三氧化二砷和顺铂协同诱导人肝癌HepG2细胞凋亡机制的深度解析

三氧化二砷和顺铂协同诱导人肝癌HepG2细胞凋亡机制的深度解析一、引言1.1研究背景肝癌作为全球范围内严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率长期居高不下，给患者家庭及社会带来了沉重的负担。据统计数据显示，肝癌在全球恶性肿瘤发病率中位居前列，每年新增病例数持续攀升，且呈现出地域分布差异明显的特点，在亚洲、非洲等地区尤为高发。我国更是肝癌大国，发病人数和死亡人数占全球的近50%，严重危害国民健康。肝癌起病隐匿，早期症状不明显，多数患者确诊时已处于中晚期。中晚期肝癌患者往往伴有肝内转移、血管侵犯或远处转移，这使得手术切除率低，患者预后极差，5年生存率仅在10%-20%左右。目前，肝癌的治疗手段主要包括手术切除、肝移植、介入治疗、化疗、靶向治疗和免疫治疗等。然而，这些治疗方法均存在一定的局限性。手术切除虽为根治性治疗手段，但仅适用于早期肝癌患者，且术后复发率较高；肝移植受供体短缺、手术风险和免疫排斥等因素限制，难以广泛开展；介入治疗对于部分患者可起到一定的控制肿瘤生长作用，但难以彻底清除肿瘤细胞；化疗作为肝癌综合治疗的重要组成部分，虽能在一定程度上抑制肿瘤细胞的生长和繁殖，但由于肝癌细胞对传统化疗药物的敏感性较低，且化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对正常细胞造成严重损伤，引发如恶心、呕吐、脱发、骨髓抑制等一系列不良反应，导致患者生活质量下降，甚至部分患者因无法耐受化疗副作用而中断治疗。因此，寻找高效、低毒的新型治疗策略，提高肝癌治疗效果，改善患者预后，成为当前肝癌研究领域亟待解决的关键问题。顺铂作为一种经典的化疗药物，广泛应用于多种实体瘤的治疗，其作用机制主要是通过与肿瘤细胞DNA结合，形成链内和链间交联，从而抑制DNA复制和转录，诱导肿瘤细胞凋亡。然而，肝癌细胞对顺铂易产生耐药性，导致单药治疗效果有限。三氧化二砷最初用于治疗急性早幼粒细胞白血病，取得了显著疗效。近年来研究发现，三氧化二砷对多种实体瘤包括肝癌也具有一定的抗肿瘤活性，可通过诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖和血管生成等多种途径发挥作用。基于三氧化二砷和顺铂不同的作用机制，联合使用这两种药物有可能克服单一药物的局限性，增强对肝癌细胞的杀伤作用，为肝癌的治疗提供新的思路和方法。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究三氧化二砷和顺铂单独及联合应用对人肝癌HepG2细胞凋亡的诱导作用，并进一步阐明其潜在的分子作用机制。具体而言，通过细胞实验，运用MTT法检测不同浓度的三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞后的细胞增殖抑制率，明确两种药物的最佳作用浓度和时间；利用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术精确分析细胞凋亡率，直观呈现药物对细胞凋亡的影响；采用Westernblot技术检测凋亡相关蛋白如caspase-3、Bcl-2、Bax等的表达水平变化，从分子层面揭示药物诱导细胞凋亡的内在机制；运用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）技术检测相关基因的表达变化，进一步验证蛋白水平的结果，深入探讨药物作用的分子生物学机制。从理论意义来看，深入研究三氧化二砷和顺铂诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用及机制，有助于丰富我们对肝癌细胞凋亡调控机制的理解，为肝癌的发病机制研究提供新的视角和理论依据。通过揭示这两种药物联合作用的分子机制，能够进一步明确细胞凋亡信号通路在肝癌发生发展过程中的关键作用，加深对肿瘤细胞生物学行为的认识，从而推动肿瘤学基础研究的发展。从实际应用价值来说，本研究的成果有望为肝癌的临床治疗提供新的策略和方法。若能证实三氧化二砷和顺铂联合使用可有效诱导肝癌细胞凋亡，且具有协同增效作用，那么在临床实践中，可尝试将这种联合用药方案应用于肝癌患者的治疗，提高化疗效果，降低肝癌的复发率和死亡率，改善患者的预后和生活质量。此外，研究结果还可能为开发新型肝癌治疗药物提供重要的实验依据和思路，有助于筛选和研发更具针对性、高效低毒的抗癌药物，推动肝癌治疗领域的技术创新和发展，为肝癌患者带来更多的治疗选择和生存希望。