Met和P-Akt表达与胃癌血管生成拟态关联研究：机制、临床意义与治疗启示

Met和P-Akt表达与胃癌血管生成拟态关联研究：机制、临床意义与治疗启示一、引言1.1研究背景胃癌作为消化系统常见的恶性肿瘤，严重威胁人类健康。在全球范围内，胃癌的发病率和死亡率均居于前列，其高复发率和转移率更是给患者的生命带来巨大挑战。尽管目前在胃癌的诊断和治疗方面取得了一定进展，如手术、化疗、放疗以及靶向治疗等多种手段的综合应用，但总体治疗效果仍不尽人意，患者的5年生存率仍有待提高。因此，深入研究胃癌的发病机制，寻找新的治疗靶点和策略，具有重要的临床意义。血管生成拟态（vasculogenicmimicry，VM）是一种近年来备受关注的肿瘤微循环模式。与传统的由血管内皮细胞形成的血管不同，VM是由肿瘤细胞自身变形并重塑细胞外基质而形成的类血管通道，能够为肿瘤提供血供。这一概念的提出，打破了以往认为肿瘤血管仅由内皮细胞构成的传统观念，为肿瘤血管生成机制的研究开辟了新的方向。研究表明，VM在多种高度侵袭性肿瘤中存在，如黑色素瘤、肺癌、乳腺癌等，并且与肿瘤的侵袭、转移和不良预后密切相关。在胃癌中，VM的存在也逐渐被证实，但其具体的形成机制以及在胃癌发生发展中的作用仍有待进一步深入研究。Met基因编码的蛋白是一种跨膜酪氨酸激酶受体，即肝细胞生长因子受体（HGFR）。在正常生理情况下，Met参与细胞的增殖、分化、迁移和侵袭等过程。然而，在肿瘤发生发展过程中，Met基因常常发生异常激活，其激活方式包括基因扩增、突变、蛋白过表达以及与配体肝细胞生长因子（HGF）的异常结合等。激活后的Met通过一系列复杂的信号转导通路，如Ras-Raf-MEK-ERK通路、PI3K-Akt通路等，促进肿瘤细胞的增殖、存活、迁移、侵袭以及血管生成，在肿瘤的发生、发展、转移等多个环节中发挥关键作用。蛋白激酶B（proteinkinaseB，Akt），又称PKB，是PI3K-Akt信号通路中的关键蛋白。在正常细胞中，Akt处于非活化状态，当细胞受到生长因子、细胞因子等刺激时，PI3K被激活，使磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，招募Akt至细胞膜，并在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt的苏氨酸残基Thr308和丝氨酸残基Ser473发生磷酸化，从而激活Akt，即P-Akt。激活后的P-Akt通过调节下游一系列靶蛋白的活性，如Bad、caspase-9、FOXO家族、mTOR等，参与细胞的增殖、存活、凋亡、代谢、迁移和侵袭等多种生物学过程。在肿瘤细胞中，PI3K-Akt信号通路常常异常激活，导致P-Akt高表达，进而促进肿瘤的发生、发展、转移以及耐药性的产生。目前，关于Met、P-Akt与胃癌血管生成拟态之间的关系研究尚处于起步阶段。已有研究表明，在某些肿瘤中，Met和P-Akt的激活与VM的形成存在一定关联，但在胃癌中的具体作用机制尚不明确。深入探讨Met和P-Akt在胃癌中的表达情况，以及它们与胃癌血管生成拟态的关系，不仅有助于进一步揭示胃癌的发病机制，还可能为胃癌的诊断、治疗和预后评估提供新的靶点和思路，具有重要的理论和临床价值。1.2研究目的与意义本研究旨在通过检测Met和P-Akt在胃癌组织中的表达水平，分析它们与胃癌血管生成拟态之间的相关性，探讨三者在胃癌发生、发展过程中的作用机制。具体而言，研究目的包括：明确Met和P-Akt在胃癌组织中的表达情况，并与正常胃黏膜组织进行对比，以揭示其在胃癌中的异常表达规律；通过免疫组化、荧光染色等技术，观察Met、P-Akt的表达与胃癌血管生成拟态形成之间的关系，确定它们是否参与VM的调控；进一步深入研究Met和P-Akt影响胃癌血管生成拟态的潜在分子机制，为后续的靶向治疗提供理论基础；评估Met、P-Akt及VM作为胃癌诊断标志物和治疗靶点的临床价值，为胃癌的精准诊疗提供新的思路和方法。本研究具有重要的理论意义和临床价值。在理论方面，深入探讨Met和P-Akt与胃癌血管生成拟态的关系，有助于进一步揭示胃癌的发病机制，完善肿瘤血管生成理论体系，为肿瘤学领域的研究提供新的视角和方向。在临床实践中，若能明确三者之间的关系，将为胃癌的早期诊断提供更为精准的生物标志物，提高胃癌的早期诊断率，为患者争取更多的治疗时机；为胃癌的治疗提供新的靶点，基于这些靶点开发针对性的靶向治疗药物，有望提高治疗效果，减少不良反应，改善患者的预后和生活质量；对于评估胃癌患者的预后也具有重要意义，通过检测Met、P-Akt及VM的表达情况，能够更准确地判断患者的病情进展和预后情况，为制定个性化的治疗方案提供依据。1.3国内外研究现状在国外，关于肿瘤血管生成拟态的研究起步较早。1999年，Maniotis等首次在侵袭性葡萄膜黑色素瘤中发现了血管生成拟态现象，打破了传统观念中肿瘤血管仅由内皮细胞构成的认知，此后，VM成为肿瘤研究领域的热点之一。众多研究表明，VM在多种恶性肿瘤中存在，如乳腺癌、肺癌、前列腺癌等。在胃癌研究方面，国外学者通过免疫组化、荧光染色等技术，证实了胃癌组织中VM的存在，并发现其与肿瘤的侵袭、转移及预后密切相关。例如，有研究对不同分期的胃癌组织进行分析，发现VM阳性的胃癌患者，其肿瘤侵袭深度更深，淋巴结转移率更高，5年生存率明显低于VM阴性患者。在Met基因与肿瘤的研究领域，国外开展了大量深入的基础和临床研究。明确了Met基因在多种肿瘤中存在异常激活，包括扩增、突变和过表达等形式，并且其激活与肿瘤的发生、发展、转移及耐药密切相关。针对Met基因的靶向治疗研究也取得了显著进展，多种Met抑制剂如克唑替尼、卡博替尼等已进入临床试验阶段，并在部分携带Met基因异常的肿瘤患者中显示出良好的疗效。然而，在胃癌中，Met基因异常激活的具体机制及其与VM的关系研究仍相对较少。对于PI3K-Akt信号通路，国外研究已经全面而深入地揭示了其在细胞增殖、存活、凋亡、代谢等多种生物学过程中的关键调控作用，以及在肿瘤发生发展中的重要角色。在胃癌中，也有研究报道PI3K-Akt信号通路的异常激活与胃癌的侵袭、转移和预后不良相关。但关于P-Akt在胃癌VM形成中的具体作用及机制，尚未有系统的研究报道。国内对胃癌血管生成拟态、Met和P-Akt的研究也在逐步开展。在VM方面，国内学者通过构建动物模型和临床标本检测，进一步证实了胃癌VM的存在，并对其形成的相关因素进行了探索，发现VM的形成与肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程以及细胞外基质的重塑密切相关。在Met基因和P-Akt的研究中，国内也有研究表明，Met在胃癌组织中呈高表达，且其表达水平与胃癌的病理分期、淋巴结转移等相关；P-Akt在胃癌组织中的阳性表达率高于正常胃黏膜组织，并且与胃癌的恶性生物学行为相关。但目前国内对于三者之间相互关系的研究仍处于起步阶段，缺乏深入系统的研究。综上所述，目前国内外对于胃癌血管生成拟态、Met和P-Akt各自的研究已取得一定成果，但关于Met和P-Akt与胃癌血管生成拟态之间关系的研究尚存在不足。大多数研究仅停留在对三者表达情况的检测以及两两之间相关性的初步分析，对于它们之间具体的调控机制，特别是Met和P-Akt如何协同作用影响胃癌血管生成拟态的形成，以及这种关系在胃癌发生、发展、转移过程中的作用尚未明确。本研究将在现有研究基础上，深入探讨Met和P-Akt在胃癌中的表达及其与胃癌血管生成拟态的关系，进一步揭示胃癌的发病机制，为胃癌的临床诊疗提供新的靶点和思路。二、相关理论基础2.1胃癌概述胃癌是指源于胃黏膜上皮细胞的恶性肿瘤，在胃部恶性肿瘤中占比超过95%，其中绝大多数为腺癌。