动物细胞工程主体

动物细胞工程

动物细胞培养动物细胞融合单克隆抗体技术

核移植动物细胞工程常用技术一、动物细胞培养1.概念：从动物有机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖。2.动物细胞的培养过程

幼龄动物剪碎组织胰蛋白酶处理细胞培养分散成单个细胞取幼龄动物组织块细胞贴壁：培养贴附性细胞时候，细胞要能够贴附于底物上才能生长繁殖。接触抑制：贴壁细胞分裂生长到表面相互接触时，细胞就会停止分裂增殖。原代培养：动物组织消化后的初次培养。包括培养的第1代细胞与传了10代以内的细胞。传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到40~50代，这种传代细胞为细胞株。细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。动物胚胎或幼龄动物的组织、器官细胞悬浮液胰蛋白酶10代细胞原代培养50代细胞细胞株无限传代细胞系传代培养单个细胞加培养液遗传物质未改变遗传物质已改变（分装前）3.动物细胞培养的条件①无菌、无毒的环境。无菌操作、加抗生素定期更换培养液②营养：糖、氨基酸、无机盐、微量元素、动物血清③温度和pH：哺乳动物的体温、PH为7.2-7.4④气体环境：氧气、二氧化碳比较项目植物组织培养动物细胞培养原理培养基性质培养基特有成分培养结果培养目的植物组织培养和动物细胞培养的比较细胞的全能性细胞增殖固体培养基液体培养基蔗糖植物激素葡萄糖动物血清植物体细胞株、细胞系快速繁殖、培育无病毒植株获得细胞或细胞分泌蛋白5.动物细胞培养技术的应用:1.蛋白质生物制品的生产

如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体2.应用于基因工程

主要用于作为受体细胞3.检测有毒物质，判断某种物质的毒性

4.细胞的生理、药理、病理研究

如用于筛选抗癌药物二、动物体细胞核移植技术和克隆动物

核移植：是将动物的一个细胞的细胞核,移如入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体。克隆动物：用核移植的方法得到的动物。

克隆（clone）：是指通过无性生殖而产生的具有完全相同的遗传组成的一群细胞或者生物的个体。克隆在希腊语中是“小树枝叶”的意思，用以指无性增殖物。现在则指个体、细胞、基因等不同水平上的无性增殖物。二、动物体细胞核移植技术和克隆动物1、定义：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核,移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中.使其重组并发育成一个新的胚胎,这个新的胚胎最终发育为动物个体.3、分类：胚胎核移植、体细胞核移植。胚胎细胞分化程度低，恢复其全能性相对容易。动物体细胞分化程度高，恢复其全能性十分困难2、原理：动物细胞核具有全能性

◆取供体细胞传代培养10代以内的细胞.为什么？◆用的是去核的减数第二次分裂中期细胞（MⅡ中期）为什么？◆激活方法：◆激活目的：◆促融方法：电刺激◆胚胎移植至代孕受体内

妊娠、分娩2.）核移植流程供体：优质高产奶牛受体：普通奶牛（卵母细胞的采集与培养）

1.体积大，易操作。2.含有促使细胞核表达全能性的物质和营养条件。有人说它三个母亲，对吗？１、核移植之前，为何要去掉受体卵母细胞的核？

为使核移植动物的核遗传物质全部来自有利用价值的动物提供的细胞。２、用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，为什么？10代以内的细胞保持一般保持正常二倍体的核型3、细胞核移植生产的克隆动物是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？

不是，克隆动物绝大部分DNA来自供体细胞核，但核外还有少部分DNA（如线粒体DNA）来自受体卵母细胞。在体细胞克隆羊“多莉”培育成功之前，胚胎细胞核移植技术已经有了很大的发展。实际上，“多莉”的克隆在核移植技术上沿袭了胚胎细胞核移植的全部过程，但这并不能减低“多莉”的重大意义，因为它是世界上第一例经体细胞核移植出生的动物，是克隆技术领域研究的巨大突破。这一巨大进展意味着：在理论上证明了，同植物细胞一样，分化了的动物细胞核也具有全能性．

