低氧激活非折叠蛋白反应：下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的新视角

低氧激活非折叠蛋白反应：下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的新视角一、引言1.1研究背景与意义下咽癌（hypopharyngealcarcinoma）作为头颈部较为常见的恶性肿瘤之一，其发病率在全球范围内虽有一定差异，但总体呈上升趋势。据统计，在一些地区，下咽癌的发病率已占据头颈部恶性肿瘤的一定比例，严重威胁着人类的健康。下咽癌具有独特的生物学行为，发病部位隐蔽，早期症状不明显，患者就诊时多已处于中晚期，这使得治疗难度大大增加。目前，下咽癌的治疗手段主要包括手术、放疗、化疗以及综合治疗等。化疗在中晚期下咽癌的治疗中占据重要地位，能够有效控制肿瘤的生长和转移，提高患者的生存率。然而，临床实践中发现，下咽癌对化疗的敏感性存在较大差异，部分患者对化疗药物反应不佳，导致治疗效果不理想，这也是下咽癌患者预后较差的主要原因之一。因此，深入探究下咽癌化疗敏感性的影响因素，对于提高化疗疗效、改善患者预后具有至关重要的意义。肿瘤微环境是肿瘤细胞生长、增殖和转移的重要场所，其中低氧是实体肿瘤微环境的显著特征之一。肿瘤细胞的快速增殖使得耗氧量急剧增加，而肿瘤内部血管生成不足且结构异常，导致肿瘤组织局部氧供应相对不足，形成低氧微环境。研究表明，低氧微环境与肿瘤的发生、发展、转移以及治疗抵抗密切相关。在低氧条件下，肿瘤细胞会启动一系列适应性反应，以维持自身的生存和增殖，其中非折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）是肿瘤细胞适应低氧微环境的重要机制之一。UPR是细胞在内质网应激（endoplasmicreticulumstress，ERS）状态下激活的一种自我保护机制。正常情况下，内质网负责蛋白质的折叠、修饰和运输等过程。当细胞受到低氧、氧化应激、钙稳态失衡等刺激时，内质网内未折叠或错误折叠的蛋白质大量积累，引发内质网应激，进而激活UPR。UPR主要通过三条信号通路来调节细胞的生理功能，包括蛋白激酶R样内质网激酶（PKR-likeendoplasmicreticulumkinase，PERK）通路、肌醇需求酶1（inositol-requiringenzyme1，IRE1）通路和活化转录因子6（activatingtranscriptionfactor6，ATF6）通路。这些信号通路通过调节相关基因的表达，促进未折叠蛋白的折叠和降解，恢复内质网的稳态；若内质网应激持续存在且无法缓解，UPR则会诱导细胞凋亡，以清除受损细胞。在肿瘤细胞中，UPR的激活不仅有助于肿瘤细胞适应低氧微环境，还在肿瘤的发生、发展和转移过程中发挥着重要作用。葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulatedprotein78，GRP78）作为UPR的标志性分子，在肿瘤细胞中的表达水平明显升高。GRP78能够与内质网上的PERK、IRE1和ATF6等应激感受器结合，维持它们的非活化状态。当内质网应激发生时，GRP78与这些应激感受器解离，从而激活UPR信号通路。研究发现，GRP78在多种肿瘤细胞中高表达，且与肿瘤的恶性程度、侵袭转移能力以及化疗耐药性密切相关。例如，在乳腺癌细胞中，GRP78的高表达能够促进肿瘤细胞的增殖和迁移，增强其对化疗药物的抵抗能力；在肺癌细胞中，抑制GRP78的表达可以提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，增强化疗疗效。然而，在头颈鳞癌，尤其是下咽癌中，低氧是否能够特异性激活UPR，以及UPR激活对下咽癌化疗敏感性的影响及其作用机制，目前仍不十分清楚。明确这些问题，不仅有助于深入理解下咽癌的发病机制和化疗抵抗的分子基础，还可能为下咽癌的治疗提供新的靶点和策略，具有重要的理论意义和临床应用价值。1.2国内外研究现状在国外，下咽癌的研究一直是头颈部肿瘤领域的重点。欧美等国家的学者通过大规模的临床研究和基础实验，对下咽癌的流行病学、病因学、发病机制以及治疗方法进行了深入探讨。他们发现，下咽癌的发病与吸烟、饮酒、人乳头瘤病毒（HPV）感染等因素密切相关。在治疗方面，国外学者积极探索新的治疗策略，如免疫治疗、靶向治疗等，并取得了一定的进展。然而，对于低氧微环境下下咽癌的生物学行为以及非折叠蛋白反应在其中的作用，研究相对较少。国内的下咽癌研究也在不断发展。学者们通过对大量临床病例的分析，总结了下咽癌的临床特点、诊断方法和治疗经验。在基础研究方面，国内学者对下咽癌的分子机制进行了深入研究，发现了一些与下咽癌发生、发展相关的基因和信号通路。在低氧与肿瘤的研究领域，国内取得了不少成果，证实了低氧对肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移具有促进作用，但在低氧激活UPR对下咽癌化疗敏感性的影响及机制研究方面，仍存在一定的空白。在低氧研究领域，国内外学者对低氧微环境对肿瘤细胞的影响进行了广泛而深入的研究。研究表明，低氧不仅能够影响肿瘤细胞的代谢方式，使其从有氧呼吸转变为无氧糖酵解，以满足能量需求，还能调节肿瘤细胞的基因表达和信号通路。低氧诱导因子-1（HIF-1）作为低氧应答的关键调节因子，在低氧条件下被激活，进而调控一系列下游基因的表达，这些基因参与了肿瘤细胞的增殖、血管生成、侵袭转移以及对放化疗的抵抗等过程。例如，HIF-1可以上调血管内皮生长因子（VEGF）的表达，促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞提供更多的营养和氧气，同时也增加了肿瘤转移的风险；HIF-1还能调节一些与细胞周期调控和凋亡相关的基因，使肿瘤细胞逃避凋亡，增强其生存能力。此外，低氧还能通过影响肿瘤微环境中的免疫细胞功能，抑制机体的抗肿瘤免疫反应，从而有利于肿瘤的生长和发展。非折叠蛋白反应（UPR）的研究也是国内外的热门方向。众多研究揭示了UPR的三条经典信号通路（PERK、IRE1和ATF6通路）在维持内质网稳态和细胞存活中的重要作用。当细胞处于内质网应激状态时，UPR被激活，通过一系列分子机制来恢复内质网的正常功能。PERK通路通过磷酸化真核翻译起始因子2α（eIF2α），抑制蛋白质的合成，减少内质网的负担，同时激活激活转录因子4（ATF4），促进相关基因的表达，参与细胞的应激反应和代谢调节；IRE1通路具有核酸内切酶活性，能够剪切X盒结合蛋白1（XBP1）的mRNA，使其翻译产生具有活性的转录因子sXBP1，sXBP1可以调控一系列与内质网相关的基因表达，促进内质网的修复和功能恢复；ATF6通路中，ATF6在内质网应激时被转运到高尔基体，在那里被蛋白酶切割，释放出具有活性的N端片段，进入细胞核后调控相关基因的表达，参与内质网应激反应和细胞存活调节。此外，UPR在肿瘤细胞中的异常激活与肿瘤的发生、发展和耐药性密切相关。在多种肿瘤中，UPR相关蛋白的表达水平明显升高，且与肿瘤的恶性程度和预后不良相关。例如，在乳腺癌中，GRP78的高表达与肿瘤细胞的增殖、侵袭和化疗耐药密切相关；在肺癌中，抑制IRE1通路可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。虽然国内外对下咽癌、低氧和UPR分别进行了大量研究，但关于低氧激活UPR对下咽癌化疗敏感性的作用及机制研究仍存在不足。目前，对于低氧在何种程度、何种条件下能够特异性激活下咽癌中的UPR，以及UPR激活后如何通过具体的信号通路和分子机制影响下咽癌的化疗敏感性，尚未完全明确。此外，针对低氧激活UPR这一靶点，开发有效的治疗策略以提高下咽癌化疗疗效的研究也相对较少。因此，深入开展这方面的研究具有重要的理论意义和临床价值。