动物细胞融合技术与单克隆抗体-高二生物（人教版2019选择性必修3）

第3节

动物细胞工程（第2课时）动物细胞融合技术和单克隆抗体【本节聚焦】1、什么是动物细胞融合技术？2、单克隆抗体是如何制备的？在临床上有哪些应用？第2章细胞工程学习目标、重难点核心素养1.说出什么是动物细胞融合技术。2.简述单克隆抗体的制备过程以及在临床上有哪些应用。1.生命观念：阐明动物细胞培养的条件和过程；商述干细胞在生物医学工程中有广泛的应用价值。2.科学思维：阐明利用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程和该技术的应用前景.3.社会责任：阐明利用动物细胞融合技术制备单克隆抗体的过程，认同单克隆抗体在临床上有重要的应用价值.1.教学重点：（1）动物细胞融合技术的原理、方法及其应用。（2）单克隆抗体的制备过程及其在临床上的应用。2.教学难点：（1）单克隆抗体制备过程中的两次筛选及其目的。（2）单克隆抗体在疾病诊断和治疗中的应用优势。情境导入问题：为什么要号召新冠感染痊愈者捐献自己的血浆？这样的血浆对新冠重症感染患者有什么作用呢？

血浆中有新冠病毒的抗体,可以用于治疗新冠感染患者。

但一个捐献者的200-300毫升的血浆，如果合格，一般也只能治疗2-3个患者。思考：抗体为什么不人工制备呢？传统抗体如何制备？

抗体是在抗原物质的刺激下，由浆细胞（B淋巴细胞）产生的，可与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白。情境导入传统抗体制备方法及缺陷抗原传统血清免疫（所有抗体混合）（2）缺陷：产量低、纯度低，且抗体的特异性差、灵敏度低。（1）方法：抗原从血清中分离抗体浆细胞多种B淋巴细胞动物体内刺激增值分化？病原体表面多个抗原决定簇，被免疫系统视为不同独立的激活信号，形成不同B淋巴细胞每一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体。抗原不纯抗体不纯有什么方法解决这个问题？思考：有什么方法解决传统抗体制备存在产量低、纯度低、特异性差的问题？1个B淋巴细胞B淋巴细胞群大量单一抗体克隆产生在体外培养条件下，一个B淋巴细胞是不可能无限增殖的！米尔斯坦【英国】科勒【德国】解决1975年，英国科学家米尔斯坦和德国科学家科勒设计了一个极富创造性的试验方案：抗体B淋巴细胞骨髓瘤细胞(单克隆抗体)情境导入骨髓瘤细胞能无限增殖既能无限增殖，又能产生足够数量的特定抗体杂交瘤细胞单克隆抗体：由单一杂交瘤细胞增殖产生的特异性抗体。如何将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合得到杂交瘤细胞呢？思考与讨论单克隆抗体分析概念中“单”和“克隆”的含义。总结单克隆抗体的概念？注：B淋巴细胞指的是活化的B淋巴细胞（指从成熟的B细胞向浆细胞分化的时期），其融合的效率最高，若直接用浆细胞，融合效率很低。自主阅读教材P48，思考下列问题1.动物细胞融合技术的概念、原理、结果分别是什么？2.动物细胞融合技术常用的诱导方法有哪些？4.动物细胞融合技术有何意义？在现实生活中的应用有哪些？3.什么是灭活？灭活病毒诱导融合的原理？融合实质及完成的标志？