4.动物克隆实例很多，为何多莉就举世闻名呢？2.体细胞核移植技术的应用前景

你还在为身体有残疾而苦恼吗？你还在为器官移植找不到合适的供体而焦虑吗？不能在这样下去了，看看我们的体细胞核移植技术吧，只需要从你身上取一个小小的体细胞，通过核移植培养出胚胎干细胞，再用胚胎干细胞诱导分化出各种组织器官，这样的器官的组织相容性抗原跟你的一摸一样，用这样的器官进行器官移植，根本就不会发生免疫排斥。不夸张的说，如果这项技术研究成熟了，以后大家换条胳膊换条腿就跟给汽车换个轮胎一样。你听明白了吗？这不是天方夜谭，巨大的前景就在眼前，你还在等什么？现在，对，就是现在，赶紧加入到生命科学的研究中来吧！广而告之：二、动物细胞融合

病毒表面含有的糖蛋白和一些酶能够与细胞膜上的糖蛋白发生作用，使细胞相互凝集，细胞膜上的蛋白质分子和脂质分子重新排布，细胞膜打开，细胞发生融合。

灭活：是指用物理或化学手段使病毒失去感染细胞的能力，但是并不破坏病毒的抗原结构。二、动物细胞融合概念：指两个或多个动物细胞结合形成一个细胞的过程。结果：形成单核的杂交细胞原理：细胞膜的流动性诱导方法：物理法：离心、振动、电激化学法：聚乙二醇（PEG)生物法：灭活的病毒

注意：动物细胞的融合也需要把多个两种细胞放在一起，让它们随机融合后，再从中筛选杂交细胞。

意义：突破了有性杂交方法的局限，使远缘杂交（种间、属间、科间、动植物之间）成为可能。三、单克隆抗体

长期以来，为了获得抗体，采用的是把某种抗原反复注射到动物体内，然后从动物血清中分离出所需抗体的方法。用这种方法获得的抗体，不仅产量低，而且抗体的特异性差，纯度低，反应不够灵敏。1、传统抗体的获得方法

在动物发生免疫反应的过程中，体内的多种B细胞可以产生多达百万种以上的特异性抗体，但是每个B细胞只分泌一种抗体。要想获得大量的单一抗体，必须用单个B细胞进行无性繁殖，即克隆。2、一个美丽的发现3、一个大胆的猜想

将能够产生特定抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。注射抗原B淋巴细胞骨髓瘤细胞融合专一抗体检验阳性选择性培养基筛选克隆化单克隆抗体专一抗体检验阳性用有限稀释法进行单克隆，再专一抗体检验阳性克隆化5、单克隆抗体的概念：

由单个B淋巴细胞进行无性繁殖形成的细胞群，产生的化学性质单一、特异性强的抗体。6、单克隆抗体的优点：特异性强、灵敏度高、产量大四、单克隆抗体的应用1、诊断试剂2、运载药物—“生物导弹”准确、高效、简易、快速抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体

在受精后不久，胎盘滋养层细胞就会分泌人绒毛膜促性腺激素(HCG)，是由受孕妇女体内胎盘产生的一种糖蛋白类激素，在孕妇的尿液中大量存在。而在非妊娠妇女尿液中几乎不含有。

早孕试纸其实是利用抗人绒毛膜促性腺激素单克隆抗体做为配体，固定在层析柱上，以胶体金为指示标记，检测尿液中的HCG浓度，来确诊妇女是否怀孕。阳性：出现两条红色条带。一条位于对照区C,另一条位于检测区T，表示已怀孕。阴性：仅在对照区C出现一条红色条带，在检测区T无红色条带出现，表示未怀孕。无效：5分钟在对照区C无红色条带出现，则测试失败或试纸已失效。

甲胎蛋白（AFP）是一种特异性较强的肿瘤标志物，用甲胎蛋白作为抗原免疫小鼠，制备抗AFP单克隆抗体，并与含有放射性同位素的标记物连接，单克隆抗体携带放射性标记物通过全身血液渗透到所有组织。由于肿瘤细胞表面的AFP会和单克隆抗体特异性的结合，所以放射性同位素标记物就不断积累在肿瘤上。通过一定的显影技术就可以发现肿瘤所在。生物导弹”：

用癌细胞作为抗原，免疫小鼠，制备抗癌细胞单克隆抗体，并与抗癌药物连接，便制成了生物导弹，注入患者体内，借助单克隆抗体的导向作用，将药物定向带到癌细胞所在位置，在原位杀死癌细胞。这样既不损伤正常细胞，又减少了药剂的用量。1．(2009年浙江理综)用动、植物成体的体细胞进行离体培养，下列叙述正确的是(