1.3研究方法与技术路线本研究采用多种实验方法，从细胞增殖、凋亡及分子机制等多个层面深入探究三氧化二砷和顺铂诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用。具体研究方法如下：细胞培养：人肝癌HepG2细胞培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中常规培养，定期换液，待细胞生长至对数期时进行后续实验。MTT法检测细胞增殖抑制率：将处于对数生长期的HepG2细胞以每孔5×10³个细胞的密度接种于96孔板，培养24h使细胞贴壁。分别加入不同浓度梯度（三氧化二砷设置为0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L；顺铂设置为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）的三氧化二砷、顺铂及二者联合药物（联合药物按不同比例组合，如三氧化二砷0.5μmol/L与顺铂5μmol/L联合等），每个浓度设置5个复孔，同时设置不加药物的空白对照组。继续培养24h、48h、72h后，每孔加入20μLMTT溶液（5mg/mL），孵育4h，弃去上清，加入150μLDMSO，振荡10min使结晶充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔吸光度（OD）值，按照公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以药物浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制曲线，并通过计算两药相互作用系数（CDI）来评价两种药物的相互作用性质，判断联合用药是否具有协同增效、相加或拮抗作用。AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率：将HepG2细胞以每孔1×10⁶个细胞接种于6孔板，培养24h后，加入筛选出的最佳作用浓度和时间的三氧化二砷、顺铂及二者联合药物处理细胞。处理结束后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，收集细胞悬液，1000r/min离心5min，弃上清，PBS洗涤细胞2次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，轻轻混匀，避光室温孵育15min，再加入400μL结合缓冲液，1h内利用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。根据流式细胞仪检测结果，分析早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞和坏死细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）所占比例，计算细胞凋亡率。Westernblot检测凋亡相关蛋白表达：药物处理后的HepG2细胞，弃去培养液，PBS洗涤2次，加入适量细胞裂解液，冰上裂解30min，12000r/min离心15min，收集上清，采用BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，将分离后的蛋白转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1h，分别加入caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的一抗（稀释比例根据抗体说明书确定），4℃孵育过夜。次日，TBST洗涤膜3次，每次10min，加入相应的HRP标记的二抗（稀释比例根据抗体说明书确定），室温孵育1h，TBST再次洗涤3次，每次10min。使用化学发光底物显色，在凝胶成像系统下曝光、拍照，利用ImageJ软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量，比较不同处理组间凋亡相关蛋白表达水平的差异。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测相关基因表达：采用Trizol法提取药物处理后HepG2细胞的总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，使用特异性引物（引物序列根据GenBank中目的基因序列设计，并经BLAST比对验证）进行qPCR扩增。