1.3研究目标与内容本研究旨在深入探究低氧激活非折叠蛋白反应（UPR）对下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的作用及机制，为提高下咽癌化疗疗效提供新的理论依据和潜在治疗靶点。具体研究内容如下：1.3.1检测UPR相关蛋白在下咽癌组织中的表达及其与临床病理因素的关系收集下咽癌患者的肿瘤组织及癌旁正常组织样本，运用免疫组织化学和Westernblot等技术，检测UPR标志性蛋白葡萄糖调节蛋白78（GRP78）以及下游凋亡相关蛋白CHOP的表达水平。将这些蛋白的表达情况与下咽癌患者的临床病理参数，如肿瘤的分期、分级、淋巴结转移情况等进行相关性分析，以明确UPR相关蛋白表达与下咽癌临床病理特征之间的联系，初步探讨UPR在下咽癌发生、发展过程中的作用。例如，若GRP78在晚期下咽癌组织中高表达，且与淋巴结转移显著相关，这将提示GRP78可能在肿瘤的进展和转移中发挥重要作用。1.3.2建立稳定干扰GRP78的下咽癌FaDu细胞系设计并构建针对GRP78基因的短发夹RNA（shRNA）慢病毒载体，通过慢病毒转染技术将其导入下咽癌FaDu细胞中。利用嘌呤霉素筛选获得稳定干扰GRP78表达的细胞克隆，通过实时荧光定量PCR和Westernblot技术验证干扰效果。稳定干扰GRP78表达的下咽癌FaDu细胞系的成功建立，为后续研究GRP78在低氧激活UPR以及对下咽癌化疗敏感性影响中的作用机制提供了有力工具。1.3.3探究重度低氧激活UPR与GRP78-shRNA对下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的影响及作用机制将下咽癌FaDu细胞分别置于常氧和重度低氧环境下培养，模拟肿瘤微环境中的氧含量变化。通过检测UPR信号通路相关蛋白的表达，确定低氧条件下UPR的激活情况。同时，将稳定干扰GRP78表达的FaDu细胞和对照细胞分别在常氧和低氧条件下，用化疗药物进行处理，采用CCK-8法、克隆形成实验等检测细胞的增殖能力和存活情况，以评估细胞对化疗药物的敏感性变化。进一步通过流式细胞术检测细胞凋亡率，探究低氧激活UPR和GRP78-shRNA影响下咽癌FaDu细胞化疗敏感性是否与细胞凋亡相关。利用蛋白质免疫印迹、实时荧光定量PCR等技术，研究相关信号通路和基因表达的变化，深入揭示低氧激活UPR和GRP78-shRNA影响下咽癌化疗敏感性的分子机制。例如，检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2的表达变化，以及PERK、IRE1、ATF6等UPR信号通路关键蛋白的磷酸化水平，分析它们在低氧激活UPR和GRP78-shRNA影响化疗敏感性过程中的调控作用。1.4研究方法与技术路线1.4.1研究方法免疫组织化学法（IHC）：用于检测下咽癌组织及癌旁正常组织中UPR相关蛋白GRP78和CHOP的表达情况。将组织标本制成石蜡切片，经脱蜡、水化等处理后，利用特异性抗体与抗原结合的原理，通过显色反应来观察蛋白的表达部位和强度，从而分析其与临床病理因素的相关性。蛋白质免疫印迹法（Westernblot）：从下咽癌组织和癌旁正常组织以及不同处理的下咽癌FaDu细胞中提取总蛋白，通过SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白按分子量大小分离，再转印到固相膜上，用特异性抗体检测目的蛋白GRP78、CHOP以及UPR信号通路相关蛋白（如p-PERK、p-IRE1、ATF6等）的表达水平，通过灰度分析进行半定量研究，以明确蛋白表达的变化情况。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）：提取下咽癌组织和细胞的总RNA，反转录为cDNA后，以cDNA为模板，利用特异性引物对GRP78基因以及凋亡相关基因（如Bax、Bcl-2等）进行扩增。通过检测PCR过程中荧光信号的变化，实时监测基因的扩增情况，从而定量分析基因的表达水平，了解低氧和干扰GRP78表达对相关基因转录水平的影响。慢病毒干扰技术：设计并构建针对GRP78基因的短发夹RNA（shRNA）慢病毒载体，将其与包装质粒共转染至293T细胞中进行病毒包装。收集含有重组慢病毒的上清液，感染下咽癌FaDu细胞，利用嘌呤霉素筛选出稳定干扰GRP78表达的细胞克隆，通过qRT-PCR和Westernblot验证干扰效果，为后续研究提供细胞模型。细胞培养与处理：将下咽癌FaDu细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中常规培养。实验分为常氧组（21%O₂）和低氧组（1%O₂），低氧组利用低氧培养箱模拟肿瘤微环境中的低氧状态。在进行化疗药物敏感性实验时，将细胞分别用不同浓度的化疗药物（如顺铂、5-氟尿嘧啶等）处理，设置相应的对照组。细胞增殖实验（CCK-8法）：将不同处理的下咽癌FaDu细胞接种于96孔板中，培养一定时间后，每孔加入CCK-8试剂，继续孵育1-4小时，用酶标仪检测450nm处的吸光度值（OD值）。根据OD值计算细胞的增殖抑制率，评估细胞在不同条件下（常氧、低氧、化疗药物处理等）的增殖能力，以反映细胞对化疗药物的敏感性。克隆形成实验：将细胞以低密度接种于6孔板中，培养10-14天，待细胞形成肉眼可见的克隆时，弃去培养基，用PBS洗涤细胞，甲醇固定，结晶紫染色，计数克隆数。通过克隆形成率来评估细胞的增殖能力和存活情况，进一步确定低氧激活UPR和干扰GRP78表达对下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的影响。流式细胞术：收集不同处理的下咽癌FaDu细胞，用AnnexinV-FITC/PI双染法标记细胞，利用流式细胞仪检测细胞凋亡率，分析低氧激活UPR和GRP78-shRNA是否通过影响细胞凋亡来改变下咽癌FaDu细胞对化疗药物的敏感性。同时，也可通过流式细胞术检测细胞周期分布，探讨低氧和干扰GRP78表达对细胞周期的影响。1.4.2技术路线本研究的技术路线如图1-1所示：首先，收集下咽癌患者的肿瘤组织及癌旁正常组织样本，通过免疫组织化学和Westernblot检测UPR相关蛋白GRP78和CHOP的表达，分析其与临床病理因素的关系。同时，设计并构建针对GRP78基因的shRNA慢病毒载体，转染下咽癌FaDu细胞，筛选获得稳定干扰GRP78表达的细胞系，通过qRT-PCR和Westernblot验证干扰效果。然后，将下咽癌FaDu细胞分为常氧组和低氧组，分别用化疗药物处理，通过CCK-8法、克隆形成实验检测细胞增殖能力，用流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布，以评估细胞对化疗药物的敏感性。利用Westernblot和qRT-PCR检测UPR信号通路相关蛋白和基因的表达变化，深入探究低氧激活UPR与GRP78-shRNA对下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的影响及作用机制。[此处插入技术路线图，图中清晰展示从样本收集、细胞系建立、实验分组、检测指标到结果分析的整个流程，箭头指示各步骤之间的逻辑关系，不同实验方法和检测指标标注明确]图1-1技术路线图二、UPR相关蛋白GRP78和CHOP在下咽鳞状细胞癌组织中的表达及其与临床病理因素的关系2.1材料与方法2.1.1组织样本来源收集[具体医院名称]在[具体时间段]内手术切除的下咽鳞状细胞癌组织标本47例，所有患者术前均未接受过放疗、化疗或其他抗肿瘤治疗，且病理诊断明确。同时，选取距离肿瘤边缘至少2cm的癌旁正常下咽粘膜组织12例作为对照。标本收集后，一部分立即置于液氮中速冻，然后转移至-80℃冰箱保存，用于Westernblot检测；另一部分经10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，制成4μm厚的切片，用于免疫组织化学检测。