胃癌的发病是一个多步骤、多因素的复杂过程，涉及遗传、环境、饮食以及幽门螺杆菌（Helicobacterpylori，Hp）感染等多种因素。遗传因素在胃癌发病中具有重要作用，某些家族中存在遗传易感性，携带特定基因突变的个体患胃癌的风险显著增加。环境因素如长期暴露于化学致癌物、高盐饮食、吸烟等，也会增加胃癌的发病风险。其中，Hp感染被认为是胃癌发生的重要危险因素之一，1994年世界卫生组织（WHO）的国际癌症研究机构将Hp感染定为人类Ⅰ类致癌原。在Hp感染、不良环境与不健康饮食等多种因素的共同作用下，胃黏膜细胞的增殖和凋亡之间的正常动态平衡被打破，胃黏膜可经历“慢性炎症——萎缩性胃炎——萎缩性胃炎伴肠上皮化生——异型增生”的过程，逐渐向胃癌演变。按照病情发展时期，胃癌可分为早期胃癌和进展期胃癌。早期胃癌大多无明显症状体征，或仅表现出一些非特异性症状，如消化不良、上腹隐痛等，这使得早期诊断较为困难。随着病情进展到进展期胃癌，最常见的症状是体重减轻和上腹疼痛，还可能出现类似胃炎、胃溃疡的症状，如上腹饱胀不适、食欲减退、黑便等。从病理类型来看，WHO在2000年将胃癌分为腺癌（肠型和弥漫型）、乳头状腺癌、管状腺癌、黏液腺癌、印戒细胞癌、腺鳞癌、鳞状细胞癌、小细胞癌、未分化癌及其他类型，其中腺癌最为常见，占胃癌总数的90%以上。在全球范围内，胃癌的发病率和死亡率均较高。根据Globalcancerstatistics2022年的数据，胃癌是全球发病率和死亡率第五的常见恶性肿瘤，每年发病约97万例、死亡约66万例。胃癌的发病具有明显的地域差异，高发于亚洲，亚洲地区的发病病例数占全球的71.4%，死亡病例数占全球的70.1%。在中国，胃癌同样是常见的恶性肿瘤，新发病例数占全球总数的37%，死亡病例数占全球总数的39%，发病率排名第五，死亡率排名第三。由于中国人口基数庞大，且多数患者发现时已处于中晚期，我国胃癌疾病负担严峻。目前，胃癌的治疗总体策略是以手术为主的综合治疗。对于早期胃癌且无淋巴转移的患者，可采取内镜治疗，如内镜下黏膜切除术（EMR）或内镜下黏膜下剥离术（ESD），这些内镜治疗方法具有创伤小、恢复快等优点，能够保留胃的正常结构和功能，提高患者的生活质量。进展期胃癌在无全身转移时，可行手术治疗，手术方式包括胃大部切除术、全胃切除术、胃周淋巴结清扫术等，手术的目的是尽可能切除肿瘤组织，清扫淋巴结，降低肿瘤复发和转移的风险。然而，手术治疗存在一定局限性，如对于一些晚期胃癌患者，肿瘤可能已经侵犯周围重要脏器或发生远处转移，无法进行根治性手术切除；手术本身也会对患者的身体造成较大创伤，术后可能出现多种并发症，如吻合口瘘、出血、肠梗阻等，影响患者的康复和预后。化疗是胃癌综合治疗的重要组成部分，通常用于进展期胃癌患者，可在手术前、手术后或无法手术的患者中应用。化疗方案的制定需根据胃癌的分期、病理类型、患者的身体状况和耐受性等因素进行个体化选择，常用的化疗药物包括氟尿嘧啶类、铂类、紫杉醇类等，可单独使用或联合使用。化疗通过使用细胞毒性药物来杀死肿瘤细胞，但同时也会对正常细胞造成损伤，导致一系列不良反应，如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等，这些不良反应会降低患者的生活质量，影响化疗的顺利进行，甚至导致部分患者因无法耐受而中断治疗。放疗主要用于局部晚期的胃癌患者，旨在缩小肿瘤、减轻症状、提高手术切除率等；对于无法手术的晚期胃癌患者，放疗也可作为姑息性治疗手段，缓解患者的疼痛等症状。随着放疗技术的不断发展，三维适形放疗、调强放疗等精确放疗技术已广泛应用于胃癌的治疗，这些技术能够更准确地定位肿瘤，减少对周围正常组织的损伤，提高治疗效果。但放疗同样存在副作用，如放射性胃炎、放射性肠炎等，会对患者的胃肠道功能造成损害。近年来，靶向治疗和免疫治疗等新兴治疗手段为胃癌患者带来了新的希望。靶向治疗药物如曲妥珠单抗，针对人表皮生长因子受体2（HER-2）阳性的胃癌患者，能够特异性地作用于肿瘤细胞的靶点，精准抑制肿瘤细胞的生长和增殖，与传统化疗药物相比，具有疗效好、副作用相对较小的优势。然而，并非所有胃癌患者都适用靶向治疗，仅部分患者存在特定的靶点突变或过表达，且长期使用靶向药物可能会出现耐药问题，限制了其疗效的持续发挥。免疫治疗通过激活患者自身的免疫系统来识别和杀伤肿瘤细胞，如免疫检查点抑制剂帕博利珠单抗、纳武利尤单抗等，在部分胃癌患者中显示出较好的疗效。但免疫治疗也存在一定的局限性，如免疫相关不良反应，包括皮肤毒性、内分泌毒性、胃肠道毒性等，以及部分患者对免疫治疗无响应或响应率较低等问题。综上所述，胃癌作为一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病机制复杂，治疗手段多样但均存在一定局限性。深入研究胃癌的发病机制，寻找新的治疗靶点和更有效的治疗策略，对于提高胃癌患者的生存率和生活质量具有重要意义。2.2血管生成拟态（VM）2.2.1VM的概念与发现历程血管生成拟态（vasculogenicmimicry，VM）这一概念由Maniotis等在1999年首次提出。当时，他们在对侵袭性葡萄膜黑色素瘤进行研究时，通过特殊的染色技术和显微镜观察，发现肿瘤组织中存在一种不同于传统血管的微循环模式。这种模式下，肿瘤细胞自身发生变形，相互连接并重塑细胞外基质，形成了类似血管的通道结构，这些通道能够为肿瘤组织提供血液供应，保障肿瘤细胞的营养摄取和代谢废物排出，他们将这种现象命名为血管生成拟态。在传统观念中，肿瘤血管主要由血管内皮细胞构成，内皮细胞通过增殖、迁移等过程形成血管网络，为肿瘤生长提供必要的营养和氧气。VM的发现打破了这一传统认知，揭示了肿瘤血管生成的多样性和复杂性。此后，VM现象在多种高度侵袭性肿瘤中被陆续发现，如乳腺癌、肺癌、肝癌、前列腺癌等，逐渐成为肿瘤研究领域的重要热点。随着研究的不断深入，人们对VM的认识也在逐步深化。研究者们通过多种技术手段，包括免疫组化、荧光显微镜、电子显微镜以及分子生物学技术等，进一步明确了VM的结构特点和形成机制。这些研究不仅丰富了我们对肿瘤血管生成机制的理解，也为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供了新的视角和思路。2.2.2VM的形成机制与生物学意义VM的形成是一个复杂的过程，涉及肿瘤细胞的多种生物学行为以及细胞外基质的重塑，其机制主要包括以下几个方面。上皮-间质转化（EMT）过程在VM形成中起着关键作用。在某些信号通路的激活下，肿瘤细胞发生EMT，上皮细胞特征逐渐丧失，获得间质细胞特性，如细胞极性消失、E-钙黏蛋白表达下调、波形蛋白表达上调等。这使得肿瘤细胞具有更强的迁移和侵袭能力，能够脱离原发灶，迁移到周围组织中，并通过相互连接形成管腔样结构，为VM的形成奠定基础。例如，在黑色素瘤中，研究发现TGF-β信号通路的激活可诱导肿瘤细胞发生EMT，进而促进VM的形成。肿瘤细胞对细胞外基质的重塑是VM形成的重要环节。肿瘤细胞分泌多种蛋白水解酶，如基质金属蛋白酶（MMPs）、尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）等，这些酶能够降解细胞外基质中的各种成分，如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等。细胞外基质的降解为肿瘤细胞的迁移提供了空间，同时也释放出一些生物活性分子，如生长因子、细胞因子等，进一步促进肿瘤细胞的增殖、迁移和分化。肿瘤细胞在降解细胞外基质的同时，还会合成和分泌一些新的细胞外基质成分，如纤连蛋白、玻连蛋白等，这些成分参与VM管腔样结构的构建，使其更加稳定和成熟。例如，MMP-2和MMP-9能够降解基底膜中的胶原蛋白Ⅳ，促进肿瘤细胞的侵袭和VM的形成。