)A．都需用CO2培养箱B．都需用液体培养基C．都要在无菌条件下进行D．都可体现细胞的全能性解析：用动、植物成体的体细胞进行离体培养都必须在无菌条件下进行。用植物成体的体细胞进行离体培养获得新个体体现的是细胞的全能性，而动物体细胞离体培养主要是获得细胞的代谢产物。答案：C2．(2008年全国理综Ⅰ)下列关于细胞工程的叙述，错误的是(

)A．电刺激可诱导植物原生质体融合或动物细胞融合B．去除植物细胞的细胞壁和将动物组织分散成单个细胞均需酶处理C．小鼠骨髓瘤细胞和经抗原免疫小鼠的B淋巴细胞融合可制备单克隆抗体D．某种植物甲乙两品种的体细胞杂种与甲乙两品种杂交后代的染色体数目相同答案：D3．(2008年上海生物)制备单克隆抗体所采用的细胞工程技术包括(

)①细胞培养②细胞融合③胚胎移植④细胞核移植A．①②B．①③C．②③D．③④解析：单克隆抗体的制备流程：人工诱导经过免疫的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，再经筛选获得能产生特定抗体的杂交瘤细胞，通过培养获得的杂交瘤细胞得到单克隆抗体，整个过程不涉及胚胎移植和细胞核移植这两项技术。答案：A4．(天津理综)利用细胞工程方法，以SARS病毒核衣壳蛋白为抗原制备出单克隆抗体。下列叙述正确的是(

)A．用纯化的核衣壳蛋白反复注射到小鼠体内，产生的血清抗体为单克隆抗体B．体外培养单个效应B细胞(浆细胞)可以获得大量针对SARS病毒的单克隆抗体C．将等量效应B细胞(浆细胞)和骨髓瘤细胞混合，经PEG诱导融合后的细胞均为杂交瘤细胞D．利用该单克隆抗体与SARS病毒核衣壳蛋白特异性结合的方法可诊断出病毒感染者D5．用动物细胞工程技术获取单克隆抗体，下列实验步骤中错误的是(

)A．将抗原注入小鼠体内，获得能产生抗体的B淋巴细胞B．用纤维素酶处理B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞C．用聚乙二醇作诱导剂，促使能产生抗体的B淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合D．筛选杂交瘤细胞，并从中选出能产生所需抗体的细胞群，培养后提取单克隆抗体解析：用纤维素酶处理植物细胞是植物细胞工程中常用来除去细胞壁获得原生质体的方法，与动物细胞工程无关。答案：B6．(海南高考)某研究小组进行药物试验时，以动物肝细胞为材料，测定药物对体外培养细胞的毒性。供培养的细胞有甲、乙两种，甲细胞为肝肿瘤细胞，乙细胞为正常肝细胞。请回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)将数量相等的甲细胞和乙细胞分别置于培养瓶中培养，培养液及其他培养条件均相同。一段时间后，观察到甲细胞数量比乙细胞数量________。(2)在动物细胞培养时，通常在合成培养基中加入适量血清，其原因是____________________________________，细胞培养应在含5%CO2的恒温培养箱中进行，CO2的作用是_____________________。血清可以补充合成培养基中缺乏的物质维持培养液pH多(3)在两种细胞生长过程中，当乙细胞铺满瓶壁时，其生长________。药物试验需要大量细胞，两种细胞频繁传代，甲细胞比乙细胞可以传代的次数更______。若用动物的肝脏组织块制备肝细胞悬液，需用____________消化处理。(4)为了防止细胞培养过程中细菌的污染，可向培养液中加入适量的________。(5)已知癌基因X过量表达与肝肿瘤的发生密切相关，要试验一种抗肿瘤药物Y对甲细胞生长的影响，可将甲细胞分为A、B两组，A组细胞培养液中加入________，B组细胞培养液中加入无菌生理盐水，经培养后，从A、B两组收集等量细胞，通过分别检测X基因在A、B两组细胞中的________或________合成水平的差异，确定Y的药效。胰蛋白酶多抗生素停止mRNA蛋白质药物Y7、(2008年宁夏高考)回答下列有关动物细胞培养的问题：(1)在动物细胞培养过程中，当贴壁细胞分裂生长到细胞表面___________时，细胞会停止分裂增殖，这种现象称为细胞的___________。此时，瓶壁上形成的细胞层数是________。要使贴壁的细胞从瓶壁上分离下来，需要用酶处理，可用的酶是________________。(2)随着细胞传代次数的增多，绝大部分细胞分裂停止，进而出现_______________的现象；但极少数细胞可以连续增殖，其中有些细胞会因遗传物质发生改变而变成________细胞，该种细胞的黏着性________，细胞膜表面蛋白质(糖蛋白)的量___________。相互接触接触抑制胰岛蛋白酶单层减少不死性降低衰老甚至死亡(3)现用某种大分子染料，对细胞进行染色时，观察到死细胞被染色，而活细胞不染色，原因是______________________________________________(4)检查某种毒物是否能改变细胞染色体的数目，最好选用细胞分裂到________期的细胞用显微镜进行观察。(5)在细胞培养过程中，通常在________条件下保存细胞。因为在这种条件下，细胞中________的活性降低，细胞______________的速率降低。(6)给患者移植经细胞培养形成的皮肤组织后，发生了排斥现象，这是因为机体把移植的皮肤组织当作________进行攻击。酶