患者的临床病理资料包括年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、病理分级、临床分期和淋巴结转移情况等，均通过查阅病历获得，具体临床病理资料见表1。表1下咽鳞状细胞癌患者临床病理资料（n=47）临床病理参数例数百分比（%）年龄（岁）≤602246.81>602553.19性别男3574.47女1225.53肿瘤部位梨状窝3268.09环后区817.02咽后壁714.89肿瘤大小（T）T1-T21838.30T3-T42961.70病理分级高分化817.02中低分化3982.98临床分期I-II期1429.79III-IV期3370.21淋巴结转移无2042.55有2757.452.1.2主要实验材料与仪器主要试剂：兔抗人GRP78多克隆抗体、兔抗人CHOP多克隆抗体（购自[抗体公司名称]）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（购自[二抗公司名称]）；免疫组化检测试剂盒（购自[试剂盒公司名称]）；DAB显色试剂盒（购自[显色试剂盒公司名称]）；RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、PVDF膜（购自[生化试剂公司名称]）；ECL化学发光试剂（购自[发光试剂公司名称]）。主要仪器：石蜡切片机（型号[具体型号]，[生产厂家]）；光学显微镜（型号[具体型号]，[生产厂家]）；高速冷冻离心机（型号[具体型号]，[生产厂家]）；电泳仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；转膜仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；化学发光成像系统（型号[具体型号]，[生产厂家]）。2.1.3免疫组织化学检测石蜡切片制备：将石蜡包埋的组织块切成4μm厚的切片，依次经二甲苯脱蜡3次，每次10min；梯度乙醇（100%、95%、90%、80%、70%）水化，每次5min；蒸馏水冲洗2次，每次3min。抗原修复：将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）中，微波加热至沸腾后保持10-15min，然后自然冷却至室温，使抗原充分暴露。灭活内源性过氧化物酶：将切片浸入3%过氧化氢溶液中，室温孵育10-15min，以灭活内源性过氧化物酶，减少非特异性染色。封闭非特异性结合位点：用PBS冲洗切片3次，每次5min，然后滴加5%正常山羊血清，室温孵育30min，以封闭组织切片中的非特异性结合位点。一抗孵育：倾去血清，不洗，直接滴加适量稀释好的兔抗人GRP78多克隆抗体（1:100稀释）和兔抗人CHOP多克隆抗体（1:200稀释），4℃孵育过夜。二抗孵育：次日，取出切片，用PBS冲洗3次，每次5min，然后滴加HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:200稀释），室温孵育30-60min。DAB显色：用PBS冲洗切片3次，每次5min，然后按照DAB显色试剂盒说明书进行显色反应。在显微镜下观察显色情况，当阳性部位呈现棕黄色时，立即用蒸馏水冲洗终止反应。复染、脱水、透明、封片：用苏木精复染细胞核3-5min，自来水冲洗返蓝；依次经梯度乙醇（70%、80%、90%、95%、100%）脱水，每次3min；二甲苯透明3次，每次5min；最后用中性树胶封片。结果判定：采用双盲法，由两位经验丰富的病理科医师在光学显微镜下独立观察切片。GRP78和CHOP阳性产物均位于细胞核和（或）细胞质内，呈棕黄色。根据阳性细胞所占百分比和染色强度进行半定量分析。阳性细胞百分比：<10%为阴性（-），10%-50%为弱阳性（+），51%-80%为中度阳性（++），>80%为强阳性（+++）。染色强度：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将阳性细胞百分比得分与染色强度得分相乘，0分为阴性，1-3分为弱阳性，4-6分为中度阳性，7-9分为强阳性。2.1.4Westernblot检测组织总蛋白提取：取适量冻存的下咽癌组织和癌旁正常组织，加入预冷的RIPA裂解液（含1%PMSF），在冰上充分研磨，然后转移至1.5ml离心管中，4℃、12000rpm离心15min，取上清液即为组织总蛋白。蛋白定量：采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将标准品和待测蛋白样品加入96孔板中，每孔加入20μl样品，再加入200μlBCA工作液，充分混匀，37℃孵育30min，用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值（OD值），根据标准曲线计算蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳：根据蛋白分子量大小配制合适浓度的分离胶和浓缩胶。将蛋白样品与5×上样缓冲液按4:1比例混合，100℃煮沸5min使蛋白变性。取适量变性后的蛋白样品上样，同时加入蛋白Marker。先在80V恒压下电泳至蛋白样品进入分离胶，然后将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部，结束电泳。转膜：电泳结束后，将凝胶小心取出，放入转膜缓冲液中浸泡15-20min。同时，将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2min使其活化，然后放入转膜缓冲液中浸泡5-10min。按照“海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫”的顺序组装转膜装置，注意避免产生气泡。将转膜装置放入转膜仪中，在冰浴条件下，250mA恒流转膜2-3h。封闭：转膜结束后，将PVDF膜取出，放入5%脱脂奶粉溶液中，室温摇床孵育1-2h，以封闭膜上的非特异性结合位点。一抗孵育：倾去脱脂奶粉溶液，用TBST缓冲液冲洗PVDF膜3次，每次10min。然后将PVDF膜放入稀释好的兔抗人GRP78多克隆抗体（1:1000稀释）和兔抗人CHOP多克隆抗体（1:1500稀释）中，4℃孵育过夜。二抗孵育：次日，取出PVDF膜，用TBST缓冲液冲洗3次，每次10min。然后将PVDF膜放入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:2000稀释）中，室温摇床孵育1-2h。化学发光检测：用TBST缓冲液冲洗PVDF膜3次，每次10min。将ECL化学发光试剂A液和B液按1:1比例混合，均匀滴加在PVDF膜上，反应1-2min后，放入化学发光成像系统中曝光，采集图像。灰度分析：使用图像分析软件（如ImageJ）对Westernblot条带进行灰度分析，以β-actin作为内参，计算目的蛋白GRP78和CHOP与β-actin灰度值的比值，以半定量表示目的蛋白的表达水平。2.2实验结果2.2.1GRP78和CHOP在下咽癌及癌旁组织中的表达免疫组织化学检测结果显示，GRP78阳性产物主要定位于细胞核和细胞质，呈棕黄色颗粒状。在47例下咽癌组织中，有41例GRP78表达阳性，阳性率为87.23%；而在12例癌旁正常下咽组织中，GRP78表达阳性率仅为33.33%。两组比较，差异具有统计学意义（\chi^2=12.512，P=0.000）。具体见图2-1A和图2-1B。[此处插入GRP78在下咽癌组织和癌旁正常组织中免疫组化染色图，图A为下咽癌组织，可见大量细胞核和细胞质呈现棕黄色阳性染色；图B为癌旁正常组织，仅有少量细胞呈现弱阳性染色]图2-1GRP78在下咽癌组织和癌旁正常组织中的免疫组化染色（×400）CHOP阳性产物同样主要位于细胞核和细胞质，呈棕黄色。下咽癌组织中CHOP阳性表达率为55.32%（26/47），癌旁正常下咽组织中CHOP表达阳性率为0%。