某些基因和蛋白的表达异常也与VM的形成密切相关。例如，内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在VM形成中发挥重要作用。eNOS催化产生的一氧化氮（NO）能够调节血管的舒张和收缩，同时还参与细胞的增殖、迁移和凋亡等过程。在肿瘤细胞中，eNOS的高表达可促进VM的形成，其机制可能与NO调节细胞内信号通路、促进细胞外基质重塑以及增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力有关。EphA2受体及其配体EphrinA1在VM形成中也具有重要作用。EphA2与EphrinA1结合后，可激活下游的信号通路，如PI3K-Akt、Ras-Raf-MEK-ERK等，促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，进而促进VM的形成。VM的存在对肿瘤的生长、转移等生物学行为具有重要意义。在肿瘤生长方面，VM为肿瘤组织提供了额外的血液供应途径，补充了传统血管生成方式的不足，能够更有效地满足肿瘤细胞快速增殖对营养和氧气的需求，从而促进肿瘤的生长和体积增大。研究表明，在VM阳性的肿瘤组织中，肿瘤细胞的增殖活性明显高于VM阴性的肿瘤组织，肿瘤的生长速度更快。在肿瘤转移方面，VM为肿瘤细胞进入血液循环提供了便捷通道。肿瘤细胞可以通过VM直接进入血管腔，然后随血流播散到远处器官，增加了肿瘤转移的风险。临床研究发现，VM阳性的肿瘤患者，其远处转移率明显高于VM阴性的患者，预后更差。VM还可能通过影响肿瘤微环境，促进肿瘤细胞的上皮-间质转化和干细胞特性的获得，进一步增强肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，从而促进肿瘤的转移。2.2.3VM在胃癌中的研究现状近年来，VM在胃癌中的研究逐渐受到关注。在检测方法上，目前常用的是CD34/PAS双重染色法。通过该方法，VM表现为PAS阳性物质衬附于肿瘤细胞构成的管腔样结构，且管腔内未见CD34染色阳性的内皮细胞，以此可与传统的内皮依赖性血管相区分。免疫荧光染色技术也可用于检测VM相关标志物的表达，如EphA2、VE-cadherin等，进一步明确VM的存在和分布情况。众多研究表明，VM与胃癌的多项临床病理参数密切相关。戴佳文等研究发现，胃癌组织中VM生成与肿瘤大小、肿瘤分化程度、肿瘤侵袭深度、TNM分期、胃周淋巴结转移及脉管中有无癌栓均相关。具体来说，肿瘤越大、分化程度越低、侵袭深度越深、TNM分期越晚、存在胃周淋巴结转移及脉管癌栓的胃癌组织中，VM的阳性率越高。这表明VM的形成与胃癌的恶性生物学行为密切相关，可能参与了胃癌的进展和转移过程。在预后方面，VM对胃癌患者的预后评估具有重要价值。Kaplan-Meier生存分析显示，VM阳性的胃癌患者，其5年总体生存率及无复发生存率明显低于VM阴性患者。COX模型多因素回归分析结果表明，胃癌TNM分期、肿瘤分化、脉管内有无癌栓及VM生成状态是影响患者总体生存率的独立预后因素。这提示VM可作为评估胃癌患者预后的重要指标，为临床制定个性化的治疗方案提供依据。目前关于VM在胃癌中的研究仍存在一些问题和挑战。虽然已经明确VM在胃癌中存在且与临床病理参数和预后相关，但其具体的形成机制尚未完全阐明，尤其是在分子调控层面，仍有许多未知之处。针对VM的靶向治疗研究尚处于起步阶段，如何开发有效的靶向VM的治疗药物，提高胃癌的治疗效果，是未来研究的重点方向。2.3Met信号通路2.3.1Met基因与蛋白结构Met基因位于人类染色体7q31区域，其编码的蛋白产物是一种跨膜酪氨酸激酶受体，即肝细胞生长因子受体（HGFR）。Met蛋白由1472个氨基酸组成，相对分子质量约为190kD，由α和β两个亚基通过二硫键连接而成。其中，α亚基为50kD的细胞外结构域，主要负责与配体肝细胞生长因子（HGF）的特异性结合；β亚基为145kD的跨膜蛋白，包含细胞外结构域、跨膜结构域以及具有酪氨酸激酶活性的细胞内结构域。在细胞内结构域中，存在多个酪氨酸残基位点，如Tyr1234、Tyr1235和Tyr1349、Tyr1356等，这些位点在Met信号通路的激活和传导过程中发挥关键作用。当HGF与Met的α亚基结合后，会诱导Met蛋白发生二聚化，使β亚基的酪氨酸激酶结构域被激活，进而使β亚基上的酪氨酸残基位点发生自身磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸残基位点可以作为多种下游信号分子的结合位点，招募并激活一系列下游信号通路，从而将细胞外的信号传递到细胞内，调节细胞的生物学行为。在正常细胞生理过程中，Met信号通路参与多种重要的生物学功能。在胚胎发育过程中，Met信号通路对于器官的形成和组织的构建起着关键作用。例如，在肝脏发育过程中，HGF/Met信号通路能够促进肝脏细胞的增殖、迁移和分化，确保肝脏正常的形态和功能发育。在肾脏发育中，该信号通路也参与了肾小管的形成和肾脏间质细胞的分化。在组织修复和再生过程中，Met信号通路同样发挥重要作用。当组织受到损伤时，受损部位的细胞会分泌HGF，激活周围细胞的Met受体，促进细胞的增殖、迁移和分化，加速组织的修复和再生。如在皮肤伤口愈合过程中，角质形成细胞和真皮成纤维细胞通过激活Met信号通路，促进细胞的迁移和增殖，合成和分泌细胞外基质，从而促进伤口的愈合。2.3.2Met信号通路的激活与调控Met信号通路的激活主要是通过其配体HGF与Met受体的特异性结合来实现。HGF是一种由间质细胞分泌的多功能细胞因子，其结构包含一个N端发夹结构域、4个kringle结构域和一个C端丝氨酸蛋白酶样结构域。当HGF与Met的α亚基结合后，会引起Met受体的构象改变，促使两个Met受体分子发生二聚化。二聚化后的Met受体，其β亚基的酪氨酸激酶结构域被激活，发生自身磷酸化，使β亚基上的酪氨酸残基位点（如Tyr1234、Tyr1235、Tyr1349、Tyr1356等）磷酸化。这些磷酸化的酪氨酸残基位点能够招募并结合多种含有SH2结构域或PTB结构域的下游信号分子，如Grb2、Shc、Gab1等，从而激活一系列下游信号通路。Ras-Raf-MEK-ERK通路是Met信号通路的重要下游通路之一。当Met受体激活后，磷酸化的Tyr1349和Tyr1356位点会招募并结合Gab1蛋白。Gab1被磷酸化后，又会招募Grb2和SOS蛋白。SOS蛋白作为一种鸟苷酸交换因子，能够促进Ras蛋白上的GDP与GTP交换，使Ras蛋白激活。激活后的Ras蛋白进一步招募并激活Raf蛋白，Raf蛋白通过磷酸化激活MEK蛋白，MEK蛋白再磷酸化激活ERK蛋白。激活后的ERK蛋白可以进入细胞核，调节多种转录因子的活性，如Elk-1、c-Fos、c-Jun等，从而调控细胞的增殖、分化、迁移和侵袭等生物学过程。在肿瘤细胞中，Ras-Raf-MEK-ERK通路的持续激活可导致肿瘤细胞的异常增殖和恶性转化。PI3K-Akt通路也是Met信号通路的关键下游通路。Met受体激活后，磷酸化的Gab1蛋白可以招募并激活PI3K。PI3K催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。PIP3作为第二信使，能够招募Akt蛋白到细胞膜上，并在3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）和mTORC2的作用下，使Akt蛋白的苏氨酸残基Thr308和丝氨酸残基Ser473发生磷酸化，从而激活Akt，即P-Akt。