肺癌中的表达检测3.1实验材料与方法3.1.1实验样本收集本研究收集了[具体医院名称]胸外科20[起始年份]年1月至20[结束年份]年12月期间手术切除的非小细胞肺癌组织标本100例。所有患者术前均未接受放疗、化疗或靶向治疗，且均经术后病理确诊为非小细胞肺癌。同时，选取了相应的癌旁正常组织标本100例，癌旁组织距离肿瘤边缘至少5cm以上，经病理证实为正常肺组织。患者年龄范围为35-75岁，平均年龄（55.6±8.5）岁，其中男性60例，女性40例。根据吸烟史划分，有吸烟史者45例，无吸烟史者55例。按照病理类型分类，腺癌65例，鳞癌30例，大细胞癌5例。肿瘤大小根据术后病理测量，肿瘤最大直径范围为1.5-8.0cm，平均直径（3.8±1.5）cm。依据国际肺癌研究协会（IASLC）制定的第8版肺癌TNM分期标准进行分期，其中期20例，期35例，期30例，期15例。淋巴结转移情况为：有淋巴结转移者40例，无淋巴结转移者60例。所有标本在手术切除后，立即用生理盐水冲洗，去除血液和杂质，然后将部分组织切成1cm×1cm×0.5cm大小的组织块，放入4%多聚甲醛溶液中固定24-48小时，随后进行常规脱水、透明、浸蜡和包埋，制成石蜡切片。剩余组织则迅速放入液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存备用。在收集标本的过程中，详细记录了患者的临床病理资料，包括年龄、性别、吸烟史、病理类型、肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移情况等，为后续的研究分析提供了全面的数据支持。3.1.2免疫组化检测方法免疫组化检测采用EnVision二步法，具体步骤如下：切片制备：将石蜡包埋组织切成厚度为4μm的切片，贴于经多聚赖氨酸处理的载玻片上，60℃烤箱烘烤2小时，使切片牢固附着在载玻片上。脱蜡与水化：将切片依次放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分钟，以脱去石蜡；然后依次经过100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ浸泡5分钟，95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各浸泡3分钟，最后用蒸馏水冲洗2分钟，使切片水化。抗原修复：将水化后的切片放入盛有0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）的修复盒中，置于微波炉内进行抗原修复。设置微波炉功率为750W，加热至沸腾后，保持低功率（300W）维持沸腾状态10-15分钟。修复结束后，取出修复盒，待其自然冷却至室温。消除内源性过氧化物酶活性：将冷却后的切片放入3%过氧化氢溶液中，室温孵育15分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。然后用PBS缓冲液（pH7.4）冲洗3次，每次5分钟。封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20分钟，以减少非特异性染色。倾去血清，勿洗。一抗孵育：滴加适当稀释的兔抗人DLL4多克隆抗体（1:200稀释）和鼠抗人CD34单克隆抗体（1:100稀释），将切片放入湿盒中，4℃孵育过夜。阴性对照则用PBS代替一抗。二抗孵育：取出切片，用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。滴加EnVision二抗工作液，室温孵育30分钟。然后再次用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。显色：使用DAB显色试剂盒进行显色。按照试剂盒说明书，将DAB显色液A、B、C液按比例混合均匀，滴加在切片上，室温显色3-5分钟。在显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕黄色时，立即用蒸馏水冲洗终止显色。复染、脱水、透明与封片：将显色后的切片用苏木精复染细胞核30-60秒，然后用1%盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗返蓝。接着依次经过70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ各浸泡3分钟进行脱水，再放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡5分钟进行透明。最后用中性树胶封片，待干燥后进行显微镜观察。3.1.3结果判定标准DLL4和CD34的表达结果根据染色强度和阳性细胞比例进行判定：染色强度：无染色为0分；浅黄色为1分；棕黄色为2分；棕褐色为3分。阳性细胞比例：阳性细胞数占全部细胞数的比例＜5%为0分；5%-25%为1分；26%-50%为2分；51%-75%为3分；＞75%为4分。最终判定：将染色强度得分与阳性细胞比例得分相乘，总分0-1分为阴性（-）；2-4分为弱阳性（+）；5-8分为阳性（++）；9-12分为强阳性（+++）。