T-SSESB 14-2025 基于环境DNA技术的水生入侵物种多重PCR 检测方法

MultiplexPCRdetectionmethodforaquaticinvasivespeciesbased2025-04-25发布2025-04-25实施i 4 4 4 专利名称：一种基于环境DNA检测水体中入侵物种罗非鱼的引物组及试剂盒专利名称：一组基于环境DNA检测入侵物种太本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的请注意，除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专本文件主要起草人：李晨虹、王玮、戚亿利、方敏瑶1基于环境DNA技术的水生入侵物种多重PCR检测方法本文件规定了利用环境DNA结合多重PCR技术检测外来入侵水生动物齐氏罗鱼(Lepomismacrochiru和柄海鞘(Styelaclava)的技术方法。本文件适用于湖泊、水库、河流、河口、海洋、海洋牧场、养殖塘等水下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)GB/T20201.1《标准化工作导则第GB/T603-2023化学试剂试验方法中所GB/T34797-2017核酸DB32/T4539-2023淡水生物环境DNA监HJ624-2011外来物种环境风险评估技SF/ZJD0105008-2018SN/T5225-2019进出口食品中五种致泻大肠埃希氏菌快速检测方法多重PCR法指存在于环境介质(水、土壤、沉积物、生物膜、空气等)或混合生物组织中的生物遗传物质(DNA)，包括但不限于生物体脱落的细胞、组织、分泌物、排泄物或外来入侵水生动物invasivealienaqua多重聚合酶链式反应(multiplexpolymerasechainr指位于细胞质线粒体中的遗传物质，呈双链闭合环状结构，存物种的多位点检测方法。从环境样品中提取遗传物质后利用两对或两对以引物，结合定制化的PCR反应体系和条件，对多个目的基因序列进行同时扩增，进一步对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳或测序验证，判3本技术方法设计的外来入侵水生动物齐氏罗非鱼(Coptodonzillii)、尼罗罗(Didemnumperlucidum)、皱瘤海检测对象名称引物位置序列扩增长度扩增区域罗非鱼上游引物5,-AACGAACCATTCACCGACCATTAAC-3,137-14216SribosomalRNA下游引物5,-CTTTTTCTTTTAGTCTTTCCCGGTTGG-3,上游引物5,-CCCCAGAAGTGACAACAACAAACC-3,232ND1-tRNA-Ile下游引物5,-CCCTTTATTTCAGGCACAACTCC-3,上游引物5,-CCTGCCTTCGTCCAAGTTCAA-3,93COXⅠ下游引物5,-CAATTCCTCCCTTTCTCGCTAGTG-3,上游引物5,-GAATTGCATAACTGATATCAAGAGCATAA-3,146-150D-loop下游引物5,-GGGGGGTTTACAGGAGTATTAGAGA-3,太阳鱼上游引物5,-CCATACTTTTCTATTAAACATATCAATAATG-3,266D-loop下游引物5,-CATTAAGAGATCAACTGATGGTAGGC-3,上游引物5,-TTTTTGGTTTCCTTTCACTTGGC-3,251D-loop下游引物5,-GGTTTTCAGGAGTGTTAGACATCTT-3,上游引物5,-CTAGGATTTCCCCATTCATTCATCAC-3,D-loop下游引物5,-AGGTATGGCGGGATGGTGTGT-3,海鞘上游引物5,-TTACGACCTCGATGTCG-3,101-10416SribosomalRNA下游引物5,-YYCGTYCTAAACCCARCTC-3,上游引物5,-CDGAYATAGCTTTTCCTCG-3,205-2COXⅠ下游引物5,-AAATACTAGAVAYYCTAGC-3,上游引物5,-CGTDVTATWCATRCDAAYRGDGCTAG-3,CYTB下游引物5,-CAAAAACTTATYTGHCYTCAAGG-3,c)氯化钠溶液，浓度（5mol·L-1）。），h)Tris-HC1溶液，浓度（0.1mol·L-1称取15.76g三羟甲基氨基甲烷盐j)氯仿，纯度＞99.5%。c)DNAMarkerDL2000：100bp~b)涡旋振荡器：1000-3500rpm。