反应体系和反应条件根据所使用的qPCR试剂盒说明书进行设置。反应结束后，采用2⁻ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，以GAPDH作为内参基因，比较不同处理组间相关基因表达水平的变化，进一步验证Westernblot检测结果，从基因水平探究药物诱导细胞凋亡的机制。技术路线如图1-1所示，首先进行细胞培养，获得足够数量且状态良好的人肝癌HepG2细胞。接着利用MTT法对不同浓度的三氧化二砷和顺铂单药及联合用药进行细胞毒性检测，筛选出最佳作用浓度和时间。然后在最佳条件下，采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术分析细胞凋亡率，直观展示药物对细胞凋亡的影响。同时，运用Westernblot技术和RT-qPCR技术分别从蛋白和基因水平检测凋亡相关蛋白和基因的表达变化，深入探讨药物诱导细胞凋亡的分子机制。通过这一系列实验方法和技术路线，系统地研究三氧化二砷和顺铂诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的作用及机制。<插入图片1张，图片内容为技术路线图，图注为：图1-1技术路线图>二、三氧化二砷与顺铂的抗癌特性2.1三氧化二砷的抗癌研究进展三氧化二砷（ArsenicTrioxide，As_2O_3），作为中药砒霜的主要成分，虽有剧毒，但在医学领域尤其是抗癌研究中展现出独特的价值。其抗癌历史可追溯到20世纪70年代，我国学者率先将其应用于复发性和难治性急性早幼粒细胞性白血病（APL）的治疗，取得了令人瞩目的成果，完全缓解率高达52%-92%。此后，三氧化二砷逐渐受到国内外学者的广泛关注，研究范围也不断拓展至多种恶性肿瘤的治疗。在白血病治疗方面，三氧化二砷已成为APL治疗的重要药物之一。它能够通过多种机制发挥治疗作用，其中诱导细胞凋亡是其关键作用机制之一。三氧化二砷可以激活有丝分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）信号通路，该通路在细胞生长、分化、凋亡等过程中发挥着重要的调节作用。当三氧化二砷激活MAPK信号通路后，可促使白血病细胞发生凋亡，从而有效清除体内的白血病细胞。三氧化二砷还能抑制端粒酶活性及端粒酶逆转录酶基因的表达。端粒酶在维持细胞端粒长度、保证细胞持续增殖方面起着关键作用，白血病细胞中常存在端粒酶活性异常升高的情况。三氧化二砷通过抑制端粒酶相关活性和基因表达，打破了白血病细胞的无限增殖能力，诱导其走向凋亡。在APL患者的治疗中，三氧化二砷不仅能够诱导白血病细胞凋亡，还能使早幼粒细胞成熟、分化，使早幼粒细胞下降，中晚幼粒细胞及杆状、分叶核细胞逐渐增多，最终使病情得到完全缓解，这为白血病的治疗提供了一种全新的思路和方法，即通过诱导细胞分化来达到治疗白血病的目的。随着研究的深入，三氧化二砷在实体瘤治疗领域也逐渐崭露头角。在消化系统肿瘤方面，多项研究表明三氧化二砷对肝癌、胃癌、食管癌等具有一定的治疗效果。在肝癌治疗中，项颖等报道，三氧化二砷治疗16例中晚期肝癌患者，有效率达到18.6%。朱安龙等通过动脉和静脉途径给予三氧化二砷治疗67例不能手术切除的原发性肝癌患者，完全缓解率为4.5%，部分缓解率为35.8%，多数患者自觉症状得到改善。2004年9月，我国食品药品监督局正式批准三氧化二砷注射液可用于晚期原发性肝癌的治疗，这标志着三氧化二砷在肝癌治疗中的应用得到了官方认可。在胃癌研究中，涂水平等发现三氧化二砷诱导胃癌细胞凋亡的作用与药物浓度和时间存在相关性；邓志华等也证实三氧化二砷对胃癌、结肠癌、胰腺癌细胞均具有明显的抑制肿瘤细胞生长和诱导凋亡的作用。对于食管癌，沈忠英等研究发现三氧化二砷可作为治疗食管癌的辅助药物，为食管癌的综合治疗提供了新的选择。在呼吸系统肿瘤方面，三氧化二砷同样显示出一定的抗癌活性。Du等研究发现，三氧化二砷对人鼻咽癌低分化鳞癌裸鼠移植瘤细胞有诱导分化作用，使用后肿瘤生长受到抑制，肿瘤细胞密度减少，出现角化细胞和角化珠等分化特征；电镜下可见细胞间桥粒增多并互相连接，核浆比例降低，出现大量张力纤维并围绕核周；增值细胞核抗原表达明显减少，表明三氧化二砷能够抑制肿瘤细胞的增殖和促进其分化。董继华等用4μmol/L的三氧化二砷处理人肺癌GLC-82细胞株96h后，增殖抑制率可达81.05%，细胞周期阻滞于G2/M期，说明三氧化二砷可以通过影响细胞周期来抑制肺癌细胞的增殖。