液相色谱仪项目五87课件

液相色谱仪项目五能力目标学习要求与目标1.具有识别液相色谱仪结构组成的能力。2.具有根据质量标准，采用液相色谱仪分析检验的能力。知识目标1.掌握液相色谱仪的原理、基本组成与作用。2.掌握液相色谱仪的分析方法和操作过程。素质目标1.培养诚实守信、团结协作、爱岗敬业精神；2.培养安全、环保、健康生产意识；3.培养严谨的工作态度及质量意识，具备工程管理能力；4.培养分析问题和解决问题的能力；5.创新能力培养等。液相相色谱仪5.1认识液相色谱仪

一、仪器的组成高压输液系统进样系统色谱分离系统检测系统数据处理系统5.1认识液相色谱仪

高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统5.1认识液相色谱仪

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1.高压输液系统(1)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性。5.1认识液相色谱仪

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双活塞型往复泵5.1认识液相色谱仪5.1认识液相色谱仪

(2)贮液器和吸滤器：贮液器:0.5-2L的玻璃瓶。溶剂吸滤器:Ni合金，孔约0.45

m，防止颗粒物进入泵内。5.1认识液相色谱仪

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流动相贮器俗称贮液瓶，它对大多数有机化合物呈化学惰性，耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料，容量约为0.5L～2.0L，通常无色透明，若流动相需避光，有棕色瓶供选择。贮液瓶放置位置要高于泵体，以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶应密闭，以防溶剂蒸发引起流动相组成的改变和防止空气中的O2、CO2重新溶解于已脱气的流动相中。5.1认识液相色谱仪

3.脱气装置将相对分子量小的气体从溶剂中除去。在线真空脱气装置5.1认识液相色谱仪

流动相在使用前必须进行脱气处理，目的是除去其中溶解的气体。在装入贮液瓶之前必须经过0.45μm或0.22μm滤膜过滤。在洗脱过程中如存在气泡会增加基线噪音，严重时使分析灵敏度降低。此外溶解在流动相中的氧气，会造成荧光猝灭，影响荧光检测器的检测，还可能导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有如下几种：5.1认识液相色谱仪

（1）超声波振动脱气将欲脱气的流动相置放于超声波提取器中，用超声波振荡10～30min。此法较简单、常用。5.1认识液相色谱仪

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（2）抽真空脱气用微型真空泵，降压至0.05～0.07Mpa既可除去溶解的气体，使用水泵连接抽滤瓶和G4微孔玻璃漏斗可以一起完成过滤机械杂质和脱气的双重任务。由于抽真空会引起混合溶剂组成的变化，故此法适用于单一溶剂的体系脱气。对于多元溶剂体系，每种溶剂应预先脱气后再进行混合，以保证混合后的比例不变。5.1认识液相色谱仪

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外梯度:利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。5.1认识液相色谱仪

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2.进样系统

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：5.1认识液相色谱仪

LoadInject5.1认识液相色谱仪

自动进样装置

采用微处理机控制进样阀采样（通过阀针）、进样和清洗等操作。操作者只需把装好样品的小瓶按一定次序放入样品架上（有转盘式、排式），然后输入程序（如进样次数、分析周期等），启动，设备将自行运转。5.1认识液相色谱仪

自动进样器的吸样与洗针5.1认识液相色谱仪

自动进样器5.1认识液相色谱仪

3.色谱分离系统保护柱色谱柱柱温箱柱切换阀5.1认识液相色谱仪

色谱柱是分离好坏的关键使用时，流动相的方向应与柱的填充方向一致。色谱柱的柱管外壁都以箭头显著地标示了该柱的使用方向，安装和更换色谱柱时要使流动相按箭头所指方向流动。柱长15~30cm，内径4~5mm5.1认识液相色谱仪

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常见色谱柱的类型专业的液相色谱仪厂家都有色谱柱生产，除此外还有很多专业的色谱柱厂家。

C18—又称ODS柱，使用最普遍、规格多，适合大多数化合物的分析，市场上品种繁多，值得注意的是同样的C18柱，得到的结果可能非常不一致，尤其是极性或离子化合物。流动相为甲醇（乙腈）水系统。

C8—类同于C18柱，保留能力比C18差。

C4，C2，C1—反相，用于一些特定的化合物分析，寿命较短。

NH2—既能用于反相又可用于正相，常用于小分子的糖分析。5.1认识液相色谱仪

色谱柱的保护1、在使用新柱之前，最好用有机溶剂在低流量下（0.2-0.3ml/min）冲洗30min，长时间未用的分析柱也要同样处理。2、定期使用有机溶剂冲洗柱子。3、使用缓冲盐时，要先用含5%-10%甲醇的水溶液冲洗，再用有机溶剂冲洗。4、净化样品。5、分离条件。6、不使用时，要盖上盖子，避免固定相干涸。5.1认识液相色谱仪

柱恒温箱柱温是液相色谱的重要参数，精确控制柱温可提高保留时间的重现性。一般情况下较高柱温能增加样品在流动相的溶解度，缩短分析时间，通常柱温升高6℃，组分保留时间减少约30%；升高柱温能增加柱效，提高分离效率；分析高分子化合物或粘度大的样品，柱温必须高于室温；对一些具有生物活性的生物分子分析时柱温应低于室温。液相色谱常用柱温范围一般为室温至60℃。5.1认识液相色谱仪

4.液相色谱检测器用来连续检测经色谱柱分离后的流出物的组成和含量变化的装置。

溶质性检测器：仅对被分离组分理化特性响应紫外、荧光、电化学检测器

总体检测器：对试样和洗脱液总理化性质响应示差折光，电导检测器

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（1）紫外检测器（UV）

应用最广，对大部分有机化合物有响应。特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；

对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。5.1认识液相色谱仪

石英窗接色谱柱UV光电倍增管废液微量吸收池，光程为2-10mm,体积约为1~10

L最小检测量10-9g·mL-1对流量和温度波动不敏感可用于梯度洗脱。最常用的通用型检测器5.1认识液相色谱仪

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（2）电二极管阵列检测器（DAD）

时间、光强度和波长三维谱5.1认识液相色谱仪

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5.1认识液相色谱仪二极管阵列检测器的优点①采集三维谱图②峰纯度检验③光谱库检索④可以发现单波长检测时未检测到的峰5.1认识液相色谱仪

（3）荧光检测器原理：基于被分析组分发射的荧光强度进行检测优点：①灵敏度高，是最灵敏的检测器之一②选择性好③对温度和流速不敏感，可用于梯度洗脱缺点：仅适用于测定可产生荧光的物质可检测物质：对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。5.1认识液相色谱仪

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灵敏度高选择性好样品量很小适合药物和生化样品分析荧光检测器特点5.1认识液相色谱仪

（4）示差折光检测器

溶剂相和样品+溶剂相对光的折射率不同，造成两束光强度差变化，差示信号放大记录代表样品浓度。

通用型检测器，灵敏度为10-7g/ml对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。5.1认识液相色谱仪

原理：

连续测定流通池中溶液折射率来测定试样中各组分浓度。优点：通用型检测器缺点：①对温度变化敏感②对溶剂组成变化敏感，不能用于梯度检测③属于中等灵敏度的检测器检测器梯度

主要特点紫外-可见光可对流速和温度变化敏感；池体积可制作得很小；对溶质的响应变化大。荧光可选择性和灵敏度高；易受背景荧光、消光、温度、pH和溶剂的影响。化学发光困难灵敏度高；发光试剂受限；受流动相和脉动的影响。电导不可是离子性物质的通用检测器；受温度和流速影响；不能用于有机溶剂体系