（教材P48的相关信息）一、动物细胞融合技术回顾-必修一：细胞膜的结构回顾-选必三：植物体细胞自交1、概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的技术。融合后形成的杂交细胞具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞。3、诱导方式：物理法：离心法、电融合法化学法：聚乙二醇（PEG)融合法生物法：灭活病毒诱导法（不能，动物细胞的全能性受限）注意：诱导融合之前，用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散。思考：通过动物细胞融合技术能否形成完整个体？2、原理：细胞膜的流动性一、动物细胞融合技术（动物细胞融合特有的诱导方法）P49肺结核病人病理切片灭活病毒诱导法用物理或化学手段使病毒失去感染能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。拓展：一、动物细胞融合技术不灭活的病毒的不可以用作细胞融合诱导剂，会感染动物细胞。不灭活可以吗？病毒：表面含有糖蛋白和酶细胞膜融合细胞核融合细胞质融合细胞融合的实质4、动物细胞融合完成的标志：两个或多个细胞核融合为一个细胞核一、动物细胞融合技术4、结果：形成具有原来两个或多个细胞的遗传信息的杂交细胞5、意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交成为可能。6、应用：正在融合的淋巴细胞与骨髓瘤细胞(1)成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和培育生物新品种等的重要手段。(2)用于制造单克隆抗体。生产单克隆抗体植物体细胞杂交动物细胞融合原理细胞融合前的处理方法诱导细胞融合的方法细胞融合成功的标志主要用途意义细胞膜流动性、植物细胞全能性细胞膜的流动性用果胶酶和纤维素酶去除细胞壁用胰蛋白酶或胶原蛋白酶使细胞分散成单个细胞电融合法、离心法；聚乙二醇（PEG）融合法、高Ca2+-高pH融合法离心法、电融合法、PEG融合法、灭活病毒诱导法再生出细胞壁细胞核的融合获得完整的杂种植株主要用于制造单克隆抗体打破生殖隔离，实现远缘杂交育种，培育植物新品种突破了有性杂交的局限，使远缘杂交成为可能小结：动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较一、动物细胞融合技术1.下列有关动物细胞融合与植物体细胞杂交比较的叙述，错误的是（

）

A.它们的原理都涉及细胞膜的流动性

B.都可以用电融合法或PEG融合法诱导融合

C.融合前都需用纤维素酶或果胶酶处理细胞

D.前者主要是为了获得细胞产品，后者主要是为了获得杂种植株C趁热打铁1.制备单克隆抗体的思路骨髓瘤细胞能无限增殖能产生抗体B淋巴细胞二、单克隆抗体的制备过程2.建构模型①请大家结合教材P48—49相关内容，以小组为单位，讨论单克隆抗体制备过程(2min)②在学案上构建单克隆抗体制备流程图（用文字+箭头的形式）动物细胞融合杂交细胞骨髓瘤细胞（癌细胞，能无限增殖）一个B淋巴细胞（只分泌一种特异性抗体不能无限增殖）杂交瘤细胞动物细胞培养单克隆抗体既能迅速大量增殖，又能产生专一抗体。流程图问题引导：①用特定抗原对小鼠进行免疫的原因？②骨髓瘤细胞、免疫的B淋巴细胞各有何特点？③免疫的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞融合后，得到的细胞是否都是杂交瘤细胞？杂交瘤细胞有何特点？④

杂交瘤细胞是如何筛选出来的？⑤

是否所有的杂交瘤细胞都能产生所需的抗体？⑥如何扩大培养得到大量的单克隆抗体？二、单克隆抗体的制备过程1、请大家结合教材P48—49相关内容，以小组为单位，讨论单克隆抗体制备过程(2min)2、在学案上构建单克隆抗体制备流程图（用文字+箭头的形式）

注射特定抗原

从脾脏中获取B淋巴细胞

骨髓瘤细胞目的是获得产生特定抗体的B淋巴细胞骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合诱导融合多种杂交细胞从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞进行培养3、单克隆抗体的制备过程B淋巴细胞、骨髓瘤细胞融合的细胞：BB、B-瘤、瘤-瘤选择培养基培养（HAT培养基）目的？种类？①产生其他抗体的B淋巴细胞

②产生针对注射抗原的抗体的B淋巴细胞培养基中共出现几种细胞？其中融合的细胞有几种？(只考虑两两融合)思考：杂交瘤细胞是如何筛选出来的？？第一次筛选目的：筛选杂交瘤细胞（多种）二、单克隆抗体的制备过程①细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。②B淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但不能分裂增殖。

③鼠骨髓瘤细胞中只有D途径，没有S途径，但能不断分裂增殖。筛选出杂交瘤细胞方法？培养基中加入氨基嘌呤（HAT选择培养基）B，B-B：不能无限增殖，死亡瘤，瘤-瘤：不能无限增殖，死亡杂交瘤细胞：（B-瘤）能无限增殖，生长D途径、S途径D途径D途径、S途径拓展：DNA复制途经二、单克隆抗体的制备过程