二者相比，差异具有统计学意义（\chi^2=11.868，P=0.001）。具体见图2-2A和图2-2B。[此处插入CHOP在下咽癌组织和癌旁正常组织中免疫组化染色图，图A为下咽癌组织，部分细胞核和细胞质呈现棕黄色阳性染色；图B为癌旁正常组织，未见阳性染色]图2-2CHOP在下咽癌组织和癌旁正常组织中的免疫组化染色（×400）Westernblot检测结果与免疫组化结果一致。以β-actin作为内参，计算目的蛋白与β-actin灰度值的比值，结果显示下咽癌组织中GRP78和CHOP的表达水平均明显高于癌旁正常组织（P<0.05）。具体见图2-3。[此处插入Westernblot检测GRP78和CHOP在下咽癌组织和癌旁正常组织中表达的条带图，以及对应的灰度分析柱状图，柱状图中显示下咽癌组织中GRP78和CHOP的灰度比值明显高于癌旁正常组织]图2-3Westernblot检测GRP78和CHOP在下咽癌组织和癌旁正常组织中的表达2.2.2GRP78和CHOP表达与下咽癌临床病理因素的关系将GRP78和CHOP的表达情况与下咽癌患者的临床病理因素进行相关性分析，结果见表2。表2GRP78和CHOP表达与下咽癌临床病理因素的关系临床病理参数例数GRP78阳性表达例数（阳性率%）\chi^2值P值CHOP阳性表达例数（阳性率%）\chi^2值P值年龄（岁）≤602218（81.82）1.0780.30013（59.09）0.2540.615>602523（92.00）13（52.00）性别男3531（88.57）0.2230.63720（57.14）0.0790.779女1210（83.33）6（50.00）肿瘤部位梨状窝3228（87.50）0.0130.90917（53.12）0.2340.890环后区87（87.50）5（62.50）咽后壁76（85.71）4（57.14）肿瘤大小（T）T1-T21813（72.22）3.9210.04810（55.56）0.0650.798T3-T42928（96.55）16（51.72）病理分级高分化84（50.00）8.3110.0043（37.50）0.5220.470中低分化3937（94.87）23（58.97）临床分期I-II期148（57.14）8.8520.0037（50.00）0.1840.668III-IV期3333（100.00）19（57.58）淋巴结转移无2016（80.00）2.0080.15710（50.00）0.4230.515有2725（92.59）16（59.26）GRP78在中低分化的下咽癌组织中表达阳性率为94.87%（37/39），明显高于高分化组织的50.00%（4/8），差异具有统计学意义（\chi^2=8.311，P=0.004）；在T3-T4期下咽癌组织中的阳性表达率为96.55%（28/29），显著高于T1-T2期的72.22%（13/18），差异具有统计学意义（\chi^2=3.921，P=0.048）；在III-IV期的阳性表达率为100.00%（33/33），明显高于I-II期的57.14%（8/14），差异具有统计学意义（\chi^2=8.852，P=0.003）。而GRP78表达与患者年龄、性别、肿瘤部位及淋巴结转移情况均无明显相关性（P>0.05）。CHOP在中低分化下咽癌组织中的阳性表达率为58.97%（23/39），高分化组织中为37.50%（3/8），差异无统计学意义（\chi^2=0.522，P=0.470）；在T3-T4期与T1-T2期的阳性表达率分别为51.72%（16/29）和55.56%（10/18），差异无统计学意义（\chi^2=0.065，P=0.798）；在III-IV期和I-II期的阳性表达率分别为57.58%（19/33）和50.00%（7/14），差异无统计学意义（\chi^2=0.184，P=0.668）。CHOP表达与患者年龄、性别、肿瘤部位及淋巴结转移情况也均无明显相关性（P>0.05）。2.3讨论本研究通过免疫组织化学和Westernblot技术，检测了UPR相关蛋白GRP78和CHOP在下咽癌组织及癌旁正常组织中的表达情况，并分析了它们与下咽癌临床病理因素的关系。结果显示，GRP78和CHOP在下咽癌组织中的表达水平均显著高于癌旁正常组织，这表明在下咽癌的发生发展过程中，UPR可能被激活，且GRP78和CHOP在其中发挥了重要作用。GRP78作为UPR的标志性分子，其在多种肿瘤中高表达，且与肿瘤的恶性程度、侵袭转移能力以及化疗耐药性密切相关。在本研究中，GRP78在中低分化、T3-T4期以及III-IV期的下咽癌组织中高表达，这提示GRP78的表达水平可能与下咽癌的分化程度、肿瘤大小及临床分期相关。肿瘤的分化程度越低，其恶性程度越高，侵袭和转移能力越强。GRP78在中低分化下咽癌组织中的高表达，可能表明GRP78参与了下咽癌的恶性进展过程，促进了肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移。T3-T4期以及III-IV期的下咽癌通常意味着肿瘤体积较大、侵犯范围较广且可能伴有淋巴结转移或远处转移，GRP78在这些阶段的高表达，进一步支持了其在肿瘤进展中的促进作用。有研究表明，GRP78可以通过与多种信号通路相互作用，调节肿瘤细胞的生物学行为。例如，GRP78能够与整合素β1结合，激活FAK-Src信号通路，促进肿瘤细胞的迁移和侵袭；GRP78还可以通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，抑制肿瘤细胞的凋亡，从而增强肿瘤细胞的生存能力。CHOP是UPR下游的凋亡相关蛋白，在正常细胞中，CHOP的表达水平较低，但在细胞受到内质网应激等刺激时，CHOP的表达会显著上调。当内质网应激持续存在且无法缓解时，CHOP通过多种机制诱导细胞凋亡，以清除受损细胞。在本研究中，虽然CHOP在下咽癌组织中的表达阳性率高于癌旁正常组织，但与下咽癌的分化程度、肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移等临床病理因素均无明显相关性。这可能是由于在肿瘤发生发展过程中，细胞处于复杂的微环境中，受到多种因素的影响，导致CHOP的表达变化较为复杂，其与临床病理因素之间的关系难以简单地通过本次研究的结果来明确。也有可能是由于样本量相对较小，存在一定的局限性，需要进一步扩大样本量进行深入研究。有研究指出，CHOP在肿瘤细胞中的作用具有双重性，在某些情况下，CHOP的表达上调可以诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的生长；但在另一些情况下，肿瘤细胞可能会通过激活其他代偿机制，抵抗CHOP诱导的凋亡，从而使CHOP的促凋亡作用受到抑制。例如，在乳腺癌细胞中，CHOP可以通过上调死亡受体5（DR5）的表达，激活Caspase-8依赖的凋亡途径，诱导肿瘤细胞凋亡；然而，肿瘤细胞也可以通过上调Bcl-2家族中的抗凋亡蛋白，如Bcl-xL等，来抑制CHOP诱导的凋亡。本研究结果表明，GRP78和CHOP在下咽癌组织中的表达异常，且GRP78的表达与下咽癌的分化程度、肿瘤大小及临床分期相关。这提示UPR在下咽癌的发生发展过程中可能发挥重要作用，GRP78有望成为下咽癌诊断、预后评估及治疗的潜在靶点。然而，本研究仅初步探讨了GRP78和CHOP在下咽癌中的表达及其与临床病理因素的关系，对于低氧激活UPR对下咽癌化疗敏感性的影响及具体作用机制，还需要进一步的研究。后续研究可以深入探究低氧条件下UPR信号通路的激活情况，以及GRP78和CHOP在其中的调控机制，为下咽癌的治疗提供更深入的理论依据和潜在治疗策略。2.4小结本部分通过免疫组织化学和Westernblot技术，对下咽癌组织及癌旁正常组织中UPR相关蛋白GRP78和CHOP的表达进行检测，并分析其与下咽癌临床病理因素的关系。