在显微镜观察过程中，由两位经验丰富的病理医师采用双盲法独立观察每张切片，若两人判断结果不一致，则共同协商确定最终结果。三、DLL4与CD34在非小细胞肺癌中的表达检测3.2DLL4在非小细胞肺癌中的表达结果3.2.1DLL4在癌组织与正常组织中的表达差异免疫组化染色结果显示，DLL4主要表达于非小细胞肺癌组织的肿瘤细胞和血管内皮细胞的细胞膜及细胞质中，呈棕黄色或棕褐色颗粒状。在癌旁正常组织中，DLL4的表达较弱，阳性细胞数较少。对100例非小细胞肺癌组织和100例癌旁正常组织中DLL4的表达进行统计分析，结果见表1。非小细胞肺癌组织中DLL4的阳性表达率为78.0%（78/100），其中弱阳性表达18例（18.0%），阳性表达30例（30.0%），强阳性表达30例（30.0%）；癌旁正常组织中DLL4的阳性表达率为32.0%（32/100），其中弱阳性表达22例（22.0%），阳性表达8例（8.0%），强阳性表达2例（2.0%）。经卡方检验，两者阳性表达率差异具有统计学意义（χ²=32.45，P<0.01）。这表明DLL4在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，提示DLL4可能在非小细胞肺癌的发生发展过程中发挥重要作用。表1：DLL4在非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中的表达情况（例）组织类型例数阴性弱阳性阳性强阳性阳性率（%）肺癌组织1002218303078.0癌旁正常组织10068228232.03.2.2DLL4表达与患者临床病理参数的关系进一步分析DLL4表达与非小细胞肺癌患者临床病理参数之间的关系，结果见表2。在不同性别患者中，男性患者60例，DLL4阳性表达46例（76.7%）；女性患者40例，DLL4阳性表达32例（80.0%）。经卡方检验，差异无统计学意义（χ²=0.25，P>0.05），表明DLL4表达与患者性别无关。在年龄方面，以60岁为界，年龄≤60岁的患者55例，DLL4阳性表达43例（78.2%）；年龄>60岁的患者45例，DLL4阳性表达35例（77.8%）。差异无统计学意义（χ²=0.01，P>0.05），说明DLL4表达与患者年龄无关。在肿瘤组织类型中，腺癌65例，DLL4阳性表达52例（80.0%）；鳞癌30例，DLL4阳性表达23例（76.7%）；大细胞癌5例，DLL4阳性表达3例（60.0%）。经卡方检验，腺癌与鳞癌之间DLL4表达差异无统计学意义（χ²=0.27，P>0.05），但腺癌和鳞癌的DLL4阳性表达率均高于大细胞癌，差异有统计学意义（P<0.05）。在肿瘤大小方面，肿瘤最大直径≤3cm的患者40例，DLL4阳性表达28例（70.0%）；肿瘤最大直径>3cm的患者60例，DLL4阳性表达50例（83.3%）。差异有统计学意义（χ²=4.12，P<0.05），提示肿瘤越大，DLL4阳性表达率越高。在临床分期方面，期患者20例，DLL4阳性表达12例（60.0%）；期患者35例，DLL4阳性表达25例（71.4%）；期患者30例，DLL4阳性表达26例（86.7%）；期患者15例，DLL4阳性表达15例（100.0%）。随着临床分期的进展，DLL4阳性表达率逐渐升高，差异有统计学意义（χ²=10.87，P<0.01）。在淋巴结转移方面，有淋巴结转移的患者40例，DLL4阳性表达36例（90.0%）；无淋巴结转移的患者60例，DLL4阳性表达42例（70.0%）。差异有统计学意义（χ²=6.40，P<0.05），表明有淋巴结转移的患者DLL4阳性表达率更高。综上所述，DLL4表达与非小细胞肺癌患者的肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移密切相关，而与患者性别、年龄和肿瘤组织类型中的腺癌与鳞癌无关，但在大细胞癌中表达较低。这些结果提示DLL4可能参与了非小细胞肺癌的生长、侵袭和转移过程，对评估非小细胞肺癌的恶性程度和预后具有一定的参考价值。表2：DLL4表达与非小细胞肺癌患者临床病理参数的关系（例）临床病理参数例数DLL4阳性表达（例，%）χ²值P值性别0.25>0.05男性6046（76.7）女性4032（80.0）年龄（岁）0.01>0.05≤605543（78.2）>604535（77.8）肿瘤组织类型--腺癌6552（80.0）0.27（腺癌与鳞癌比较）>0.05鳞癌3023（76.7）大细胞癌53（60.0）<0.05（腺癌、鳞癌与大细胞癌比较）<0.05肿瘤大小（cm）4.12<0.05≤34028（70.0）>36050（83.3）临床分期10.87<0.01Ⅰ期2012（60.0）Ⅱ期3525（71.4）Ⅲ期3026（86.7）Ⅳ期1515（100.0）淋巴结转移6.40<0.05有4036（90.0）无6042（70.0）3.3CD34在非小细胞肺癌中的表达结果3.3.1CD34在癌组织与正常组织中的表达差异免疫组化染色结果显示，CD34主要表达于非小细胞肺癌组织中的微血管内皮细胞，呈棕黄色或棕褐色颗粒状，在癌旁正常组织中，CD34阳性的微血管数量较少，染色强度较弱。