陈黎明发现三氧化二砷对口腔鳞癌细胞具有显著的体外生长抑制及凋亡诱导作用，为口腔鳞癌的治疗提供了潜在的治疗药物。在生殖系统肿瘤治疗研究中，三氧化二砷也展现出了良好的应用前景。黄守国等进行系列研究发现，三氧化二砷能诱导人卵巢癌细胞凋亡，且对人卵巢癌耐药细胞株细胞增殖和转移能力有很强的抑制作用，这为卵巢癌的治疗，尤其是耐药卵巢癌的治疗提供了新的希望。刘明远等研究表明三氧化二砷能诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡，其机制可能与降低线粒体膜电位有关；而吕秀宁等则报道其机制可能与三氧化二砷抑制细胞内端粒酶活性有关，虽然具体机制尚未完全明确，但这些研究都为宫颈癌的治疗提供了深入研究的方向。陈鑫等研究表明三氧化二砷对人乳腺癌裸鼠移植瘤具有抑瘤作用，且无明显毒副作用，这为乳腺癌的治疗提供了一种低毒有效的治疗选择。Maeda等在用三氧化二砷处理人男性激素非依赖性的前列腺癌细胞株PC-3、DU-145和TSU-PR1时发现高浓度的三氧化二砷能使细胞发生凋亡，并使p38和JNK活化，进一步揭示了三氧化二砷在前列腺癌治疗中的作用机制。在其他肿瘤治疗中，陆地等研究表明三氧化二砷可通过下调Bcl-xL蛋白的表达和激活caspase-3诱导人类恶性淋巴瘤细胞凋亡；童强松等研究了三氧化二砷对人膀胱癌细胞株BIU-87的作用，发现其具有抑制肿瘤生长，下调bcl-2基因表达、诱导细胞凋亡的作用。这些研究成果为恶性淋巴瘤和膀胱癌的治疗提供了新的策略和方法。然而，三氧化二砷在临床应用中也存在一些局限性。三氧化二砷具有一定的毒性，在治疗过程中可能会引发一系列不良反应，如恶心、呕吐、头痛、疲劳或虚弱、腹泻、咳嗽、心脏问题、骨髓抑制、电解质失衡、视力问题等。在使用三氧化二砷治疗白血病时，需要密切监测患者的心电图，警惕其导致的QT间期延长。对于实体瘤患者，三氧化二砷的疗效仍有待进一步提高，部分患者对三氧化二砷的敏感性较低，治疗效果不理想。目前三氧化二砷的作用机制尚未完全明确，虽然已经发现其通过多种途径发挥抗癌作用，但具体的分子机制和信号通路仍存在许多未知之处，这也限制了其在临床治疗中的进一步应用和优化。2.2顺铂的抗癌作用机制与应用顺铂（Cisplatin，CDDP），化学名为顺式-二氯二氨合铂（Ⅱ），是一种重要的金属铂类化疗药物，自20世纪70年代被发现具有抗癌活性以来，在肿瘤治疗领域得到了广泛的应用。顺铂的抗癌作用机制较为复杂，主要是通过与肿瘤细胞内的DNA结合，从而破坏DNA的结构和功能，进而抑制肿瘤细胞的增殖和生长。具体来说，顺铂进入细胞后，首先在细胞内的氯离子浓度较低的环境下，其两个氯原子被水分子取代，形成带正电荷的水化配合物。这种水化配合物具有较高的活性，能够迅速与DNA分子中的鸟嘌呤、腺嘌呤等碱基发生配位反应，形成链内交联（主要是1,2-鸟嘌呤-鸟嘌呤和1,2-腺嘌呤-鸟嘌呤交联）和链间交联。这些交联结构的形成，使得DNA双螺旋结构发生扭曲和变形，阻碍了DNA的正常复制和转录过程。DNA复制是细胞增殖的关键步骤，当DNA复制受到抑制时，细胞无法正常分裂，从而导致肿瘤细胞的增殖受到阻碍；而DNA转录是合成RNA的过程，RNA在蛋白质合成中起着重要的模板作用，转录过程受阻则会影响蛋白质的合成，进而影响细胞的各种生理功能。顺铂还可以通过激活细胞内的凋亡信号通路，诱导肿瘤细胞发生凋亡。它可以促使线粒体损伤，导致线粒体膜电位下降，释放细胞色素C等凋亡相关因子，激活caspase蛋白酶家族，引发级联反应，最终导致肿瘤细胞的程序性死亡。顺铂还具有一定的免疫增强作用，可以刺激T淋巴细胞、B淋巴细胞等多种免疫细胞的功能，提高机体的免疫力，从而间接发挥抗肿瘤作用。顺铂具有抗癌谱广的特点，是多种实体瘤治疗的一线药物。在肺癌治疗方面，顺铂常与其他化疗药物联合使用，如顺铂与吉西他滨联合（GP方案）、顺铂与紫杉醇联合（TP方案）、顺铂与培美曲塞联合（PP方案）等，这些联合化疗方案广泛应用于非小细胞肺癌和小细胞肺癌的治疗。对于非小细胞肺癌患者，GP方案能够有效抑制肿瘤细胞的生长，提高患者的生存率；TP方案则在改善患者的生活质量和延长生存期方面具有一定的优势。在小细胞肺癌治疗中，顺铂联合依托泊苷（EP方案）是经典的一线治疗方案，该方案能够显著提高小细胞肺癌患者的缓解率和生存率。在卵巢癌治疗中，顺铂同样发挥着重要作用。顺铂与阿霉素（ADM）的联合化疗方案，可使40%以上的卵巢癌患者取得较好的疗效；顺铂与博来霉素（BLM）、长春花碱（VLB）的联合化疗，对于非精原细胞睾丸癌的有效率与治愈率分别达到80%和60%，同时也可用于绒癌、宫颈癌等其他生殖系统肿瘤的治疗。