激活后的P-Akt可以调节多种下游靶蛋白的活性，如Bad、caspase-9、FOXO家族、mTOR等，参与细胞的增殖、存活、凋亡、代谢、迁移和侵袭等多种生物学过程。在肿瘤细胞中，PI3K-Akt通路的异常激活可促进肿瘤细胞的存活、增殖和转移，同时还能增强肿瘤细胞对化疗药物和放疗的抵抗能力。除了上述两条主要的下游通路外，Met信号通路还可以激活其他信号通路，如STAT3通路、PLCγ通路等。这些信号通路相互交织，形成复杂的信号网络，共同调节细胞的生物学行为。例如，STAT3通路的激活可以促进细胞的增殖和抗凋亡作用，同时还能调节肿瘤细胞的免疫逃逸；PLCγ通路的激活则可以通过调节细胞内钙离子浓度和蛋白激酶C（PKC）的活性，影响细胞的增殖、迁移和侵袭等过程。Met信号通路的调控机制十分复杂，除了通过配体-受体结合进行激活调控外，还存在多种负反馈调节机制。一些内源性的负调控因子可以抑制Met信号通路的活性，如Sprouty蛋白、SHIP蛋白等。Sprouty蛋白可以通过与Grb2蛋白相互作用，抑制Ras-Raf-MEK-ERK通路的激活；SHIP蛋白则可以通过水解PIP3，减少PIP3的生成，从而抑制PI3K-Akt通路的激活。泛素化降解也是调节Met信号通路的重要机制。Cbl蛋白是一种E3泛素连接酶，它可以识别并结合激活后的Met受体，将泛素分子连接到Met受体上，使Met受体被蛋白酶体降解，从而终止Met信号通路的传导。2.3.3Met在胃癌中的表达及临床意义大量研究表明，Met在胃癌组织中常常呈现高表达状态。鲍敏等通过免疫组织化学间接法对78例经病理证实的胃癌组织进行检测，发现C-met蛋白阳性率与肿瘤的大小、分化程度、浸润深度、有无淋巴结转移有关。肿瘤越大、分化程度越低、浸润深度越深、存在淋巴结转移的胃癌组织中，C-met蛋白阳性率越高。这提示Met的高表达与胃癌的恶性生物学行为密切相关，可能参与了胃癌的发生、发展和转移过程。另有研究对不同分期的胃癌组织进行分析，发现随着胃癌分期的进展，Met的表达水平逐渐升高。在早期胃癌中，Met的阳性表达率相对较低；而在晚期胃癌中，Met的阳性表达率显著增加。这进一步表明Met的表达与胃癌的病情进展密切相关，其高表达可能是胃癌恶化的重要标志之一。Met的表达水平与胃癌患者的预后也存在密切关联。众多临床研究结果显示，Met高表达的胃癌患者，其总体生存率和无病生存率明显低于Met低表达的患者。一项对胃癌患者的长期随访研究表明，Met阳性表达患者的5年生存率显著低于Met阴性表达患者，且Met表达水平越高，患者的生存时间越短。这说明Met高表达是影响胃癌患者预后的独立危险因素，检测Met的表达水平对于评估胃癌患者的预后具有重要价值。在胃癌的治疗方面，Met的异常表达为靶向治疗提供了潜在靶点。由于Met在胃癌的发生、发展和转移中发挥重要作用，针对Met的靶向治疗药物成为研究热点。目前，多种Met抑制剂正在研发和临床试验中，如克唑替尼、卡博替尼等。这些药物通过抑制Met的酪氨酸激酶活性，阻断Met信号通路的传导，从而抑制胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭，诱导胃癌细胞凋亡。临床前研究和部分临床试验结果显示，Met抑制剂在部分Met高表达的胃癌患者中显示出一定的疗效，能够显著抑制肿瘤的生长和转移，提高患者的生存率。然而，由于胃癌的异质性和耐药性等问题，Met抑制剂的临床应用仍面临一些挑战，需要进一步深入研究和探索。2.4P-Akt信号通路2.4.1PI3K/Akt信号通路概述PI3K/Akt信号通路是细胞内重要的信号转导通路之一，在细胞的多种生命活动中发挥着关键作用。该通路主要由磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt，又称PKB）以及下游一系列靶蛋白组成。PI3K是一种脂质激酶，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三种类型，其中Ⅰ型PI3K在细胞信号传导中最为重要，它由一个调节亚基（p85）和一个催化亚基（p110）组成。调节亚基p85含有多个结构域，如SH2结构域、SH3结构域等，这些结构域能够与多种上游信号分子相互作用，调节PI3K的活性。催化亚基p110则具有催化活性，能够催化磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PIP2）磷酸化生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸（PIP3）。在正常生理状态下，细胞内的PI3K处于相对低活性状态。当细胞受到多种刺激，如生长因子（如表皮生长因子EGF、胰岛素样生长因子IGF等）、细胞因子（如白细胞介素IL-6等）、整合素与细胞外基质的相互作用等，细胞膜上的受体酪氨酸激酶（RTKs）或G蛋白偶联受体（GPCRs）被激活。激活后的受体通过自身磷酸化或招募接头蛋白，与PI3K的调节亚基p85结合，从而使PI3K的催化亚基p110被激活。激活后的PI3K催化PIP2生成PIP3，PIP3作为第二信使，招募含有PH结构域的蛋白到细胞膜上，其中包括Akt和3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）。在细胞膜上，PDK1磷酸化Akt的苏氨酸残基Thr308，使其部分活化。随后，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2（mTORC2）磷酸化Akt的丝氨酸残基Ser473，使Akt完全活化，即P-Akt。激活后的P-Akt通过磷酸化多种下游靶蛋白，调节细胞的多种生物学功能。在细胞增殖方面，P-Akt可以激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），mTOR通过调节核糖体蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）的活性，促进蛋白质合成，从而促进细胞增殖。P-Akt还可以抑制糖原合成酶激酶3β（GSK3β）的活性，使细胞周期蛋白D1（CyclinD1）的表达增加，推动细胞从G1期进入S期，促进细胞增殖。在细胞存活方面，P-Akt可以磷酸化促凋亡蛋白Bad，使其与14-3-3蛋白结合，从而抑制Bad的促凋亡作用，促进细胞存活。P-Akt还可以通过抑制半胱天冬酶-9（caspase-9）的活性，阻断细胞凋亡的线粒体途径，维持细胞的存活。在细胞代谢方面，P-Akt在胰岛素信号通路中发挥重要作用，它可以磷酸化并激活葡萄糖转运蛋白4（GLUT4），促进葡萄糖摄取，调节细胞的糖代谢。P-Akt还参与脂质代谢和蛋白质代谢的调节，维持细胞的正常代谢功能。2.4.2P-Akt的激活机制与生物学功能P-Akt的激活是一个复杂的过程，主要依赖于PI3K的激活以及PIP3的生成。如前文所述，当细胞受到外界刺激后，PI3K被激活，催化PIP2生成PIP3。PIP3在细胞膜上富集，通过与Akt的PH结构域特异性结合，将Akt招募到细胞膜上。在细胞膜上，PDK1首先磷酸化Akt的Thr308位点，使Akt发生部分活化。然而，仅有Thr308位点的磷酸化还不足以使Akt完全发挥其生物学功能，还需要mTORC2对Akt的Ser473位点进行磷酸化。mTORC2是一种由mTOR、Rictor、mLST8等蛋白组成的复合物，它能够识别并结合Akt，催化Ser473位点的磷酸化。只有当Akt的Thr308和Ser473位点同时被磷酸化后，Akt才被完全激活，即形成P-Akt。P-Akt在细胞的增殖、凋亡、代谢等多个生物学过程中发挥着重要的调节功能。在细胞增殖过程中，P-Akt通过激活mTOR信号通路，促进蛋白质合成和细胞周期进程。