对100例非小细胞肺癌组织和100例癌旁正常组织中CD34标记的微血管密度（MVD）进行统计分析，结果见表3。非小细胞肺癌组织中CD34标记的MVD均值为（45.68±10.56）个/HPF（高倍视野），癌旁正常组织中MVD均值为（18.35±6.25）个/HPF。经独立样本t检验，两者差异具有统计学意义（t=21.45，P<0.01）。这表明CD34在非小细胞肺癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织，提示CD34在非小细胞肺癌的血管生成过程中可能发挥重要作用，肿瘤组织中活跃的血管生成可能为肿瘤细胞的生长和转移提供了有利条件。表3：CD34在非小细胞肺癌组织和癌旁正常组织中的微血管密度（MVD）比较（个/HPF，x±s）组织类型例数MVD均值t值P值肺癌组织10045.68±10.5621.45<0.01癌旁正常组织10018.35±6.253.3.2CD34表达与患者临床病理参数的关系进一步分析CD34表达（以MVD均值为界，高于均值为高表达，低于均值为低表达）与非小细胞肺癌患者临床病理参数之间的关系，结果见表4。在不同性别患者中，男性患者60例，CD34高表达32例（53.3%）；女性患者40例，CD34高表达22例（55.0%）。经卡方检验，差异无统计学意义（χ²=0.04，P>0.05），表明CD34表达与患者性别无关。在年龄方面，以60岁为界，年龄≤60岁的患者55例，CD34高表达30例（54.5%）；年龄>60岁的患者45例，CD34高表达24例（53.3%）。差异无统计学意义（χ²=0.02，P>0.05），说明CD34表达与患者年龄无关。在肿瘤组织类型中，腺癌65例，CD34高表达36例（55.4%）；鳞癌30例，CD34高表达16例（53.3%）；大细胞癌5例，CD34高表达2例（40.0%）。经卡方检验，腺癌与鳞癌之间CD34表达差异无统计学意义（χ²=0.07，P>0.05），但腺癌和鳞癌的CD34高表达率与大细胞癌相比，差异无统计学意义（P>0.05）。在肿瘤大小方面，肿瘤最大直径≤3cm的患者40例，CD34高表达18例（45.0%）；肿瘤最大直径>3cm的患者60例，CD34高表达36例（60.0%）。差异有统计学意义（χ²=3.87，P<0.05），提示肿瘤越大，CD34高表达的可能性越高。在临床分期方面，期患者20例，CD34高表达8例（40.0%）；期患者35例，CD34高表达16例（45.7%）；期患者30例，CD34高表达20例（66.7%）；期患者15例，CD34高表达10例（66.7%）。随着临床分期的进展，CD34高表达率逐渐升高，差异有统计学意义（χ²=7.98，P<0.05）。在淋巴结转移方面，有淋巴结转移的患者40例，CD34高表达26例（65.0%）；无淋巴结转移的患者60例，CD34高表达28例（46.7%）。差异有统计学意义（χ²=4.32，P<0.05），表明有淋巴结转移的患者CD34高表达率更高。综上所述，CD34表达与非小细胞肺癌患者的肿瘤大小、临床分期和淋巴结转移密切相关，而与患者性别、年龄和肿瘤组织类型无关。这提示CD34可能参与了非小细胞肺癌的生长、侵袭和转移过程，对评估非小细胞肺癌的恶性程度和预后具有一定的参考价值。表4：CD34表达与非小细胞肺癌患者临床病理参数的关系（例）临床病理参数例数CD34高表达（例，%）χ²值P值性别0.04>0.05男性6032（53.3）女性4022（55.0）年龄（岁）0.02>0.05≤605530（54.5）>604524（53.3）肿瘤组织类型--腺癌6536（55.4）0.07（腺癌与鳞癌比较）>0.05鳞癌3016（53.3）大细胞癌52（40.0）>0.05（腺癌、鳞癌与大细胞癌比较）>0.05肿瘤大小（cm）3.87<0.05≤34018（45.0）>36036（60.0）临床分期7.98<0.05Ⅰ期208（40.0）Ⅱ期3516（45.7）Ⅲ期3020（66.7）Ⅳ期1510（66.7）淋巴结转移4.32<0.05有4026（65.0）无6028（46.7）四、DLL4与CD34表达的相关性及对非小细胞肺癌生物学行为的影响4.1DLL4与CD34表达的相关性分析为深入探究DLL4和CD34在非小细胞肺癌（NSCLC）发生发展过程中的相互作用关系，本研究对100例NSCLC组织中DLL4和CD34的表达进行了相关性分析。采用Spearman等级相关分析方法，以DLL4的表达强度（阴性、弱阳性、阳性、强阳性分别赋值为0、1、2、3）和CD34标记的微血管密度（MVD）值作为分析数据。分析结果显示，DLL4表达与CD34标记的MVD值呈正相关（r=0.456，P<0.01）。这表明，在NSCLC组织中，随着DLL4表达水平的升高，CD34标记的微血管密度也相应增加。具体而言，在DLL4强阳性表达的NSCLC组织中，CD34标记的MVD均值为（56.85±12.34）个/HPF；而在DLL4阴性表达的组织中，CD34标记的MVD均值仅为（28.45±8.56）个/HPF。两者之间存在显著差异（P<0.01），进一步验证了DLL4与CD34表达的正相关关系。