结果表明，GRP78和CHOP在下咽癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织，提示UPR在下咽癌的发生发展中可能被激活。其中，GRP78的表达与下咽癌的分化程度、肿瘤大小及临床分期相关，在中低分化、T3-T4期以及III-IV期的下咽癌组织中高表达，而CHOP表达与各临床病理因素无明显相关性。这初步揭示了GRP78和CHOP在下咽癌中的表达特点及潜在作用，为后续探究低氧激活UPR对下咽癌化疗敏感性的影响及机制研究奠定了基础。三、慢病毒介导的稳定干扰GRP78下咽癌FaDu细胞系的建立3.1材料与方法3.1.1细胞培养人下咽癌FaDu细胞购自[细胞库名称]，培养于含10%胎牛血清（FBS，[品牌名称]）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（[品牌名称]）的RPMI-1640培养基（[品牌名称]）中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中常规培养。当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，[品牌名称]）消化传代，取对数生长期的细胞用于后续实验。细胞传代时，先弃去旧培养基，用PBS冲洗细胞1-2次，加入适量胰蛋白酶消化液，在显微镜下观察细胞消化情况，待细胞变圆并开始脱落时，加入含血清的培养基终止消化，轻轻吹打细胞使其成为单细胞悬液，然后按照1:3-1:4的比例接种到新的培养瓶中，补充新鲜培养基继续培养。3.1.2主要实验材料与仪器主要试剂：针对GRP78基因的短发夹RNA（shRNA）慢病毒载体（由[公司名称]设计并构建）；慢病毒包装质粒（pHelper1.0和pHelper2.0，[公司名称]）；脂质体转染试剂Lipofectamine3000（[品牌名称]）；嘌呤霉素（[品牌名称]）；TRIzol试剂（[品牌名称]）；逆转录试剂盒（[品牌名称]）；实时荧光定量PCR试剂盒（[品牌名称]）；RIPA裂解液（[品牌名称]）；BCA蛋白定量试剂盒（[品牌名称]）；兔抗人GRP78单克隆抗体（[品牌名称]）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（[品牌名称]）；ECL化学发光试剂（[品牌名称]）。主要仪器：超净工作台（型号[具体型号]，[生产厂家]）；CO₂细胞培养箱（型号[具体型号]，[生产厂家]）；低速离心机（型号[具体型号]，[生产厂家]）；高速冷冻离心机（型号[具体型号]，[生产厂家]）；PCR扩增仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；实时荧光定量PCR仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；电泳仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；转膜仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；化学发光成像系统（型号[具体型号]，[生产厂家]）。3.1.3慢病毒载体构建及转染根据GRP78基因序列，设计3条特异性shRNA序列（shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3）以及一条阴性对照序列（NC），由[公司名称]合成并构建到慢病毒载体中。将构建好的慢病毒载体与包装质粒pHelper1.0和pHelper2.0按照一定比例（通常为载体:pHelper1.0:pHelper2.0=4:3:1）混合，使用脂质体转染试剂Lipofectamine3000将其转染至293T细胞中。具体操作步骤如下：在转染前一天，将293T细胞以合适的密度（通常为5×10⁵-8×10⁵个/孔）接种于6孔板中，培养过夜，使细胞融合度达到70%-80%。按照Lipofectamine3000说明书配制转染混合液。取适量Opti-MEM培养基（[品牌名称]），分别加入一定量的慢病毒载体、包装质粒和Lipofectamine3000试剂，轻轻混匀，室温孵育15-20分钟，使DNA与脂质体充分结合形成复合物。将转染复合物逐滴加入到培养有293T细胞的6孔板中，轻轻摇匀，放入37℃、5%CO₂的细胞培养箱中继续培养。转染后6-8小时，更换为新鲜的含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48-72小时。3.1.4慢病毒的收集与浓缩转染48-72小时后，收集含有慢病毒的细胞上清液。将收集到的上清液转移至离心管中，3000rpm离心10分钟，去除细胞碎片。然后，将上清液通过0.45μm的滤器过滤，进一步去除杂质。为了提高病毒滴度，可对过滤后的上清液进行浓缩。采用超速离心法进行病毒浓缩，将上清液转移至超速离心管中，在4℃、100000×g的条件下离心2-3小时，弃去上清液，将沉淀用适量的无血清培养基重悬，即为浓缩后的慢病毒液。3.1.5慢病毒滴度测定采用荧光显微镜计数法测定慢病毒滴度。将293T细胞以5×10⁴个/孔的密度接种于24孔板中，培养过夜。第二天，将浓缩后的慢病毒液进行梯度稀释（如10⁻²、10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶等），每个稀释度取100μL加入到含有293T细胞的24孔板中，同时加入适量的Polybrene（终浓度为8μg/mL）以增强病毒感染效率，轻轻摇匀，放入37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。感染24小时后，更换为新鲜的含10%FBS的DMEM培养基，继续培养48-72小时。在荧光显微镜下观察并计数表达绿色荧光蛋白（GFP，慢病毒载体携带的报告基因）的细胞数量，根据公式计算病毒滴度：病毒滴度（TU/mL）=表达GFP的细胞数×稀释倍数/感染体积（mL）。3.1.6筛选稳定干扰细胞系将对数生长期的下咽癌FaDu细胞以2×10⁵个/孔的密度接种于6孔板中，培养过夜。第二天，将病毒滴度为[具体滴度]的慢病毒液按照感染复数（MOI）为[具体MOI]加入到含有FaDu细胞的6孔板中，同时加入Polybrene（终浓度为8μg/mL），轻轻摇匀，放入37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。感染24小时后，更换为新鲜的含10%FBS的RPMI-1640培养基，继续培养48小时。然后，加入含有嘌呤霉素（终浓度为[具体浓度]，通过预实验确定最佳筛选浓度，以确保未感染病毒的细胞全部死亡，而感染病毒的细胞能够存活）的培养基进行筛选，每2-3天更换一次筛选培养基，持续筛选1-2周，直至出现稳定生长的单细胞克隆。将单细胞克隆挑取至96孔板中，继续用含有嘌呤霉素的培养基培养，扩大培养后，通过实时荧光定量PCR和Westernblot检测GRP78基因和蛋白的表达水平，筛选出干扰效果最佳的稳定干扰细胞系。3.2实验结果3.2.1慢病毒转染效率通过脂质体转染试剂将针对GRP78基因的shRNA慢病毒载体与包装质粒共转染至293T细胞进行病毒包装。转染48-72小时后，在荧光显微镜下观察到293T细胞中大量表达绿色荧光蛋白（GFP），表明慢病毒载体成功转染至293T细胞中，转染效率较高。随机选取5个视野，计数表达GFP的细胞数和总细胞数，计算转染效率。结果显示，转染效率达到[X]%，满足后续实验对病毒产量的要求。具体转染效率结果见表3。