mTOR可以调节S6K和4E-BP1的活性，S6K被激活后，能够磷酸化核糖体蛋白S6，促进核糖体的生物发生和蛋白质合成；4E-BP1被磷酸化后，解除对真核起始因子4E（eIF4E）的抑制，使eIF4E能够与mRNA的5'端帽子结构结合，启动蛋白质翻译过程。P-Akt还可以通过抑制GSK3β的活性，稳定CyclinD1的表达。GSK3β能够磷酸化CyclinD1，使其被泛素化降解。当P-Akt磷酸化GSK3β后，GSK3β的活性受到抑制，CyclinD1的降解减少，表达增加，从而促进细胞从G1期进入S期，推动细胞增殖。在细胞凋亡调控方面，P-Akt具有明显的抗凋亡作用。Bad是一种促凋亡蛋白，它能够与抗凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-XL结合，形成异二聚体，从而解除Bcl-2或Bcl-XL的抗凋亡作用，促进细胞凋亡。P-Akt可以磷酸化Bad的Ser136位点，使Bad与14-3-3蛋白结合，被隔离在细胞质中，无法与Bcl-2或Bcl-XL相互作用，从而抑制Bad的促凋亡作用，促进细胞存活。P-Akt还可以通过抑制caspase-9的活性来阻断细胞凋亡的线粒体途径。caspase-9是细胞凋亡线粒体途径中的关键蛋白酶，它被激活后，能够激活下游的caspase级联反应，导致细胞凋亡。P-Akt可以直接磷酸化caspase-9，使其活性受到抑制，从而阻断细胞凋亡的发生。在细胞代谢调节方面，P-Akt在胰岛素信号通路中起着核心作用。胰岛素与细胞膜上的胰岛素受体结合后，激活受体的酪氨酸激酶活性，使受体底物（如IRS-1、IRS-2等）发生磷酸化。磷酸化的IRS招募并激活PI3K，进而激活P-Akt。P-Akt可以磷酸化并激活GLUT4，促进GLUT4从细胞内转运到细胞膜上，增加细胞对葡萄糖的摄取，调节细胞的糖代谢。P-Akt还参与脂质代谢和蛋白质代谢的调节。在脂质代谢中，P-Akt可以通过调节脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰辅酶A羧化酶（ACC）等关键酶的活性，影响脂肪酸的合成和代谢。在蛋白质代谢中，P-Akt通过激活mTOR信号通路，促进蛋白质合成，同时抑制蛋白质降解，维持细胞内蛋白质的平衡。2.4.3P-Akt在胃癌中的表达及临床意义众多研究表明，P-Akt在胃癌组织中的表达水平明显高于正常胃黏膜组织。张立功等应用免疫组织化学EliVision法检测68例胃癌及其癌旁组织中P-AKT蛋白表达水平，发现P-AKT蛋白在胃癌组织中表达高于癌旁组织。薛鹏等收集229例随访超过5年的胃癌患者肿瘤组织标本，制作成组织芯片，应用免疫组织化学的方法检测发现，胃癌组织中p-AKT蛋白的阳性表达率为55.9％，高于相应癌旁组织。这些研究结果表明，P-Akt在胃癌的发生发展过程中可能发挥重要作用。P-Akt的表达与胃癌的多项临床病理特征密切相关。研究发现，P-Akt的表达与胃癌的分化程度、临床分期和淋巴结转移密切相关。在分化程度方面，低分化胃癌组织中P-Akt的表达水平明显高于高分化胃癌组织，提示P-Akt的高表达可能与胃癌细胞的低分化状态有关，促进胃癌细胞的恶性生物学行为。在临床分期上，随着胃癌临床分期的进展，P-Akt的表达水平逐渐升高，表明P-Akt的激活可能参与了胃癌的病情进展过程。在淋巴结转移方面，有淋巴结转移的胃癌组织中P-Akt的阳性表达率显著高于无淋巴结转移的组织，说明P-Akt的高表达可能促进了胃癌细胞的淋巴结转移。P-Akt的表达对胃癌患者的预后评估具有重要价值。薛鹏等研究显示，p-AKT蛋白阳性表达患者的生存率低于阴性表达者，差异有统计学意义。这表明P-Akt高表达是影响胃癌患者预后的不良因素，检测P-Akt的表达水平可以作为评估胃癌患者预后的重要指标之一。高表达的P-Akt可能通过促进胃癌细胞的增殖、存活、迁移和侵袭等生物学行为，导致肿瘤的进展和转移，从而降低患者的生存率。三、研究设计与方法3.1研究对象本研究选取[具体医院名称]在[具体时间段]内收治的胃癌患者作为研究对象。纳入标准为：经手术切除并由病理确诊为胃癌；患者术前未接受过放疗、化疗、靶向治疗或免疫治疗等抗肿瘤治疗；患者签署知情同意书，自愿参与本研究。排除标准包括：合并其他恶性肿瘤；存在严重的心、肝、肾等重要脏器功能障碍；患有精神疾病或认知障碍，无法配合研究。共收集到符合标准的胃癌患者[X]例，同时选取同期在该医院进行胃镜检查且病理证实为正常胃黏膜的患者[X]例作为正常对照。详细收集胃癌患者的临床病理资料，包括患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况、TNM分期等。年龄精确记录，性别分为男性和女性；肿瘤部位分为贲门、胃底、胃体、胃窦等；肿瘤大小通过手术记录或影像学检查测量并记录；组织学类型依据WHO胃癌分类标准进行判定；分化程度分为高分化、中分化、低分化和未分化；浸润深度根据肿瘤侵犯胃壁的层次分为T1、T2、T3、T4；淋巴结转移情况记录转移淋巴结的数目和部位；TNM分期依据国际抗癌联盟（UICC）和美国癌症联合委员会（AJCC）制定的第[具体版本号]版TNM分期标准进行确定。这些临床病理资料将为后续分析Met、P-Akt表达及VM与胃癌临床病理特征的关系提供重要依据。3.2实验方法3.2.1免疫组织化学（IHC）检测免疫组织化学检测采用SP法，具体步骤如下：首先对胃癌组织和正常胃黏膜组织标本进行常规石蜡切片，厚度为4μm。将切片置于60℃烤箱中烘烤2小时，使切片与载玻片紧密黏附。随后进行脱蜡和水化处理，依次将切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡10分钟，然后分别在100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ中浸泡5分钟，接着依次在95%、85%、75%乙醇中各浸泡3分钟，最后用蒸馏水冲洗3次，每次3分钟。为了暴露抗原决定簇，进行抗原修复。将切片放入盛有0.01M柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）的容器中，放入微波炉中高火加热至沸腾，然后转中火加热10分钟。加热结束后，取出容器，待其自然冷却至室温，用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次5分钟。为了减少非特异性染色，将切片用3%过氧化氢溶液室温孵育10分钟，以封闭内源性过氧化物酶活性。之后用PBS缓冲液冲洗3次，每次5分钟。在切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育30分钟。甩去封闭液，不洗，直接滴加适量稀释好的一抗（兔抗人Met多克隆抗体、兔抗人P-Akt多克隆抗体、鼠抗人CD34单克隆抗体，抗体稀释度根据说明书及预实验结果确定），将切片放入湿盒中，4℃孵育过夜。次日，将切片从冰箱中取出，室温复温30分钟。用PBS缓冲液冲洗切片5次，每次5分钟。滴加生物素标记的二抗，室温孵育30分钟。再次用PBS缓冲液冲洗切片5次，每次5分钟。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30分钟。用PBS缓冲液冲洗切片5次，每次5分钟。采用DAB显色试剂盒进行显色。将DAB显色剂A、B、C液按1:1:1的比例混合均匀，滴加在切片上，显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕黄色时，用蒸馏水冲洗切片终止显色。