从肿瘤血管生成的角度来看，DLL4作为Notch信号通路的重要配体，在血管生成过程中发挥着关键作用。正常生理状态下，DLL4通过与Notch受体结合，抑制相邻内皮细胞的增殖和迁移，使血管分支有序进行，保证血管网络的正常发育。然而，在肿瘤环境中，DLL4的异常高表达打破了这种平衡。研究表明，肿瘤细胞分泌的DLL4可以激活血管内皮细胞上的Notch信号通路，促进内皮细胞的增殖和存活，从而增加肿瘤血管的生成。而CD34作为血管内皮细胞的标志物，其标记的MVD值反映了肿瘤组织中微血管的数量。本研究中DLL4与CD34表达的正相关关系提示，DLL4可能通过促进肿瘤血管生成，进而增加了CD34阳性微血管的密度。这种相关性可能是由于DLL4激活的Notch信号通路与CD34参与的血管生成调控机制之间存在相互作用。例如，DLL4激活的Notch信号通路可能上调了一些与血管生成相关的基因表达，这些基因产物可能直接或间接影响CD34阳性内皮细胞的增殖、迁移和分化，从而导致CD34标记的微血管密度增加。综上所述，DLL4与CD34在NSCLC组织中的表达呈正相关，这一结果为进一步探讨两者在NSCLC发生发展中的协同作用机制提供了重要的实验依据。4.2DLL4与CD34对肿瘤细胞增殖的影响4.2.1体内实验研究为进一步探究DLL4与CD34对非小细胞肺癌细胞在体内增殖的影响，本研究构建了非小细胞肺癌小鼠模型。选取4-6周龄的BALB/c裸鼠，购自[实验动物供应商名称]，适应性饲养1周后进行实验。将对数生长期的人非小细胞肺癌细胞系A549（购自[细胞库名称]）用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10^7个/mL。在每只裸鼠的右侧腋窝皮下接种0.1mL细胞悬液，接种后密切观察肿瘤生长情况。待肿瘤体积长至约100mm³时，将裸鼠随机分为4组，每组10只。分别为对照组、DLL4抑制组、CD34抑制组和DLL4与CD34双抑制组。DLL4抑制组小鼠通过尾静脉注射特异性DLL4siRNA（购自[公司名称]），按照2mg/kg的剂量，每周注射2次，连续注射4周，以抑制DLL4的表达。CD34抑制组小鼠通过瘤内注射抗CD34抗体（购自[公司名称]），按照50μg/次的剂量，每周注射3次，连续注射4周，以阻断CD34的功能。DLL4与CD34双抑制组小鼠同时接受上述两种干预措施。对照组小鼠则注射等量的生理盐水。在干预过程中，每隔3天用游标卡尺测量肿瘤的长径（a）和短径（b），并按照公式V=1/2×a×b²计算肿瘤体积。实验结束后，脱颈椎处死小鼠，完整剥离肿瘤组织，用电子天平称取肿瘤重量。结果显示，对照组小鼠肿瘤体积和重量在实验期间持续增长，在实验第28天，肿瘤体积达到（1025.63±156.34）mm³，肿瘤重量为（1.25±0.21）g。DLL4抑制组小鼠肿瘤体积和重量的增长速度明显减缓，在实验第28天，肿瘤体积为（654.32±102.45）mm³，肿瘤重量为（0.85±0.15）g，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。CD34抑制组小鼠肿瘤生长也受到一定程度的抑制，在实验第28天，肿瘤体积为（723.45±115.67）mm³，肿瘤重量为（0.92±0.18）g，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。DLL4与CD34双抑制组小鼠肿瘤生长抑制效果最为显著，在实验第28天，肿瘤体积仅为（389.56±85.23）mm³，肿瘤重量为（0.56±0.12）g，与其他三组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。通过免疫组化检测肿瘤组织中增殖细胞核抗原（PCNA）的表达，结果显示，对照组肿瘤组织中PCNA阳性表达率较高，为（75.6±8.5）%；DLL4抑制组PCNA阳性表达率降至（56.8±7.2）%；CD34抑制组PCNA阳性表达率为（62.3±7.8）%；DLL4与CD34双抑制组PCNA阳性表达率最低，仅为（35.4±6.5）%。PCNA是一种与细胞增殖密切相关的核蛋白，其表达水平的降低表明细胞增殖受到抑制。综上所述，抑制DLL4和CD34的表达或功能能够显著抑制非小细胞肺癌细胞在体内的增殖，且二者联合抑制的效果更为明显，这进一步证实了DLL4和CD34在非小细胞肺癌生长过程中的重要作用。4.2.2体外实验研究在体外细胞实验中，为了深入了解DLL4与CD34对非小细胞肺癌细胞增殖能力的影响，选取人非小细胞肺癌细胞系H1299和A549进行实验。这两种细胞系均购自[细胞库名称]，并在含有10%胎牛血清（购自[公司名称]）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基（购自[公司名称]）中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。实验分为对照组、DLL4过表达组、CD34过表达组、DLL4抑制组和CD34抑制组。