注射特定抗原

从脾脏中获取B淋巴细胞

骨髓瘤细胞目的是获得产生特定抗体的B淋巴细胞骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合诱导融合多种杂交细胞从患骨髓瘤的小鼠体内取骨髓瘤细胞进行培养3、单克隆抗体的制备过程B淋巴细胞、骨髓瘤细胞融合的细胞：BB、B-瘤、瘤-瘤选择培养基培养（HAT培养基）目的？种类？①产生其他抗体的B淋巴细胞

②产生针对注射抗原的抗体的B淋巴细胞培养基中共出现几种细胞？其中融合的细胞有几种？(只考虑两两融合)思考：杂交瘤细胞是如何筛选出来的？？第一次筛选目的：筛选杂交瘤细胞（多种）二、单克隆抗体的制备过程筛选的所有杂交瘤细胞都能产生所需的抗体？？不一定，杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞筛选？克隆化培养和抗体检测用培养液稀释

杂交瘤细胞(多种)方法：抗原—抗体杂交原理：抗原—抗体特异性结合拓展：克隆化培养和抗体检测★有限稀释法每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞侧面模拟图克隆化培养一段时间取上清液进行抗体检测克隆化培养细胞增殖抗体检测阳性细胞（分泌的抗体能与特定抗原结合）显色测定荧光测定多次筛选，可获得足量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞二、单克隆抗体的制备过程原理？⑤如何扩大培养得到大量的单克隆抗体？单克隆抗体从细胞培养液中提取从小鼠腹水中提取（体内培养）（能产生所需抗体的杂交瘤细胞）特异性强灵敏度高可大量制备特点优点：易于控制培养条件，操作简单，成本较低。缺点：规模小，产量少优点：可大规模培养，产量大。缺点：需要认为控制培养条件，成本高二、单克隆抗体的制备过程二、单克隆抗体及其应用单克隆抗体第二次筛选杂交细胞杂交瘤细胞体外或体内培养第一次筛选骨髓瘤细胞

诱导融合分泌特异抗体的杂交瘤细胞杂交瘤细胞群提取已免疫的B淋巴细胞动物细胞融合技术动物细胞培养技术小结：既能大量繁殖又能产生抗体优点：特异性强、灵敏度高、可大量制备注射抗原单克隆抗体制备的过程中，应用到的技术手段单克隆抗体制备过程的原理细胞膜的流动性和细胞增殖二、单克隆抗体的制备过程单克隆抗体制备过程相关知识点检测（1）该过程中应用到的技术_______________________________________（2）原理_______________________________________（3）注射特定抗原的目的______________________________________________（4）诱导融合的方法______________________________________动物细胞特有的诱导融合方法为_______________________（5）第一次筛选的目的______________________

第一次如何筛选___________________________

筛选原理____________________________________________________（6）杂交瘤细胞的特点__________________________________动物细胞融合、动物细胞培养细胞膜具有一定的流动性、细胞增殖用特定的抗原对小鼠进行免疫，并从该小鼠的脾中得到能产生特定抗体的B淋巴细胞PEG融合法、电融合法、灭活病毒诱导法灭活病毒诱导法筛选获得杂交瘤细胞用特定的选择培养基进行筛选在选择培养基上，未融合的亲本细胞和融合的具有同种核的细胞都会死亡，只有融合的杂交瘤细胞才能生长既能迅速大量增殖，又能产生抗体二、单克隆抗体的制备过程（7）第二次筛选的目的________________________________________________如何筛选___________________________________________________选择抗体检测呈___性的杂交瘤细胞，即_____________

_____________（8）抗体检测原理_______________________________________（9）如何获取大量所需杂交瘤细胞__________________________________________（10）如何获取单克隆抗体①体外培养___________________________②小鼠腹腔内培养_________________________（11）单克隆抗体的优点_____________________________获得足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞进行克隆化培养和抗体检测（进行多次筛选）分泌的抗体能与特定的抗原结合抗原和抗体能够特异性结合(分子水平的鉴定）在体外条件下大规模培养（接种于培养液中）或注射到小鼠腹腔内增殖从细胞培养液中获取从小鼠腹水中获取能准确地识别抗原的细微差异，与特定抗原发生特异性结合，并且可以大量制备阳单克隆抗体制备过程相关知识点检测二、单克隆抗体的制备过程项目第一次筛选第二次筛选筛选原因目的筛选出？