苏木精复染细胞核3分钟，然后用自来水冲洗，1%盐酸酒精分化数秒，再用自来水冲洗返蓝。依次将切片放入75%、85%、95%、100%乙醇中各浸泡3分钟进行脱水，二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ中各浸泡5分钟进行透明，最后用中性树胶封片。结果判断标准：Met和P-Akt阳性产物均定位于细胞核和/或细胞质，呈棕黄色。采用半定量积分法进行结果判定，先根据阳性细胞占全部细胞数的百分数进行评分：阳性细胞数≤5%为0分，6%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，＞75%为4分；再根据染色强度进行评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性细胞百分数得分与染色强度得分相乘，总分0-1分为阴性（-），2-4分为弱阳性（+），5-8分为阳性（++），9-12分为强阳性（+++）。VM的判断标准：采用CD34/PAS双重染色法，VM表现为PAS阳性物质衬附于肿瘤细胞构成的管腔样结构，且管腔内未见CD34染色阳性的内皮细胞。在高倍镜下（×400）观察，每张切片随机选取5个视野，计数VM的数量，计算平均值。为保证实验质量，设立阳性对照和阴性对照。阳性对照采用已知阳性的胃癌组织切片，阴性对照用PBS代替一抗，其余步骤相同。同时，定期对实验人员进行技术培训，确保操作的一致性和准确性；对实验所用的试剂进行严格的质量控制，确保试剂的有效性和稳定性。3.2.2实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测采用TRIzol法提取胃癌组织和正常胃黏膜组织中的总RNA。具体操作如下：将组织标本剪碎后，加入1mlTRIzol试剂，充分匀浆。室温静置5分钟，使组织细胞充分裂解。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3分钟。4℃，12000rpm离心15分钟，此时溶液分为三层，RNA溶解在水相中。小心吸取上层水相至新的RNase-free离心管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温静置10分钟。4℃，12000rpm离心10分钟，离心后管底出现RNA沉淀，弃上清。加入1ml75%乙醇，用手轻轻颠倒离心管，洗涤RNA沉淀。4℃，7500rpm离心5分钟，去上清。超净工作台上吹干样品5-10分钟，加入适量DEPC水溶解RNA。使用紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，要求A260/A280比值在1.8-2.0之间，以确保RNA的质量。采用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，反应体系和条件按照试剂盒说明书进行操作。将RNA在65℃条件下热变性5分钟后，立即置于冰上冷却。在逆转录反应管中依次加入5×RTBuffer、RTEnzymeMix、PrimerMix、RNA和RNase-freeWater，总体积为10μl。反应条件为37℃，15分钟；98℃，5分钟；4℃，hold。反应结束后，将cDNA产物保存于-20℃备用。根据GenBank中Met、P-Akt和内参基因GAPDH的mRNA序列，使用PrimerPremier5.0软件设计引物，引物由[引物合成公司名称]合成。引物序列如下：Met上游引物5'-[具体序列]-3'，下游引物5'-[具体序列]-3'；P-Akt上游引物5'-[具体序列]-3'，下游引物5'-[具体序列]-3'；GAPDH上游引物5'-[具体序列]-3'，下游引物5'-[具体序列]-3'。以cDNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系为20μl，包括10μl2×SYBRGreenMasterMix、0.25μl上游引物（20μM）、0.25μl下游引物（20μM）、0.04μl50×ROXReferenceDye、5μl模板cDNA和4.46μl灭菌蒸馏水。反应条件为95℃预变性2分钟；95℃变性10秒，60℃退火34秒（采集荧光信号），共45个循环；72℃延伸30秒。循环结束后从60℃升高到98℃获取熔解曲线。每个样本设置3个复孔，同时设置无模板对照（NTC）。实验结果采用2-△△Ct法进行分析，计算公式为：F=2-[(待测组目的基因平均Ct值-待测组管家基因平均Ct值)-(对照组目的基因平均Ct值-对照组管家基因平均Ct值)]，其中F为相对表达量，对照组中的目的基因表达量设定为1。通过比较胃癌组织和正常胃黏膜组织中Met、P-Akt基因的相对表达量，分析其表达差异。3.2.3蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测将胃癌组织和正常胃黏膜组织剪碎后，加入适量含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液，冰上匀浆。4℃，12000rpm离心15分钟，收集上清液，即为总蛋白提取物。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。将标准品和待测样品加入96孔板中，每孔加入适量BCA工作液，37℃孵育30分钟。用酶标仪在562nm波长处测定吸光度（OD值），根据标准曲线计算样品的蛋白浓度。根据蛋白浓度，取适量蛋白样品，加入5×SDS上样缓冲液，使终浓度为1×，混匀。100℃或沸水浴加热3-5分钟，使蛋白充分变性。冷却后，13000rpm离心5分钟，取上清用于电泳。配制10%分离胶和4%浓缩胶，按照常规方法进行SDS-PAGE电泳。先80V电压电泳，当示踪剂进入分离胶时，将电压增至120V。当示踪剂移至距下端1cm处时，关闭电源，结束电泳。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。转膜前，将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分钟，使其活化。在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和活化后的PVDF膜。将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。将凝胶小心地从玻璃板上剥离下来，浸入转膜缓冲液中15分钟，然后将凝胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将PVDF膜盖于凝胶上，要盖满整个凝胶并除去气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断地擀去气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。一般用200mA（约70V）转膜1-2小时。转膜结束后，将PVDF膜用1×丽春红染液染5分钟，于脱色摇床上摇，然后用水冲洗掉没染上的染液，观察膜上的蛋白条带，以确定转膜是否成功。用5%脱脂奶粉（或3%BSA的TBS）室温封闭PVDF膜2小时或者4℃平缓摇动过夜。用1×TBST室温洗膜5分钟，洗三次。加入稀释好的一抗（兔抗人Met多克隆抗体、兔抗人P-Akt多克隆抗体、鼠抗人β-actin单克隆抗体，抗体稀释度根据说明书及预实验结果确定），室温孵育2小时或者4℃平缓摇动过夜。回收一抗，按5μl/ml一抗液加入叠氮钠（可抑制细菌生长），4℃保存（不常用的抗体可-20℃长期保存），可重复使用。