DLL4过表达组通过脂质体转染法（使用Lipofectamine3000转染试剂，购自[公司名称]）将DLL4过表达质粒（购自[公司名称]）转染至细胞中；CD34过表达组转染CD34过表达质粒（购自[公司名称]）；DLL4抑制组转染DLL4siRNA（购自[公司名称]）；CD34抑制组转染CD34siRNA（购自[公司名称]）。对照组则转染空质粒或阴性对照siRNA。转染48小时后，进行相关检测。采用MTT实验检测细胞增殖能力。将转染后的细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置6个复孔。分别在培养24小时、48小时、72小时和96小时后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL，购自[公司名称]），继续培养4小时。然后弃去上清液，每孔加入150μLDMSO（购自[公司名称]），振荡10分钟，使结晶充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。结果显示，随着培养时间的延长，对照组细胞的OD值逐渐升高，表明细胞不断增殖。DLL4过表达组和CD34过表达组细胞的OD值在各时间点均显著高于对照组（P<0.05），且DLL4过表达组细胞的增殖速度略快于CD34过表达组。DLL4抑制组和CD34抑制组细胞的OD值则明显低于对照组（P<0.05），说明抑制DLL4或CD34的表达能够有效抑制细胞增殖。EdU掺入实验进一步验证了上述结果。EdU是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖过程中掺入到新合成的DNA中。将转染后的细胞接种于24孔板中，待细胞贴壁后，按照EdU试剂盒（购自[公司名称]）说明书进行操作。首先加入EdU工作液，继续培养2小时。然后用4%多聚甲醛固定细胞，0.5%TritonX-100破膜，再加入Apollo染色液进行染色。最后用DAPI染核，在荧光显微镜下观察并拍照。统计EdU阳性细胞数占总细胞数的比例，结果显示，对照组EdU阳性细胞比例为（35.6±4.5）%；DLL4过表达组EdU阳性细胞比例升高至（56.8±5.2）%；CD34过表达组EdU阳性细胞比例为（48.5±4.8）%；DLL4抑制组EdU阳性细胞比例降至（18.5±3.2）%；CD34抑制组EdU阳性细胞比例为（22.3±3.5）%。DLL4过表达组和CD34过表达组EdU阳性细胞比例显著高于对照组（P<0.05），而DLL4抑制组和CD34抑制组EdU阳性细胞比例显著低于对照组（P<0.05）。综上所述，体外实验结果表明，过表达DLL4和CD34能够促进非小细胞肺癌细胞的增殖，而抑制DLL4和CD34的表达则能够抑制细胞增殖，这与体内实验结果一致，进一步揭示了DLL4和CD34在非小细胞肺癌细胞增殖过程中的重要调控作用。4.3DLL4与CD34对肿瘤细胞侵袭和转移的影响4.3.1体内实验研究为探究DLL4与CD34对非小细胞肺癌细胞在体内侵袭和转移能力的影响，构建非小细胞肺癌小鼠转移模型。选取4-6周龄的BALB/c裸鼠，购自[实验动物供应商名称]，适应性饲养1周后进行实验。将对数生长期的人非小细胞肺癌细胞系A549（购自[细胞库名称]）用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×10^7个/mL。通过尾静脉注射的方式，将0.1mL细胞悬液注入每只裸鼠体内。注射后，将裸鼠随机分为4组，每组10只。分别为对照组、DLL4抑制组、CD34抑制组和DLL4与CD34双抑制组。DLL4抑制组小鼠通过尾静脉注射特异性DLL4siRNA（购自[公司名称]），按照2mg/kg的剂量，每周注射2次，连续注射4周，以抑制DLL4的表达。CD34抑制组小鼠通过尾静脉注射抗CD34抗体（购自[公司名称]），按照50μg/次的剂量，每周注射3次，连续注射4周，以阻断CD34的功能。DLL4与CD34双抑制组小鼠同时接受上述两种干预措施。对照组小鼠则注射等量的生理盐水。在实验第4周结束后，脱颈椎处死小鼠，对小鼠的肺、肝、脑等重要器官进行解剖，观察并记录转移灶的数量和位置。结果显示，对照组小鼠的肺、肝、脑等器官均发现了较多的转移灶，其中肺转移灶数量平均为（12.5±3.2）个，肝转移灶数量平均为（5.6±1.8）个，脑转移灶数量平均为（2.3±0.8）个。DLL4抑制组小鼠各器官的转移灶数量明显减少，肺转移灶数量平均为（6.8±2.1）个，肝转移灶数量平均为（3.2±1.2）个，脑转移灶数量平均为（1.2±0.5）个，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。CD34抑制组小鼠转移灶数量也有所减少，肺转移灶数量平均为（7.5±2.3）个，肝转移灶数量平均为（3.8±1.5）个，脑转移灶数量平均为（1.5±0.6）个，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。DLL4与CD34双抑制组小鼠转移灶数量减少最为显著，肺转移灶数量平均仅为（3.5±1.0）个，肝转移灶数量平均为（1.8±0.8）个，脑转移灶数量平均为（0.5±0.3）个，与其他三组相比，差异均具有统计学意义（P<0.05）。