由于死细胞的膜丧失了选择透过性，大分子染料能够进入死细胞内而着色中超低温新陈代谢抗原8．单克隆抗体的制备过程如下图所示：(1)淋巴细胞能与骨髓瘤细胞融合成一个细胞，两种细胞膜也能“融合”在一起，说明细胞膜______________。此过程，常用_________作为诱导剂。(2)已知细胞合成DNA有D和S两条途径，其中D途径能被氨基嘌呤阻断。人淋巴细胞中有这两种DNA的合成途径，但一般不分裂增殖。鼠骨髓瘤细胞中尽管没有S途径，但能不断分裂增殖，将这两种细胞在试管中混合，加聚乙二醇促融，获得杂种细胞。请设计一种方法(不考虑机械方法)，从培养液中分离出杂交瘤细胞。方法：_______________________________________。聚乙二醇培养液中加入氨基嘌吟，收集增殖的细胞具有一定的流动性(3)杂交瘤细胞繁殖进行的是________分裂，其遗传性状_____________________________________。(4)杂交瘤细胞的体外培养与植物组织培养的培养基相比有何主要不同？_____________________________________。(5)单克隆抗体注入体内后可以自动追踪抗原(病原体或癌变细胞等)并与之结合，而绝不攻击任何正常细胞，故称为“生物导弹”，这是利用了___________________________________。(6)在单克隆抗体制备过程中，还应用了细胞工程中的_____________和______________两大技术。具有无限增殖能力，能产生特异性抗体动物细胞培养用的是液体培养基，且其中含有动物血清动物细胞培养抗原与抗体之间结合的高度特异性有丝动物细胞融合9.现有甲、乙两种可能有一定毒性的化学物质，实验室研究人员欲通过动物细胞培养的方法来鉴定它们是否有毒性并比较二者毒性的强弱。请你以一个研究人员的身份参与此项研究，完成下列实验报告并回答有关问题。Ⅰ.实验原理：_________________________________。根据这种变异细胞占全部培养细胞的百分数（以下称Q值），可判断该化学物质的毒性。Ⅱ.实验材料：活的小白鼠胚胎。Ⅲ.药品用具：略。有毒物质能诱导细胞产生变异Ⅳ.实验步骤（1）制备细胞悬浮液。（2）进行细胞培养①取A、B、C三个洁净的培养瓶，___________________。②向A培养瓶中加入一定量的化学物质甲，向B培养瓶中加入等量的化学物质乙，并将培养瓶摇匀。③向C瓶内___________________。（3）制作临时装片①取培养细胞，再加入动物细胞固定液以迅速杀死细胞并固定细胞。②静置一段时间后，分别从各培养瓶底部吸取适量的细胞悬浮液，滴在与培养瓶有相同编号的载玻片的中央，_______________________，3min～5min后，盖上盖玻片。用适宜浓度龙胆紫溶液染色加入等量蒸馏水消毒灭菌，加入等量的细胞悬浮液

（4）镜检和统计把临时装片放在显微镜下，先用低倍镜后用高倍镜，寻找处于__________期的细胞