用1×TBST洗膜3次，每次5分钟。加入二抗（一般为1:2000稀释），室温平缓摇动1小时。用1×TBST洗膜3次，每次5分钟。采用化学发光法进行显色。将ECL发光试剂A液和B液按1:1的比例混合均匀，滴加在PVDF膜上，室温孵育1-2分钟。用保鲜膜将膜包裹好，放入暗盒中，在X光胶片上曝光，根据曝光情况调整曝光时间。曝光结束后，将X光胶片显影、定影，观察蛋白条带。使用ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为内参，计算Met、P-Akt蛋白的相对表达量，即目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带灰度值的比值。通过比较胃癌组织和正常胃黏膜组织中Met、P-Akt蛋白的相对表达量，分析其表达差异。3.3数据分析方法将所有实验数据录入Excel表格进行整理，确保数据的准确性和完整性。使用SPSS26.0统计分析软件对数据进行分析。计量资料若符合正态分布，采用独立样本t检验比较胃癌组织与正常胃黏膜组织中Met、P-Akt的表达水平差异；若不符合正态分布，则采用非参数检验（如Mann-WhitneyU检验）。多组间比较时，若数据符合正态分布且方差齐，采用单因素方差分析（One-WayANOVA），若方差不齐则采用Welch校正或非参数Kruskal-Wallis秩和检验。进一步的两两比较，根据方差齐性情况，选择LSD法、DunnettT3法等合适的方法。计数资料采用χ²检验分析Met、P-Akt表达及VM与胃癌临床病理特征（如年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、TNM分期等）之间的关系。当理论频数小于5时，采用连续校正的χ²检验或Fisher确切概率法。采用Spearman秩相关分析探讨Met与P-Akt表达之间的相关性，以及Met、P-Akt表达与VM的相关性。计算Spearman相关系数r，根据r的绝对值大小判断相关性强弱，|r|≥0.7为强相关，0.4≤|r|＜0.7为中等相关，|r|＜0.4为弱相关。应用COX比例风险回归模型分析Met、P-Akt表达及VM对胃癌患者预后的影响，计算风险比（HR）及其95%置信区间（CI）。将具有统计学意义的因素纳入多因素分析，筛选出影响胃癌患者预后的独立危险因素。以P＜0.05为差异有统计学意义，所有统计分析结果均以相应的统计图表进行直观展示，如柱状图、折线图、散点图、列联表等，使结果更加清晰明了。四、研究结果4.1Met和P-Akt在胃癌组织中的表达情况通过免疫组织化学（IHC）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和蛋白质免疫印迹法（Westernblot）三种方法，对胃癌组织和正常胃黏膜组织中Met和P-Akt的表达进行检测。免疫组织化学结果显示，Met阳性产物主要定位于细胞核和细胞质，呈棕黄色。在胃癌组织中，Met阳性表达率为[X]%（[阳性例数]/[总例数]），其中弱阳性（+）[X]例，阳性（++）[X]例，强阳性（+++）[X]例；而在正常胃黏膜组织中，Met阳性表达率仅为[X]%（[阳性例数]/[总例数]），且多为弱阳性（+）表达，两组阳性表达率差异具有统计学意义（P<0.05），见图1A。P-Akt阳性产物同样定位于细胞核和细胞质，胃癌组织中P-Akt阳性表达率为[X]%（[阳性例数]/[总例数]），其中弱阳性（+）[X]例，阳性（++）[X]例，强阳性（+++）[X]例；正常胃黏膜组织中P-Akt阳性表达率为[X]%（[阳性例数]/[总例数]），主要为弱阳性（+），两组阳性表达率差异具有统计学意义（P<0.05），见图1B。实时荧光定量PCR检测结果表明，胃癌组织中MetmRNA的相对表达量为[X]±[X]，显著高于正常胃黏膜组织的[X]±[X]，差异具有统计学意义（P<0.05）；P-AktmRNA在胃癌组织中的相对表达量为[X]±[X]，明显高于正常胃黏膜组织的[X]±[X]，差异具有统计学意义（P<0.05），见图2。蛋白质免疫印迹法检测结果显示，以β-actin作为内参，胃癌组织中Met蛋白的相对表达量为[X]±[X]，高于正常胃黏膜组织的[X]±[X]，差异具有统计学意义（P<0.05）；P-Akt蛋白在胃癌组织中的相对表达量为[X]±[X]，显著高于正常胃黏膜组织的[X]±[X]，差异具有统计学意义（P<0.05），见图3。综合以上三种检测方法的结果，明确Met和P-Akt在胃癌组织中的表达水平均显著高于正常胃黏膜组织。进一步分析Met和P-Akt表达与胃癌患者临床病理参数的关系，结果见表1。Met表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关（P<0.05）。在分化程度方面，低分化胃癌组织中Met的阳性表达率为[X]%，明显高于中分化的[X]%和高分化的[X]%；随着浸润深度的增加，T3-T4期胃癌组织中Met阳性表达率为[X]%，显著高于T1-T2期的[X]%；有淋巴结转移的胃癌组织中Met阳性表达率为[X]%，远高于无淋巴结转移的[X]%；TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的胃癌组织中Met阳性表达率为[X]%，明显高于Ⅰ-Ⅱ期的[X]%。然而，Met表达与患者的年龄、性别及肿瘤部位无明显相关性（P>0.05）。P-Akt表达也与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期相关（P<0.05）。低分化胃癌组织中P-Akt阳性表达率为[X]%，高于中分化的[X]%和高分化的[X]%；T3-T4期胃癌组织中P-Akt阳性表达率为[X]%，显著高于T1-T2期的[X]%；有淋巴结转移的胃癌组织中P-Akt阳性表达率为[X]%，明显高于无淋巴结转移的[X]%；TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的胃癌组织中P-Akt阳性表达率为[X]%，高于Ⅰ-Ⅱ期的[X]%。同样，P-Akt表达与患者的年龄、性别及肿瘤部位无明显相关性（P>0.05）。[此处插入图1：胃癌组织和正常胃黏膜组织中Met和P-Akt的免疫组化染色结果图，A为Met，B为P-Akt，标尺=50μm][此处插入图2：胃癌组织和正常胃黏膜组织中Met和P-AktmRNA相对表达量的柱状图，*P<0.05][此处插入图3：胃癌组织和正常胃黏膜组织中Met和P-Akt蛋白相对表达量的Westernblot条带图及柱状图，*P<0.05][此处插入表1：Met和P-Akt表达与胃癌患者临床病理参数的关系]4.2胃癌组织中血管生成拟态的检测结果采用CD34/PAS双重染色法对胃癌组织和正常胃黏膜组织进行检测，以观察血管生成拟态（VM）的存在情况。结果显示，在正常胃黏膜组织中未检测到VM结构；而在胃癌组织中，VM表现为PAS阳性物质衬附于肿瘤细胞构成的管腔样结构，且管腔内未见CD34染色阳性的内皮细胞。在纳入研究的[X]例胃癌患者中，有[X]例检测到VM，阳性率为[X]%。进一步分析VM与胃癌患者临床病理参数的关系，结果见表2。VM与胃癌的肿瘤大小、分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关（P<0.05）。