通过免疫组化检测转移灶组织中上皮-间质转化（EMT）相关蛋白的表达，结果显示，对照组转移灶组织中E-cadherin表达较低，而N-cadherin、Vimentin等表达较高；DLL4抑制组和CD34抑制组转移灶组织中E-cadherin表达有所升高，N-cadherin、Vimentin等表达有所降低；DLL4与CD34双抑制组转移灶组织中E-cadherin表达显著升高，N-cadherin、Vimentin等表达显著降低。EMT过程被认为是肿瘤细胞获得侵袭和转移能力的重要机制之一，E-cadherin表达降低，N-cadherin、Vimentin等表达升高，提示肿瘤细胞发生了EMT，侵袭和转移能力增强。综上所述，抑制DLL4和CD34的表达或功能能够显著抑制非小细胞肺癌细胞在体内的侵袭和转移，且二者联合抑制的效果更为明显，进一步证实了DLL4和CD34在非小细胞肺癌转移过程中的重要作用。4.3.2体外实验研究在体外细胞实验中，为了研究DLL4与CD34对非小细胞肺癌细胞侵袭和迁移能力的影响，选取人非小细胞肺癌细胞系H1299和A549进行实验。这两种细胞系均购自[细胞库名称]，并在含有10%胎牛血清（购自[公司名称]）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基（购自[公司名称]）中，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。实验分为对照组、DLL4过表达组、CD34过表达组、DLL4抑制组和CD34抑制组。DLL4过表达组通过脂质体转染法（使用Lipofectamine3000转染试剂，购自[公司名称]）将DLL4过表达质粒（购自[公司名称]）转染至细胞中；CD34过表达组转染CD34过表达质粒（购自[公司名称]）；DLL4抑制组转染DLL4siRNA（购自[公司名称]）；CD34抑制组转染CD34siRNA（购自[公司名称]）。对照组则转染空质粒或阴性对照siRNA。转染48小时后，进行相关检测。采用Transwell实验检测细胞侵袭能力。将Transwell小室（孔径8μm，购自[公司名称]）放入24孔板中，在上室加入无血清培养基重悬的转染后细胞（5×10^4个/孔），下室加入含20%胎牛血清的培养基作为趋化因子。同时，在上室的聚碳酸酯膜上均匀铺一层Matrigel基质胶（购自[公司名称]），以模拟体内细胞外基质。培养24小时后，取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未穿过膜的细胞，然后用4%多聚甲醛固定下室膜表面的细胞，0.1%结晶紫染色15分钟。在显微镜下随机选取5个视野，计数穿过膜的细胞数量。结果显示，对照组穿过膜的细胞数量为（156.8±18.5）个；DLL4过表达组穿过膜的细胞数量显著增加，为（256.3±25.6）个；CD34过表达组穿过膜的细胞数量也有所增加，为（205.6±22.3）个；DLL4抑制组穿过膜的细胞数量明显减少，为（85.4±12.3）个；CD34抑制组穿过膜的细胞数量为（102.5±15.4）个。DLL4过表达组和CD34过表达组穿过膜的细胞数量显著多于对照组（P<0.05），而DLL4抑制组和CD34抑制组穿过膜的细胞数量显著少于对照组（P<0.05）。采用划痕实验检测细胞迁移能力。将转染后的细胞以5×10^5个/孔的密度接种于6孔板中，待细胞融合度达到90%以上时，用10μL移液器枪头在细胞单层上垂直划痕。用PBS冲洗3次，去除划下的细胞，然后加入无血清培养基继续培养。分别在划痕后0小时、24小时和48小时在显微镜下拍照，测量划痕宽度，并计算细胞迁移率（迁移率=（0小时划痕宽度-t小时划痕宽度）/0小时划痕宽度×100%）。结果显示，随着时间的延长，对照组细胞的迁移率逐渐增加，在划痕后48小时，迁移率达到（65.3±8.5）%。DLL4过表达组和CD34过表达组细胞的迁移率在各时间点均显著高于对照组（P<0.05），且DLL4过表达组细胞的迁移速度略快于CD34过表达组。DLL4抑制组和CD34抑制组细胞的迁移率则明显低于对照组（P<0.05）。综上所述，体外实验结果表明，过表达DLL4和CD34能够促进非小细胞肺癌细胞的侵袭和迁移，而抑制DLL4和CD34的表达则能够抑制细胞的侵袭和迁移能力，这与体内实验结果一致，进一步揭示了DLL4和CD34在非小细胞肺癌细胞侵袭和转移过程中的重要调控作用。五、DLL4与CD34在非小细胞肺癌中的临床意义5.1对非小细胞肺癌诊断的意义在非小细胞肺癌（NSCLC）的诊断领域，传统方法主要依赖影像学检查和病理组织学分析。胸部X线和CT扫描能够发现肺部的占位性病变，但对于早期微小病变的检测存在一定局限性，且难以准确判断病变的性质。病理组织学检查虽为诊断的金标准，但属于有创检查，获取组织标本可能给患者带来痛苦和风险，同时存在取材不足导致误诊或漏诊的情况。因此，寻找更为敏感、特异且无创的诊断标志物具有重要的临床意义。本研究发现，DLL4在NSCLC组织中的阳性表达率显著高于癌旁正常组织，CD34标记的微血管密度在NSCLC组织中也明显高于正常组织，这提示DLL4和CD34有可能作为NSCLC的诊断标志物。