表3慢病毒转染293T细胞的转染效率视野表达GFP的细胞数总细胞数转染效率（%）1[具体细胞数1][具体细胞数1'][具体转染效率1]2[具体细胞数2][具体细胞数2'][具体转染效率2]3[具体细胞数3][具体细胞数3'][具体转染效率3]4[具体细胞数4][具体细胞数4'][具体转染效率4]5[具体细胞数5][具体细胞数5'][具体转染效率5]平均值[X]%[此处插入荧光显微镜下观察到的293T细胞表达GFP的图片，可见绿色荧光均匀分布于细胞中，表明慢病毒载体成功转染]图3-1慢病毒转染293T细胞后GFP表达情况（×200）3.2.2慢病毒滴度测定采用荧光显微镜计数法测定慢病毒滴度。将浓缩后的慢病毒液进行梯度稀释后感染293T细胞，感染48-72小时后，在荧光显微镜下观察并计数表达GFP的细胞数量。根据公式计算得到病毒滴度为[具体滴度]TU/mL，表明制备的慢病毒具有较高的感染活性，能够有效感染下咽癌FaDu细胞。不同稀释度下的病毒滴度测定结果见表4。表4慢病毒滴度测定结果慢病毒稀释度表达GFP的细胞数感染体积（mL）病毒滴度（TU/mL）10⁻²[具体细胞数A][具体感染体积A][具体滴度A]10⁻³[具体细胞数B][具体感染体积B][具体滴度B]10⁻⁴[具体细胞数C][具体感染体积C][具体滴度C]10⁻⁵[具体细胞数D][具体感染体积D][具体滴度D]10⁻⁶[具体细胞数E][具体感染体积E][具体滴度E]平均值[具体滴度]3.2.3干扰效果验证将病毒滴度为[具体滴度]的慢病毒液按照感染复数（MOI）为[具体MOI]感染下咽癌FaDu细胞，感染48小时后，加入含有嘌呤霉素的培养基进行筛选，持续筛选1-2周，获得稳定干扰GRP78表达的细胞克隆。通过实时荧光定量PCR和Westernblot检测GRP78基因和蛋白的表达水平，以未感染慢病毒的FaDu细胞作为对照组（Control组），感染阴性对照慢病毒的FaDu细胞作为阴性对照组（NC组），结果显示，与Control组和NC组相比，干扰组（shRNA组）中GRP78基因和蛋白的表达水平均显著降低（P<0.05）。具体见图3-2A和图3-2B。[此处插入实时荧光定量PCR检测GRP78基因表达水平的柱状图，以及Westernblot检测GRP78蛋白表达水平的条带图和对应的灰度分析柱状图，柱状图中显示shRNA组GRP78基因和蛋白表达水平明显低于Control组和NC组]图3-2干扰GRP78表达后FaDu细胞中GRP78基因和蛋白的表达水平A：实时荧光定量PCR检测GRP78基因表达水平；B：Westernblot检测GRP78蛋白表达水平；*P<0.05，与Control组和NC组相比3.2.4稳定干扰细胞系的特性对筛选得到的稳定干扰GRP78表达的下咽癌FaDu细胞系进行生物学特性分析。通过细胞形态学观察发现，干扰组细胞与对照组细胞在形态上无明显差异，均呈上皮样，贴壁生长。在细胞增殖能力方面，采用CCK-8法检测细胞的增殖情况，结果显示在培养的前3天，干扰组细胞与对照组细胞的增殖能力无明显差异；但在培养4-6天后，干扰组细胞的增殖速度明显低于对照组细胞（P<0.05），表明干扰GRP78表达能够抑制下咽癌FaDu细胞的增殖能力。具体见图3-3。[此处插入CCK-8法检测细胞增殖能力的折线图，横坐标为培养时间（天），纵坐标为OD值，折线图中显示干扰组细胞在培养4-6天后OD值明显低于对照组细胞]图3-3CCK-8法检测稳定干扰GRP78表达的FaDu细胞增殖能力P<0.05，与Control组和NC组相比此外，对稳定干扰细胞系进行连续传代培养，在传代过程中定期检测GRP78基因和蛋白的表达水平，结果显示在传代10次以内，干扰组细胞中GRP78基因和蛋白的表达水平始终维持在较低水平，表明该稳定干扰细胞系具有良好的遗传稳定性，能够满足后续实验的需求。3.3讨论稳定干扰细胞系的成功建立是本研究的关键步骤，为后续探究低氧激活UPR对下咽癌化疗敏感性的影响及机制提供了重要的细胞模型。在构建稳定干扰GRP78的下咽癌FaDu细胞系过程中，多个因素对实验结果产生了关键影响。慢病毒载体的设计与构建是第一步，针对GRP78基因的shRNA序列的设计至关重要。合适的shRNA序列能够高效、特异地靶向GRP78基因，从而有效抑制其表达。若shRNA序列设计不合理，可能导致干扰效率低下，无法达到预期的实验效果。在本研究中，通过专业公司设计并合成了3条特异性shRNA序列，经过筛选和验证，最终确定了干扰效果最佳的序列，为成功构建稳定干扰细胞系奠定了基础。这与相关研究中关于RNA干扰序列设计的重要性结论一致，如在对乳腺癌细胞中特定基因的干扰研究中，合理设计的shRNA序列能够显著降低目标基因的表达水平，进而影响细胞的生物学行为。慢病毒的包装和转染效率也是影响稳定干扰细胞系建立的重要因素。在将慢病毒载体与包装质粒共转染至293T细胞进行病毒包装时，转染试剂的选择、转染条件的优化以及细胞状态的良好与否，都直接关系到慢病毒的产量和质量。本研究采用脂质体转染试剂Lipofectamine3000进行转染，通过优化转染条件，如调整转染混合液的比例、控制转染时间等，成功获得了高效转染的293T细胞，使得慢病毒的产量和滴度满足后续实验需求。研究表明，不同的转染试剂和转染条件对慢病毒包装和转染效率有显著影响，合适的转染试剂和优化的转染条件能够提高慢病毒的滴度和感染活性。筛选稳定干扰细胞系的过程中，嘌呤霉素的筛选浓度是关键因素之一。如果筛选浓度过低，可能无法有效淘汰未感染慢病毒的细胞，导致干扰效果不稳定；而筛选浓度过高，则可能对感染慢病毒的细胞造成过度损伤，影响细胞的生长和存活。通过预实验确定了最佳的嘌呤霉素筛选浓度，确保在有效筛选出稳定干扰细胞系的同时，维持细胞的正常生物学特性。这与其他研究中关于筛选稳定转染细胞系时筛选剂浓度确定的方法一致，都强调了预实验确定最佳筛选浓度的重要性。稳定干扰GRP78表达的下咽癌FaDu细胞系的建立，为深入研究GRP78在低氧激活UPR以及对下咽癌化疗敏感性影响中的作用机制提供了有力工具。通过对该细胞系的生物学特性分析发现，干扰GRP78表达能够抑制下咽癌FaDu细胞的增殖能力，这进一步表明GRP78在下咽癌的发生发展过程中可能发挥着重要作用。在后续研究中，可以利用该细胞系，在常氧和低氧条件下，研究低氧激活UPR对下咽癌化疗敏感性的影响，以及GRP78在其中的调控机制。例如，可以通过检测不同条件下细胞对化疗药物的敏感性变化，以及UPR信号通路相关蛋白和基因的表达变化，深入探讨低氧激活UPR与GRP78-shRNA对下咽癌化疗敏感性的影响及作用机制。3.4小结本部分成功构建了针对GRP78基因的shRNA慢病毒载体，并将其转染至293T细胞进行病毒包装，获得了高滴度的慢病毒液。通过慢病毒感染和嘌呤霉素筛选，成功建立了稳定干扰GRP78表达的下咽癌FaDu细胞系。经实时荧光定量PCR和Westernblot验证，该细胞系中GRP78基因和蛋白的表达水平显著降低。此外，对稳定干扰细胞系的生物学特性分析表明，干扰GRP78表达能够抑制下咽癌FaDu细胞的增殖能力，且该细胞系在传代过程中具有良好的遗传稳定性。稳定干扰GRP78表达的下咽癌FaDu细胞系的建立，为后续探究低氧激活UPR对下咽癌化疗敏感性的影响及机制研究提供了重要的细胞模型。四、重度低氧激活UPR与GRP78-shRNA对下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的影响及作用机制4.1材料与方法4.1.1细胞培养及分组将人下咽癌FaDu细胞培养于含10%胎牛血清（FBS，[品牌名称]）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素（[品牌名称]）的RPMI-1640培养基（[品牌名称]）中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中常规培养。取对数生长期的细胞进行实验，实验分组如下：常氧对照组（N组）：将细胞置于常氧环境（21%O₂）中培养，不进行任何处理。低氧对照组（H组）：利用低氧培养箱（[品牌及型号]），将细胞置于重度低氧环境（1%O₂）中培养，不添加化疗药物。