筛选出

的杂交瘤细胞方法用特定选择培养基筛选：未融合的亲本细胞和融合的有同种核的细胞都会

，只有融合杂交瘤细胞才能

。

用96孔板培养，在每一个孔中尽量只接种一个杂交瘤细胞的情况下进行克隆化培养和

，经多次筛选得到足够数量的能分泌所需抗体的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞能分泌所需抗体死亡抗体检测生长诱导融合后得到多种融合细胞，还有未融合的细胞等由于小鼠在生活中还受到其他抗原的刺激，所以经选择培养获得的杂交瘤细胞中有能产生其他抗体的细胞

比较两次筛选的原因、方法和目的二、单克隆抗体的制备过程2.科学家以SARS病毒的核衣壳蛋白为抗原，制备出了单克隆抗体。下列相关叙述正确的是（

）A.利用该单克隆抗体可以诊断是否感染SARS病毒B.体外培养单个B淋巴细胞可以获得针对SARS病毒的单克隆抗体C.将等量B淋巴细胞和骨髓瘤细胞混合，经诱导后融合的细胞即为杂交瘤细胞D.将纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，从小鼠血清中分离出的抗体为单克隆抗体A趁热打铁

新型冠状病毒抗原检测1、作为诊断试剂

乙肝测定试剂单克隆抗体+同位素（荧光标记）在特定组织中成像的技术，可定位诊断肿瘤、心血管畸形等疾病。抗人绒毛促性腺激素单克隆抗体艾滋病检测试剂优点：准确、高效、简易、快速。三、单克隆抗体的应用（2）抗体-药物偶联物（ADC）通过将细胞毒素与能特异性识别肿瘤抗原的单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤。作用机制如下图：优点：位置准确、特异性强、灵敏度高，毒副作用小。三、单克隆抗体的应用

“生物导弹”发挥靶向运输作用，特异性结合靶细胞表面抗原，将药物输送到靶细胞发挥治疗效应思考：除了细胞毒素，还有哪些物质理论上可以作为ADC偶联的药物？①可以用放射性同位素标记单克隆抗体进行靶向放疗；②一些作用于细胞信号转导通路的药物可以通过阻断肿瘤细胞的信号通路来抑制其生长，理论上也可以将这些药物与单克隆抗体结合进行治疗。（3）用于治疗疾病：单克隆抗体药物已被广泛用于肿瘤、自身免疫病等疾病的治疗，如利妥昔单抗被用于治疗复发难治的低分化B细胞淋巴瘤；曲妥珠单抗被用于治疗乳腺癌等。优点：位置准确、疗效高、毒副作用小。三、单克隆抗体的应用3.抗体—药物偶联物(ADC)通过将细胞毒素与单克隆抗体结合，实现了对肿瘤细胞的选择性杀伤，过程如图所示。下列叙述不正确的是（

）A.抗体进入细胞后激活溶酶体酶，导致细胞凋亡B.ADC可通过胞吞方式进入肿瘤细胞C.单克隆抗体携带细胞毒素与肿瘤细胞特异性结合D.肿瘤细胞凋亡是细胞主动死亡的过程，会产生新的蛋白质趁热打铁A课堂小结1.关于动物细胞融合的说法错误的是()A.动物细胞融合后形成的具有原来两个或多个动物细胞遗传信息的多核细胞称为杂交细胞B.动物细胞融合己成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段C.常用于诱导动物细胞融合手段有聚乙二醇、灭活的病毒、电激等D.细胞融合技术突破了有性杂交方法局限，使远缘杂交成为可能A课后训练2.如图2-2-6为单克隆抗体的制备流程示意图。下列叙述正确的是()图2-2-6A.甲是从已免疫的小鼠脾脏中获得的T淋巴细胞B.①表示将骨髓瘤细胞去核后进行细胞融合C.乙为融合细胞，同时具有细胞甲和骨髓瘤细胞的特性D.②表示筛选能产生特异性抗体的细胞练习D课后训练3.如图所示为杂交瘤细胞的制备示意图。骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT-),在HAT选择培养液中不能正常合成DNA，无法生长。下列叙述错误的是()A.可用灭活的病毒诱导B淋巴细胞与骨髓瘤细胞