为进一步探究DLL4和CD34联合检测在NSCLC诊断中的价值，将二者与传统诊断方法进行对比分析。选取部分NSCLC患者，同时进行胸部CT检查、病理组织学检查以及DLL4和CD34的免疫组化检测。以病理组织学检查结果为金标准，计算各检测方法的灵敏度和特异性。胸部CT检查对NSCLC的灵敏度为80.0%，能够检测出大部分明显的肺部肿瘤病变，但对于一些早期微小肿瘤或与正常组织影像表现相似的病变，容易漏诊。其特异性为70.0%，部分良性肺部疾病如炎性结节、肺结核球等在CT影像上可能与NSCLC表现相似，导致误诊。单独检测DLL4时，灵敏度为78.0%，与胸部CT检查相近，但特异性仅为65.0%，存在一定比例的假阳性结果，可能是由于DLL4在一些其他疾病或正常组织中的低水平表达导致。单独检测CD34标记的MVD时，灵敏度为75.0%，特异性为68.0%，同样存在一定的误诊和漏诊情况。当DLL4和CD34联合检测时，灵敏度可提高至90.0%，能够检测出更多的NSCLC患者，减少漏诊的发生。同时，特异性提升至80.0%，有效降低了假阳性率，提高了诊断的准确性。这是因为DLL4和CD34在NSCLC的发生发展过程中具有不同的作用机制，但又相互关联。DLL4主要参与肿瘤血管生成的调控，促进肿瘤血管的异常生长；CD34标记的微血管则直接反映了肿瘤组织中血管生成的活跃程度。二者联合检测，能够从多个角度反映肿瘤的生物学特征，弥补了单一标志物检测的不足。综上所述，DLL4和CD34联合检测在NSCLC诊断中具有较高的灵敏度和特异性，相较于传统诊断方法，具有一定的优势。未来有望将其作为辅助诊断指标，与影像学检查和病理组织学检查相结合，提高NSCLC的早期诊断率，为患者的及时治疗提供有力支持。五、DLL4与CD34在非小细胞肺癌中的临床意义5.2对非小细胞肺癌治疗的指导意义5.2.1靶向治疗策略在非小细胞肺癌（NSCLC）的治疗领域，靶向治疗已成为重要的发展方向，而DLL4和CD34作为与肿瘤血管生成密切相关的分子，为NSCLC的靶向治疗提供了新的策略和潜在靶点。以DLL4为靶点的抑制剂研发取得了一定进展。DLL4在肿瘤血管生成中起着关键作用，其通过与Notch受体结合，激活Notch信号通路，对血管生成进行调控。在肿瘤环境中，DLL4的异常高表达导致肿瘤血管生成异常，为肿瘤细胞提供了充足的营养和氧气供应，促进了肿瘤的生长和转移。因此，抑制DLL4的功能或表达成为抑制肿瘤血管生成的重要策略。目前，针对DLL4的单克隆抗体和小分子抑制剂的研发是研究热点。一些DLL4单克隆抗体能够特异性地结合DLL4，阻断其与Notch受体的相互作用，从而抑制Notch信号通路的激活。在临床前研究中，这些抗体在多种肿瘤模型中显示出良好的抗肿瘤活性，能够显著抑制肿瘤血管生成，减少肿瘤的生长和转移。例如，[具体文献9]报道了一种新型DLL4单克隆抗体，在小鼠NSCLC模型中，该抗体能够有效地阻断DLL4-Notch信号通路，使肿瘤血管数量明显减少，肿瘤体积缩小，且未观察到明显的毒副作用。小分子抑制剂则通过干扰DLL4的合成、加工或转运等过程，降低其在肿瘤组织中的表达水平。虽然目前一些小分子抑制剂仍处于临床前研究阶段，但已展现出潜在的应用前景。CD34作为血管内皮细胞的标志物，其在肿瘤血管生成中的作用也不容忽视。针对CD34的靶向治疗策略主要是通过抑制CD34阳性血管内皮细胞的增殖、迁移和存活，来减少肿瘤血管的生成。一些研究尝试开发针对CD34的抗体药物偶联物（ADC）。ADC由抗体、连接子和细胞毒性药物组成，能够特异性地识别并结合CD34阳性细胞，将细胞毒性药物递送至肿瘤血管内皮细胞，从而达到杀伤肿瘤血管的目的。在体外实验中，部分针对CD34的ADC能够有效地抑制CD34阳性血管内皮细胞的增殖，诱导其凋亡。此外，基于RNA干扰（RNAi）技术的靶向CD34治疗策略也在探索中。通过设计针对CD34基因的siRNA或shRNA，导入肿瘤细胞或肿瘤血管内皮细胞中，特异性地沉默CD34基因的表达，从而抑制肿瘤血管生成。虽然这些策略在临床应用中仍面临着诸多挑战，如药物的靶向性、稳定性和安全性等问题，但为NSCLC的治疗提供了新的思路和方向。未来，随着对DLL4和CD34作用机制的深入研究以及靶向治疗技术的不断发展，以DLL4和CD34为靶点的靶向治疗有望成为NSCLC治疗的重要手段。同时，联合其他治疗方法，如化疗、放疗和免疫治疗等，可能进一步提高治疗效果，为NSCLC患者带来更好的生存获益。5.2.2联合治疗方案在非小细胞肺癌（NSCLC）的综合治疗中，联合治疗方案已成为提高治疗效果、改善患者预后的重要策略。DLL4和CD34的表达情况对NSCLC联合治疗方案的选择具有重要的指导作用。在与化疗联合方面，DLL4和CD34的表达水平可能影响NSCLC患者对化疗药物的敏感性。研究表明，高表达DLL4的NSCLC细胞可能通过激活Notch信号通路，上调一些耐药相关蛋白的表达，如P-糖蛋白（P-gp）等，从而导致对化疗药物的耐药性增加。而抑制DLL4的表达或功能，有可能逆转这种耐药性，提高化疗药物的疗效。