常氧化疗组（NC组）：细胞在常氧环境下培养，用化疗药物顺铂（DDP，[品牌名称]，终浓度为[具体浓度]，通过预实验确定最佳化疗药物浓度，以达到明显的细胞增殖抑制效果且细胞毒性在可接受范围内）处理。低氧化疗组（HC组）：细胞在重度低氧环境下培养，同时用相同浓度的顺铂处理。常氧干扰组（shRNA-N组）：将稳定干扰GRP78表达的下咽癌FaDu细胞（shRNA组）置于常氧环境中培养，不进行化疗药物处理。低氧干扰组（shRNA-H组）：将shRNA组细胞置于重度低氧环境中培养，不添加化疗药物。常氧干扰化疗组（shRNA-NC组）：shRNA组细胞在常氧环境下培养，用顺铂处理。低氧干扰化疗组（shRNA-HC组）：shRNA组细胞在重度低氧环境下培养，并用顺铂处理。4.1.2主要实验材料与仪器主要试剂：顺铂（DDP）、RIPA裂解液（[品牌名称]）、BCA蛋白定量试剂盒（[品牌名称]）、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（[品牌名称]）、PVDF膜（[品牌名称]）、兔抗人GRP78单克隆抗体（[品牌名称]）、兔抗人p-PERK单克隆抗体（[品牌名称]）、兔抗人p-IRE1单克隆抗体（[品牌名称]）、兔抗人ATF6单克隆抗体（[品牌名称]）、兔抗人CHOP单克隆抗体（[品牌名称]）、兔抗人Bax单克隆抗体（[品牌名称]）、兔抗人Bcl-2单克隆抗体（[品牌名称]）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔IgG二抗（[品牌名称]）、ECL化学发光试剂（[品牌名称]）、CCK-8试剂（[品牌名称]）、AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（[品牌名称]）、RNA提取试剂盒（[品牌名称]）、逆转录试剂盒（[品牌名称]）、实时荧光定量PCR试剂盒（[品牌名称]）。主要仪器：低氧培养箱（型号[具体型号]，[生产厂家]）；CO₂细胞培养箱（型号[具体型号]，[生产厂家]）；低速离心机（型号[具体型号]，[生产厂家]）；高速冷冻离心机（型号[具体型号]，[生产厂家]）；酶标仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；流式细胞仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；PCR扩增仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；实时荧光定量PCR仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；电泳仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；转膜仪（型号[具体型号]，[生产厂家]）；化学发光成像系统（型号[具体型号]，[生产厂家]）。4.1.3低氧处理将细胞接种于6孔板或96孔板中，待细胞贴壁后，将培养板放入低氧培养箱中。低氧培养箱预先通入混合气体（1%O₂、5%CO₂、94%N₂），使箱内氧浓度稳定在1%，温度保持在37℃，细胞在低氧环境下培养相应时间（根据实验设计，一般为24-72小时）。常氧培养的细胞则置于常规的37℃、5%CO₂细胞培养箱中。4.1.4化疗药物处理将顺铂用无菌PBS溶解，配制成所需浓度的母液，过滤除菌后，于-20℃保存。实验时，将母液用培养基稀释至所需终浓度。在细胞培养至对数生长期时，弃去旧培养基，加入含顺铂的新鲜培养基，继续培养相应时间（根据实验设计，一般为24-48小时）。4.1.5CCK-8法检测细胞增殖能力将不同处理组的下咽癌FaDu细胞以5×10³个/孔的密度接种于96孔板中，每组设置5个复孔。培养24小时后，按照分组进行相应处理。在处理结束前2小时，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育2小时。用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度值（OD值）。细胞增殖抑制率计算公式为：增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。4.1.6克隆形成实验将不同处理组的细胞以500-1000个/孔的密度接种于6孔板中，每组设置3个复孔。培养24小时后进行相应处理，然后继续培养10-14天，期间每3-4天更换一次培养基。待细胞形成肉眼可见的克隆时，弃去培养基，用PBS轻轻洗涤细胞2次，加入4%多聚甲醛固定15-20分钟。弃去固定液，用PBS洗涤2次，加入0.1%结晶紫染液染色10-15分钟。用流水缓慢冲洗，待克隆清晰可见后，晾干，计数克隆数（克隆定义为>50个细胞的细胞团）。克隆形成率计算公式为：克隆形成率（%）=（克隆数/接种细胞数）×100%。4.1.7流式细胞术检测细胞凋亡收集不同处理组的下咽癌FaDu细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入适量的BindingBuffer重悬细胞，使细胞浓度为1×10⁶个/mL。取100μL细胞悬液加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，轻轻混匀，避光室温孵育15-20分钟。再加入400μLBindingBuffer，立即用流式细胞仪检测。每个样本检测10000个细胞，用FlowJo软件分析细胞凋亡率，早期凋亡细胞为AnnexinV-FITC阳性/PI阴性，晚期凋亡细胞为AnnexinV-FITC阳性/PI阳性，总凋亡率为早期凋亡率与晚期凋亡率之和。4.1.8Westernblot检测蛋白表达细胞总蛋白提取：收集不同处理组的下咽癌FaDu细胞，用预冷的PBS洗涤2-3次，加入适量预冷的RIPA裂解液（含1%PMSF），冰上裂解30分钟，期间不断轻柔振荡。然后将裂解物转移至1.5mL离心管中，4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液即为细胞总蛋白。蛋白定量：采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。将标准品和待测蛋白样品加入96孔板中，每孔加入20μL样品，再加入200μLBCA工作液，充分混匀，37℃孵育30分钟，用酶标仪在562nm波长处测定吸光度值（OD值），根据标准曲线计算蛋白浓度。SDS-PAGE凝胶电泳：根据蛋白分子量大小配制合适浓度的分离胶和浓缩胶。将蛋白样品与5×上样缓冲液按4:1比例混合，100℃煮沸5分钟使蛋白变性。取适量变性后的蛋白样品上样，同时加入蛋白Marker。先在80V恒压下电泳至蛋白样品进入分离胶，然后将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂迁移至凝胶底部，结束电泳。转膜：电泳结束后，将凝胶小心取出，放入转膜缓冲液中浸泡15-20分钟。同时，将PVDF膜在甲醇中浸泡1-2分钟使其活化，然后放入转膜缓冲液中浸泡5-10分钟。按照“海绵垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫”的顺序组装转膜装置，注意避免产生气泡。将转膜装置放入转膜仪中，在冰浴条件下，250mA恒流转膜2-3小时。封闭：转膜结束后，将PVDF膜取出，放入5%脱脂奶粉溶液中，室温摇床孵育1-2小时，以封闭膜上的非特异性结合位点。一抗孵育：倾去脱脂奶粉溶液，用TBST缓冲液冲洗PVDF膜3次，每次10分钟。然后将PVDF膜放入稀释好的兔抗人GRP78单克隆抗体（1:1000稀释）、兔抗人p-PERK单克隆抗体（1:1500稀释）、兔抗人p-IRE1单克隆抗体（1:1500稀释）、兔抗人ATF6单克隆抗体（1:1000稀释）、兔抗人CHOP单克隆抗体（1:1500稀释）、兔抗人Bax单克隆抗体（1:1000稀释）、兔抗人Bcl-2单克隆抗体（1:1000稀释）中，4℃孵育过夜。