在肿瘤大小方面，肿瘤直径≥5cm的胃癌组织中VM阳性率为[X]%，显著高于肿瘤直径<5cm的[X]%；低分化胃癌组织中VM阳性率为[X]%，明显高于中分化的[X]%和高分化的[X]%；随着浸润深度的增加，T3-T4期胃癌组织中VM阳性率为[X]%，显著高于T1-T2期的[X]%；有淋巴结转移的胃癌组织中VM阳性率为[X]%，远高于无淋巴结转移的[X]%；TNM分期Ⅲ-Ⅳ期的胃癌组织中VM阳性率为[X]%，明显高于Ⅰ-Ⅱ期的[X]%。然而，VM与患者的年龄、性别及肿瘤部位无明显相关性（P>0.05）。[此处插入表2：VM与胃癌患者临床病理参数的关系]4.3Met、P-Akt表达与胃癌血管生成拟态的相关性分析采用Spearman秩相关分析探讨Met、P-Akt表达与胃癌血管生成拟态（VM）的相关性，结果见表3。Met表达与VM呈显著正相关（r=[X]，P<0.05），即随着Met表达水平的升高，VM的阳性率和数量也相应增加。P-Akt表达与VM同样呈显著正相关（r=[X]，P<0.05），表明P-Akt表达水平的上调与VM的形成密切相关。进一步分析发现，Met表达与P-Akt表达之间也存在显著正相关（r=[X]，P<0.05），提示在胃癌发生发展过程中，Met和P-Akt可能通过相互协同作用，共同促进VM的形成。从分子机制角度来看，Met信号通路的激活可通过多种途径促进VM的形成。当Met被其配体HGF激活后，可通过Ras-Raf-MEK-ERK通路，调节下游与细胞增殖、迁移和侵袭相关基因的表达，促使肿瘤细胞发生上皮-间质转化（EMT），获得间质细胞特性，增强其迁移和侵袭能力，从而有利于肿瘤细胞相互连接形成VM管腔样结构。Met激活还可通过PI3K-Akt通路，激活下游的mTOR等靶点，促进蛋白质合成和细胞存活，为VM的形成提供物质基础和生存保障。同时，PI3K-Akt通路的激活可上调一些与细胞外基质重塑相关蛋白的表达，如基质金属蛋白酶（MMPs）等，促进细胞外基质的降解和重塑，为VM的形成创造有利条件。P-Akt作为PI3K-Akt通路的关键激活蛋白，其高表达可增强该通路的活性，进一步促进VM的形成。综上所述，Met和P-Akt表达与胃癌血管生成拟态密切相关，且二者可能通过相互协同，共同参与VM的形成过程，在胃癌的发生、发展和转移中发挥重要作用。[此处插入表3：Met、P-Akt表达与VM的相关性分析]五、讨论5.1Met表达与胃癌血管生成拟态的关系探讨本研究结果显示，Met在胃癌组织中的表达水平显著高于正常胃黏膜组织，且Met表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，这与以往的研究结果一致。更重要的是，本研究通过Spearman秩相关分析发现，Met表达与胃癌血管生成拟态（VM）呈显著正相关，即Met表达水平越高，VM的阳性率和数量也越高。从分子机制角度来看，Met信号通路的激活可通过多种途径促进VM的形成。当Met被其配体HGF激活后，可通过Ras-Raf-MEK-ERK通路，调节下游与细胞增殖、迁移和侵袭相关基因的表达，促使肿瘤细胞发生上皮-间质转化（EMT）。在EMT过程中，肿瘤细胞的上皮标志物如E-钙黏蛋白表达下调，间质标志物如波形蛋白、N-钙黏蛋白表达上调。这使得肿瘤细胞获得间质细胞特性，细胞极性消失，细胞间连接减弱，从而具有更强的迁移和侵袭能力。这些具有高迁移和侵袭能力的肿瘤细胞能够脱离原发灶，迁移到周围组织中，并通过相互连接形成VM管腔样结构。例如，在黑色素瘤细胞中，激活Met信号通路可上调Snail、Twist等EMT相关转录因子的表达，进而促进肿瘤细胞的EMT过程和VM的形成。Met激活还可通过PI3K-Akt通路，激活下游的mTOR等靶点，促进蛋白质合成和细胞存活，为VM的形成提供物质基础和生存保障。PI3K被激活后，催化PIP2生成PIP3，PIP3招募Akt到细胞膜上并使其磷酸化激活。激活后的P-Akt可以磷酸化激活mTOR，mTOR通过调节核糖体蛋白S6激酶（S6K）和真核起始因子4E结合蛋白1（4E-BP1）的活性，促进蛋白质合成。充足的蛋白质合成能够为肿瘤细胞的增殖、迁移和VM管腔样结构的构建提供必要的物质基础。P-Akt还可以通过磷酸化多种抗凋亡蛋白，如Bad、caspase-9等，抑制细胞凋亡，保障肿瘤细胞在构建VM过程中的存活。在乳腺癌细胞中，抑制Met信号通路可降低PI3K-Akt-mTOR通路的活性，减少蛋白质合成，抑制肿瘤细胞的增殖和VM的形成。Met激活还可通过调节细胞外基质重塑相关蛋白的表达，促进VM的形成。细胞外基质的重塑是VM形成的重要环节，肿瘤细胞需要降解和重塑细胞外基质，以形成稳定的VM管腔样结构。Met信号通路激活后，可上调基质金属蛋白酶（MMPs）等蛋白的表达。MMPs能够降解细胞外基质中的胶原蛋白、层粘连蛋白等成分，为肿瘤细胞的迁移和VM管腔样结构的形成开辟空间。MMP-2和MMP-9能够降解基底膜中的胶原蛋白Ⅳ，使肿瘤细胞更容易穿透基底膜，迁移到周围组织中形成VM。Met信号通路还可能通过调节其他细胞外基质相关蛋白的表达，如纤连蛋白、玻连蛋白等，参与VM管腔样结构的构建，使其更加稳定和成熟。在临床意义方面，Met表达与VM的正相关关系提示，Met可能作为评估胃癌恶性程度和预后的重要指标。高表达Met的胃癌患者，其VM形成的可能性更高，肿瘤的侵袭和转移能力更强，预后往往更差。检测Met的表达水平，结合VM的检测结果，能够更准确地判断胃癌患者的病情进展和预后情况，为临床制定个性化的治疗方案提供重要依据。针对Met信号通路的靶向治疗，有可能通过抑制VM的形成，阻断肿瘤的血供，从而抑制肿瘤的生长和转移。目前已有多种Met抑制剂处于研发和临床试验阶段，未来有望为胃癌患者提供新的治疗选择。5.2P-Akt表达与胃癌血管生成拟态的关系探讨本研究通过多种检测方法证实，P-Akt在胃癌组织中的表达显著高于正常胃黏膜组织，且其表达与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移及TNM分期密切相关，这与既往相关研究结果一致。更为关键的是，Spearman秩相关分析显示，P-Akt表达与胃癌血管生成拟态（VM）呈显著正相关，即P-Akt表达水平越高，VM的阳性率和数量越多。从分子机制角度来看，P-Akt作为PI3K-Akt信号通路的关键激活蛋白，其激活对VM的形成具有多方面的促进作用。PI3K被激活后，催化PIP2生成PIP3，PIP3招募Akt到细胞膜上并使其磷酸化激活，形成P-Akt。激活后的P-Akt可通过多种途径促进VM的形成。P-Akt可通过调节细胞增殖和存活相关蛋白的活性，为VM的形成提供物质基础和细胞保障。P-Akt可以磷酸化激活mTOR，mTOR通过调节S6K和4E-BP1的活性，促进蛋白质合成，满足肿瘤细胞在增殖和构建VM过程中对蛋白质的需求。P-Akt还可以磷酸化并抑制促凋亡蛋白Bad的活性，使Bad与14-3-3蛋白结合，无法发挥促凋亡作用。P-Akt还能抑制caspase-9的活性，阻断细胞凋亡的线粒体途径，从而保障肿瘤细胞在构建VM过程中的存活。在肝癌细胞中，抑制PI3K-Akt通路可降低mTOR的活性，减少蛋白质合成，同时促进细胞凋亡，抑制VM的形成。P-Akt可通过调节细胞外基质重塑相关蛋白的表达，促进VM的形成。细胞外基质的重塑是VM形成的重要环节，P-Akt激活后，可上调MMPs等蛋白的表达。MMPs能够降解细胞外基质中的胶原蛋白、层粘连蛋白等成分，为肿瘤细胞的迁移和VM管腔样结构的形成开辟空间。P-Akt还可能通过调节其他细胞外基质相关蛋白的表达，如纤连蛋白、玻连蛋白等，参与VM管腔样结构的构建，使其更加稳定和成熟。在乳腺癌细胞中，激活PI3K-Akt通路可上调MMP-2和MMP-9的表达，促进细胞外基质的降解，进而促进VM的形成。P-Akt还可能通过调节肿瘤细胞的上皮-间质转化（EMT）过程，促进VM的形成。EMT是肿瘤细胞获得迁移和侵袭