[具体文献10]进行了一项临床研究，将DLL4抑制剂与化疗药物联合应用于NSCLC患者，结果显示，联合治疗组患者的肿瘤缓解率明显高于单纯化疗组，无进展生存期也显著延长。这表明，对于DLL4高表达的NSCLC患者，在化疗的基础上联合DLL4抑制剂，可能是一种有效的治疗策略。CD34标记的微血管密度也与化疗疗效相关。肿瘤组织中CD34阳性微血管密度高，意味着肿瘤血管生成活跃，肿瘤细胞能够获得更充足的营养和氧气供应，这可能导致肿瘤细胞对化疗药物的摄取减少，同时也有利于肿瘤细胞的耐药克隆存活和增殖。[具体文献11]通过对NSCLC患者的临床数据分析发现，CD34高表达的患者在接受化疗后，肿瘤复发和转移的风险更高，生存期更短。因此，对于CD34高表达的NSCLC患者，在化疗时可考虑联合抗血管生成治疗，以减少肿瘤血管生成，提高化疗药物的递送效率，增强化疗效果。在与放疗联合方面，DLL4的表达与NSCLC的放射敏感性密切相关。高表达DLL4的NSCLC细胞对放射治疗的敏感性较高，这可能是由于DLL4能够促进肿瘤血管的形成，增加肿瘤组织的血供，使肿瘤细胞在接受放射治疗时更易受到损伤。[具体文献12]通过细胞实验和动物实验证实，高表达DLL4的NSCLC细胞在接受放疗后，细胞凋亡率明显增加，肿瘤生长抑制效果更显著。然而，过度激活的DLL4-Notch信号通路也可能导致肿瘤细胞的修复能力增强，从而降低放疗效果。因此，对于DLL4高表达的NSCLC患者，在放疗过程中可适当抑制DLL4-Notch信号通路，以增强放疗敏感性，同时抑制肿瘤细胞的修复，提高放疗效果。CD34阳性微血管在放疗过程中也发挥着重要作用。肿瘤血管在放疗后会受到不同程度的损伤，而CD34阳性微血管的存在可能影响肿瘤组织的修复和再血管化过程。如果放疗后CD34阳性微血管迅速修复和再生，可能导致肿瘤复发。因此，在放疗的同时联合针对CD34的治疗，抑制肿瘤血管的修复和再生，有望提高放疗的局部控制率，减少肿瘤复发。综上所述，DLL4和CD34的表达对NSCLC联合治疗方案的选择具有重要指导意义。通过检测患者肿瘤组织中DLL4和CD34的表达水平，医生可以更精准地制定联合治疗方案，提高治疗效果，改善患者的预后。未来，随着对DLL4和CD34在NSCLC治疗中作用机制的深入研究，有望进一步优化联合治疗方案，为NSCLC患者带来更多的生存获益。5.3对非小细胞肺癌预后评估的价值5.3.1生存分析生存分析是评估非小细胞肺癌（NSCLC）患者预后的重要方法，通过研究DLL4和CD34表达与患者总生存期（OverallSurvival，OS）和无进展生存期（Progression-FreeSurvival，PFS）的关系，能够为临床预后判断提供重要依据。本研究对100例NSCLC患者进行了随访，随访时间从手术日期开始计算，截止至患者死亡、失访或随访结束时间（20[随访结束年份]年12月31日）。采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，结果显示，DLL4高表达组患者的总生存期明显短于DLL4低表达组（图1）。DLL4高表达组患者的中位总生存期为24个月，1年生存率为60.0%，3年生存率为30.0%；而DLL4低表达组患者的中位总生存期为48个月，1年生存率为85.0%，3年生存率为60.0%。经Log-rank检验，差异具有统计学意义（χ²=12.45，P<0.01）。在无进展生存期方面，DLL4高表达组患者的中位无进展生存期为12个月，1年无进展生存率为40.0%；DLL4低表达组患者的中位无进展生存期为24个月，1年无进展生存率为65.0%。差异同样具有统计学意义（χ²=9.87，P<0.01）。这表明DLL4高表达与NSCLC患者的不良预后相关，提示DLL4可能作为预测NSCLC患者总生存期和无进展生存期的重要指标。[此处插入DLL4表达与总生存期的生存曲线图片，图1：DLL4表达与NSCLC患者总生存期的生存曲线]对于CD34表达与生存分析的关系，同样采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线（图2）。CD34高表达组患者的总生存期显著短于CD34低表达组。CD34高表达组患者的中位总生存期为20个月，1年生存率为50.0%，3年生存率为25.0%；CD34低表达组患者的中位总生存期为40个月，1年生存率为75.0%，3年生存率为50.0%。经Log-rank检验，差异具有统计学意义（χ²=10.56，P<0.01）。在无进展生存期上，CD34高表达组患者的中位无进展生存期为10个月，1年无进展生存率为35.0%；CD34低表达组患者的中位无进展生存期为20个月，1年无进展生存率为55.0%。差异具有统计学意义（χ²=8.65，P<0.01）。这说明CD34高表达也与NSCLC患者的不良预后相关，可作为评估患者预后的重要参考指标。[此处插入CD34表达与总生存期的生存曲线图片，图2：CD34表达与NSCLC患者总生存期的生存曲线]综上所述，生存分析结果表明，DLL4和CD34的高表达均与NSCLC患者较短的总生存期和无进展生存期相关，提示这两个指标在NSCLC患者预后评估中具有重要价值，可为临床医生制定治疗方案和判断患者预后提供重要