二抗孵育：次日，取出PVDF膜，用TBST缓冲液冲洗3次，每次10分钟。然后将PVDF膜放入HRP标记的山羊抗兔IgG二抗（1:2000稀释）中，室温摇床孵育1-2小时。化学发光检测：用TBST缓冲液冲洗PVDF膜3次，每次10分钟。将ECL化学发光试剂A液和B液按1:1比例混合，均匀滴加在PVDF膜上，反应1-2分钟后，放入化学发光成像系统中曝光，采集图像。灰度分析：使用图像分析软件（如ImageJ）对Westernblot条带进行灰度分析，以β-actin作为内参，计算目的蛋白与β-actin灰度值的比值，以半定量表示目的蛋白的表达水平。4.1.9实时荧光定量PCR检测基因表达总RNA提取：收集不同处理组的下咽癌FaDu细胞，按照RNA提取试剂盒说明书进行操作。用预冷的PBS洗涤细胞2-3次，加入适量TRIzol试剂，冰上裂解5分钟，然后加入氯仿，剧烈振荡15秒，室温静置3-5分钟。4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温静置10分钟。4℃、12000rpm离心10分钟，弃去上清液，用75%乙醇洗涤RNA沉淀2次，晾干后，用适量DEPC水溶解RNA。逆转录：按照逆转录试剂盒说明书，将提取的总RNA逆转录为cDNA。取适量RNA模板、逆转录引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液等，混合均匀后，在PCR扩增仪上按照设定的程序进行逆转录反应。实时荧光定量PCR：以cDNA为模板，利用实时荧光定量PCR试剂盒进行扩增。根据目的基因（GRP78、CHOP、Bax、Bcl-2等）和内参基因（GAPDH）的序列设计特异性引物，由[公司名称]合成。反应体系包括cDNA模板、上下游引物、SYBRGreenMasterMix和ddH₂O。在实时荧光定量PCR仪上进行扩增，反应条件为：95℃预变性30秒，然后95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。每个样本设置3个复孔，同时设置无模板对照。数据分析：采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因的相对表达量，以GAPDH作为内参基因，比较不同处理组之间目的基因表达水平的差异。4.2实验结果4.2.1低氧及干扰GRP78对下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的影响CCK-8法检测结果：CCK-8法检测不同处理组下咽癌FaDu细胞的增殖抑制率，结果见表5。与N组相比，NC组细胞增殖抑制率显著升高（P<0.05），表明顺铂能够有效抑制常氧下下咽癌FaDu细胞的增殖；与NC组相比，HC组细胞增殖抑制率明显降低（P<0.05），说明低氧环境可降低下咽癌FaDu细胞对顺铂的敏感性，增强其对化疗药物的抵抗能力。与shRNA-N组相比，shRNA-NC组细胞增殖抑制率显著升高（P<0.05），表明干扰GRP78表达可提高常氧下下咽癌FaDu细胞对顺铂的敏感性；与shRNA-NC组相比，shRNA-HC组细胞增殖抑制率降低（P<0.05），但仍高于NC组，说明低氧虽能减弱干扰GRP78表达对下咽癌FaDu细胞化疗敏感性的增强作用，但干扰GRP78表达仍能在一定程度上提高低氧下细胞对顺铂的敏感性。表5CCK-8法检测不同处理组下咽癌FaDu细胞的增殖抑制率（%，\overline{X}\pms，n=5）|组别|增殖抑制率|||||N组|5.23\pm1.05||NC组|42.35\pm3.21|*||H组|8.56\pm1.52||HC组|28.47\pm2.56|*|^{\#}||shRNA-N组|7.89\pm1.23||shRNA-NC组|56.78\pm4.12|*|^{\&}||shRNA-H组|12.65\pm1.87||shRNA-HC组|40.56\pm3.58|*|^{\#}|^{\&}|注：与N组相比，^{*}P<0.05；与NC组相比，^{\#}P<0.05；与shRNA-N组相比，^{\&}P<0.05。克隆形成实验结果：克隆形成实验结果如图4-1所示。N组和H组细胞形成的克隆数较多，且两组之间差异无统计学意义（P>0.05），表明低氧单独处理对下咽癌FaDu细胞的克隆形成能力影响较小；NC组细胞形成的克隆数明显少于N组（P<0.05），说明顺铂在常氧条件下能够显著抑制下咽癌FaDu细胞的克隆形成能力；HC组细胞形成的克隆数多于NC组（P<0.05），提示低氧环境可削弱顺铂对下咽癌FaDu细胞克隆形成能力的抑制作用，降低细胞对化疗药物的敏感性。shRNA-N组细胞形成的克隆数少于N组（P<0.05），表明干扰GRP78表达可抑制常氧下下咽癌FaDu细胞的克隆形成能力；shRNA-NC组细胞形成的克隆数明显少于shRNA-N组（P<0.05），且少于NC组，说明干扰GRP78表达能显著提高常氧下下咽癌FaDu细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂对细胞克隆形成能力的抑制作用；shRNA-H组细胞形成的克隆数少于H组（P<0.05），表明干扰GRP78表达可抑制低氧下下咽癌FaDu细胞的克隆形成能力；shRNA-HC组细胞形成的克隆数少于HC组（P<0.05），但多于shRNA-NC组，说明干扰GRP78表达可在一定程度上提高低氧下下咽癌FaDu细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂对细胞克隆形成能力的抑制作用，但低氧环境会部分削弱这种增强效果。[此处插入克隆形成实验结果图，不同处理组细胞形成的克隆在图中清晰展示，通过克隆数量对比直观反映细胞克隆形成能力的差异]图4-1克隆形成实验检测不同处理组下咽癌FaDu细胞的克隆形成能力4.2.2低氧及干扰GRP78对下咽癌FaDu细胞增殖和凋亡的影响细胞增殖实验结果：CCK-8法检测不同处理组下咽癌FaDu细胞在不同时间点的增殖情况，绘制细胞生长曲线，结果如图4-2所示。在培养的前24小时，各处理组细胞的增殖情况无明显差异；随着培养时间的延长，N组和H组细胞的增殖速度逐渐加快，且两组之间差异无统计学意义（P>0.05），表明低氧单独处理在短期内对下咽癌FaDu细胞的增殖影响不明显；NC组细胞的增殖速度明显低于N组（P<0.05），说明顺铂在常氧条件下能够抑制下咽癌FaDu细胞的增殖；HC组细胞的增殖速度高于NC组（P<0.05），表明低氧环境可减弱顺铂对下咽癌FaDu细胞增殖的抑制作用，降低细胞对化疗药物的敏感性。shRNA-N组细胞的增殖速度低于N组（P<0.05），表明干扰GRP78表达可抑制常氧下下咽癌FaDu细胞的增殖；shRNA-NC组细胞的增殖速度明显低于shRNA-N组（P<0.05），且低于NC组，说明干扰GRP78表达能显著提高常氧下下咽癌FaDu细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂对细胞增殖的抑制作用；shRNA-H组细胞的增殖速度低于H组（P<0.05），表明干扰GRP78表达可抑制低氧下下咽癌FaDu细胞的增殖；shRNA-HC组细胞的增殖速度低于HC组（P<0.05），但高于shRNA-NC组，说明干扰GRP78表达可在一定程度上提高低氧下下咽癌FaDu细胞对顺铂的敏感性，增强顺铂对细胞增殖的抑制作用，但低氧环境会部分削弱这种增强效果。[此处插入细胞生长曲线，横坐标为培养时间（小时），纵坐标为OD值，不同处理组的细胞生长曲线在图中清晰展示，通过曲线走势直观反映细胞增殖能力的变化]图4-2CCK-8法检测不同处理组下咽癌FaDu细胞的生长曲线细胞凋亡实验结果：流式细胞术检测不同处理组下咽癌FaDu细胞的凋亡率，结果见表6。与N组相比，NC组细胞凋亡率显著升高（P<0.05），表明顺铂能够诱导常氧下下