c)高速离心机：转速可达17,500rpm。5⑤溶解保存：室温干燥10min，加入50μL预热TE缓冲液（60℃),55℃孵6为进一步明确外来入侵水生动物种类，宜将含有不同索引的扩混合构建测序文库。文库的片段长度分布应符合预期，文库浓度应满足高通量测序要求。可参照GB/T30989和GB/T35537的规定对扩增产物进行测序。可参照DB32/T4539-2023对测序结果开展生物信息学分析，明确外来入侵水生动物种类。7实验中阳性对照组的目标条带处显示亮带，阴性对照组列进行比较，判定结果为×××外来入侵物种检出。针对多个靶标区域，任一靶标区生物废弃物在处理之前应采用高压灭菌、消毒或灼烧等方式灭活，对含核酸1.1齐氏罗非鱼(Coptodonzillii)ND1-tRNA-Ile靶标序列：ND1-tRNA-Ile靶标序列：9ND1-tRNA-Ile靶标序列：ND1-tRNA-Ile靶标序列：ND1-tRNA-Ile靶标序列：AACCAACCTTGGTCACATAAAATCTTCGTGAGCTGGGTTCAGATATGGCTTTTCCTCGTATGAATAATATGAGTTTTTGACTACTTCCACCATATTGATTATTTCTTCCATGATTAGGACTAGGGCTGGGACGGGATGGACAGTGTCCTCTCTCAGGTAACTTAGCTCATGCGGGCCCGGCTGTTGATTGTGCAATTTTTTCTTTACCTGGCTGGTGTTTCTAGTAT3.2玻璃海鞘(CionaintTTACGACCTCGATGTCGGTTTACTTTAACTAATTCTTGTAGAAGAGAATCTAACCAAATTATCAAGTACATGAGCTGGGTTCTGATATAGCTTTTCCTCGGATAAATAATATGAGTTTTTGACTATTACCTCCTTTATTATTAAAAAGTAGATTCTCAGGTTCAGCTAGAGTAAGAACTGGGTGACCTCCTTTATCTGCAAATATCAGACACTCTAATACTAGAGTTGATATAGCTTACATTTAGCTAGAGTTTCCGTTATATACATGCTAACAGAGCTAGTTTTTTTTTAGCATTTATTTTTATGAAATCTTTATTATAAAACTTATTATCGAAAAAGAGCTTGATTAGTAAGAATTGTTTAATTCTTTCAATATTAACTGCTTTTTTAAGATATGTTTTACCTTGAAGACAAATAATG3.3二段海鞘(Didemnumperlucidum)TTACGACCTCGATGTCGGCTTAATATAAATTTTTAAAGCAGAAATTAAAATTGTTCTTTAATTAAAATATTACATGAGCTGGGTTTCGTTTAATTCATACTGTAAGGGCTAGTTTTTTAATACTTTTAATTTATCTTCGAGACTTTATTACAAACGTTATGTTAACACACGAGCTTGATTAATTAGAACTTTATAATAATAAGAACTGCTTTTTTAAGATATGTATTACCTTGAGGACAAATAG3.4皱瘤海鞘(Styelaplicata)TTACGACCTCGATGTCGACTTGTAGTTGTTGCTGAGTCGCAGAAGATTTAGTGTTCACCACTTAGTAATACACGTGAGTTGGGTTTACAGACATAGCTTTTCCTCGATTAAATAATATAAGTTTTTGGCTATTACCGCTTTTTTGTTGATTAGTTCTTTTATTGAGAGTGGGGTGGGTACTAGATGGACGGCCACTAGCTGGAAACCTAGCCCACTCTGGGGGAGCACTAGATTGTGCCCATCTAGCTAGAATTTCTACGGGCGATACATATAAACAGAGCTAGTCTATTTTTATTTTGTATTTTTTTACGAAGGTTATATTATAAGTCATTTATGAATGTTCATACGTGGGGTGTTAGGGTGAGATTTTAAGTATAGTTACTTCTTTTTTTAGGTATGTTTTGCCTTGGGGACAGTTACGACCTCGATGTCGACTTGTACTTTATTTAAATTTGCAGTAAAATTTGTTCACCATTTAATAGTGTACGTGAGTTGGGTTTGACATAGCTTTTCCACGTCTAAATAATATGAGTTTTTGGTTATTGCCTCCTTTTATTAGTAAGCTCCTTTATTGAGAGTGGAGTAGGAAC