【《盐单胞菌概述》1800字】

第页盐单胞菌概述目录TOC\o"1-3"\h\u29598盐单胞菌概述 1171131.1盐单胞菌简介 1236871.2盐单胞菌基因操作的相关方法 1263811.3利用盐单胞菌生产PHA的应用 31.1盐单胞菌简介盐单胞菌TD01是从中国新疆的一个盐湖中分离出来的中度嗜盐菌，能在在开放的、连续的高pH和高盐浓度条件下生长良好，使用该菌作为经济生产化学产品的平台有着非常大的优势[3]。而且已经对该菌株进行了全基因组测序（NCBIGenBankID：AFQW00000000），通过对整个基因组测序结果分析揭示了它的渗透调节机制以及与PHA合成有关的酶的进化关系[4]。其基因工程技术也已经被开发出来，包括用于质粒转化的接合，用于相对高水平表达蛋白质的质粒表达系统，以及用于无标记基因替换或缺失的敲除方法[5]。1.2盐单胞菌基因操作的相关方法盐单胞菌的接合质粒转换方法偶联是将质粒转化入盐单胞菌TD菌株的有效方法。首先构建重组质粒，并将重组质粒转化入感受态大肠杆菌中。然后将感受态大肠杆菌与盐单胞菌经过相关培养，按照一定比例混合，随后涂布在60-LB平板上，经过培养。然后将细胞重悬于60-LB中，并在含有相关抗生素的60-LB平板中培养[6]。此外在该偶联体系中加入1-5mmol/L纳米氧化铝，转化效率可提高约100倍[7]。图1-3盐单胞菌和感受态大肠杆菌接合示意图Figure1-3SchematicdiagramoftheconjugationofHalomonasandcompetentE.coli基于自杀载体的基因敲除方法盐单胞菌中基因的敲除，通常利用的是pRE112-6I-SceI自杀载体和pBBR1MCS1-ISceI诱导质粒，基于无标记基因置换方法的HalomonasTD基因敲除程序。DanTan[8]等对嗜盐菌的甲基化系统进行了部分灭活处理，构建了可以稳定表达质粒的嗜盐菌.hsdRMS，re1和re2的R/M系统负责识别和限制未甲基化的DNA或具有外来甲基化类型的DNA；通过敲除该系统，可使外源质粒在HalomonasTD01稳定表达，为后面的代谢改造奠定基础。为了敲除HalomonasTD01中编码EcoKI甲基酶的hsdRMS基因簇，用SOERCR扩增hsdRMS基因簇两侧的两个900bp同源臂，并将其连接到一条片段上。然后经过XbaIandSacI剪切后插入pRE112-6I-SceI中，将具有正确H1H2序列的pRE112-6I-SceI衍生物偶联到HalomonasTD01中（在氯霉素存在下产生共整合），通过CmR抗生素筛选正确的重组子。随后诱导质粒pBBR1MCS1-I-SCE转入HalomonasTD01中，通过菌落PCR鉴定出野生型或进行了敲除的突变体。将确认的敲除突变体在60-LB琼脂板上培养过夜，以消除诱导质粒。利用所列引物，用相同的方法依次敲除HalomonasTD01的两个限制性内切酶re1和re2基因。图1-4通过pRE112-6I-SceI自杀载体和pBBR1MCS1-I-SceI诱导质粒敲除目的基因Figure1-4TheplasmidisinducedbypRE112-6I-SceIsuicidevectorandpBBR1MCS1-I-SceItoknockoutthetargetgene1.3利用盐单胞菌生产PHA的应用由于盐单胞菌耐高盐浓度、耐高pH的特点，再加上其整个基因组测序已经完成，其基因工程相关技术也得到了广泛的应用，许多研究开始将盐单胞菌作为优势发酵平台，通过相关改造，达成能在开放的、无菌的环境下生产目标产物的目的。诱导表达载体的引入利用pRE112-6I-SceI自杀载体和pBBR1MCS1-ISceI诱导质粒，基于无标记基因置换方法，可进行盐单胞菌TD01的基因敲除[5]。DanTan等[8]利用此方法敲除hsdRMS基因簇及其re1、re2基因，使盐单胞菌TD01的DNA限制性内切酶/甲基化系统被部分抑制，从而提高质粒在盐单胞菌中的接合效率和稳定性。然后利用以LacIq-Ptrc启动子[9]开发的针对盐单胞菌TD菌株的诱导系统构建编码细胞分裂抑制因子MinCD的诱导表达载体，将其导入盐单胞菌并在其静止期对其诱导表达后，产生了比天然细胞更大的丝状细胞，使PHA在细胞内的积累量从69wt%增长到82wt%。较大的细胞形状促进了细胞更快的沉淀，简化了生物质的下游处理。这些工作有助于进一步降低盐生单胞菌生产PHB和PHBV的成本。引入与生产PHA相关的外源基因XiangbinChen[10]等将编码克鲁维氏梭菌4HB-CoA转移酶的orfZ基因整合到盐单胞菌的基因组中，实现了与质粒上编码orfZ的菌株相当的P(3HB-co-4HB)积累。通过控制orfZ在基因组中的表达，成功地构建了能利用葡萄糖合成P(3HB-co-4HB)的基因工程菌株TD01。在开放的无菌培养条件下，该重组菌能够在实验室规模和1000L中试发酵罐中分别生长到较高浓度。在1000L中试发酵罐中进一步放大，在非无菌条件下，48h内P(3HB-co-16mol%4HB)含量可达83g/L，产率为1.04g/L/h。通过控制盐单胞菌的细胞体积以提高PHB产量细菌形态由必需基因mreB和FtsZ分别编码的细胞骨架蛋白mreB和细胞分裂蛋白FtsZ决定。细胞骨架蛋白MreB通过引导肽聚糖前体的正确插入，在维持细胞形状方面发挥重要作用，它对于维持正常的细胞生长和细胞硬度与细胞壁相似也是必不可少的，FtsZ则负责细胞分裂过程在Z环的形成，缺少该基因会导致细胞拉长无法正常分裂。灭活mreB和FtsZ分别导致细胞大小和细胞长度增加，但会严重降低细胞生长能力。Xiao-RanJiang[11]等人开发了一种温度响应型质粒表达系统，在温敏质粒pTKmf上重组基因mreB和FtsZ，并将其导入敲除了mreB和FtsZ的重组盐单胞菌中，得到重组菌株LS21。该菌株能够在30℃的温度下生长到一定密度，之后将温度升高到37℃，此时