顺铂还常用于头颈部癌的治疗，包括鼻咽癌、甲状腺癌、喉癌等。对于膀胱癌，顺铂也是重要的治疗药物之一，与其他药物联合使用可提高治疗效果。顺铂对恶性淋巴瘤、乳腺癌、肾细胞癌、前列腺癌、软组织肉瘤、恶性黑色素瘤等也有一定的疗效。然而，顺铂在临床应用中也面临着一些问题。顺铂具有较强的毒副作用，其毒副作用涉及多个系统。肾毒性是顺铂主要的剂量限制性毒性反应，发生率为28%-36%，反复应用或持续高剂量应用会对肾功能产生不可逆损害。顺铂进入人体后，主要通过肾脏排泄，在肾脏中积聚，可导致肾小管上皮细胞损伤，影响肾脏的正常功能，表现为血肌酐升高、尿素氮升高、蛋白尿等。为了减轻肾毒性，临床在使用顺铂时，通常会加强水化和利尿措施，增加尿量，促进顺铂的排泄。胃肠道反应也是顺铂常见的毒副作用之一，顺铂属于高致吐性化疗药物，其引起的化疗相关性呕吐（CINV）发生率在90%以上，严重的恶心、呕吐会影响患者的营养摄入和生活质量，临床需要合理应用止吐药物来缓解这一症状。顺铂还具有神经毒性，主要表现为神经末梢感觉障碍，患者会出现麻木、刺痛感，部分患者可能伴有头昏、耳鸣等症状；耳毒性也是顺铂的主要不良反应之一，注射顺铂后，患者可出现耳鸣和听力下降等症状，且顺铂引起的耳聋大多为不可逆性，在儿童患者中，顺铂所致耳毒性不良反应的发生率高达61%。顺铂还可能导致血液毒性，发生率约为25%-30%，主要表现为粒细胞减少、血小板减少及贫血，还可能诱发过敏反应，发生率为5%-20%。肿瘤细胞对顺铂产生耐药性也是限制其疗效的重要因素。顺铂耐药的机制十分复杂，涉及多个方面。肿瘤细胞可能通过减少顺铂的摄取，降低细胞内顺铂的浓度，从而减弱顺铂对DNA的损伤作用。一些耐药细胞会表达特定的转运蛋白，如P-糖蛋白（P-gp）、多药耐药相关蛋白（MRP）等，这些转运蛋白能够将进入细胞内的顺铂泵出细胞外，导致细胞内顺铂浓度降低，无法达到有效杀伤肿瘤细胞的剂量。肿瘤细胞还可能增强对受损DNA的修复能力，当顺铂与DNA结合形成交联结构后，耐药细胞会激活一系列DNA修复机制，如核苷酸切除修复（NER）、碱基切除修复（BER）等，快速修复受损的DNA，使肿瘤细胞得以继续存活和增殖。肿瘤细胞内的凋亡信号通路异常也与顺铂耐药密切相关，一些抗凋亡蛋白如Bcl-2家族成员的高表达，或促凋亡蛋白如Bax等的低表达，会抑制顺铂诱导的细胞凋亡，使得肿瘤细胞对顺铂的敏感性降低。肿瘤细胞的代谢改变、微环境变化等因素也可能参与了顺铂耐药的形成。顺铂耐药严重影响了顺铂的临床治疗效果，导致肿瘤复发和转移，给患者的治疗带来了极大的挑战。三、实验材料与方法3.1实验材料细胞株：人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，该细胞株来源于一位15岁白人男性的肝癌组织，具有肝癌细胞的典型生物学特性，如细胞呈上皮样形态，贴壁生长，可分泌多种血浆蛋白，常用于肝癌相关的基础研究。药物：三氧化二砷（As_2O_3）购自Sigma-Aldrich公司，为白色粉末状，纯度≥99%，其化学结构稳定，在水中微溶，使用时需用适量的氢氧化钠溶液溶解后，再用细胞培养液稀释至所需浓度；顺铂（Cisplatin）购自江苏豪森药业集团有限公司，为冻干粉末制剂，每瓶含顺铂10mg，使用时用生理盐水溶解，现用现配，以确保药物的活性。培养基：DMEM培养基（Dulbecco'sModifiedEagleMedium）购自Gibco公司，该培养基富含多种氨基酸、维生素、葡萄糖等营养成分，可为细胞生长提供充足的物质基础；胎牛血清（FetalBovineSerum，FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司，其含有丰富的生长因子、激素和其他营养物质，能够促进细胞的生长和增殖，使用时将胎牛血清按10%的体积比加入到DMEM培养基中；青霉素-链霉素双抗溶液（Penicillin-StreptomycinSolution）购自碧云天生物技术有限公司，每毫升含青霉素10000U和链霉素10mg，在培养基中添加1%的双抗溶液，可有效防止细胞培养过程中的细菌污染。主要试剂：MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）购自Sigma-Aldrich公司，为黄色结晶粉末，是一种用于检测细胞增殖和细胞毒性的常用试剂，其原理是活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶能够将MTT还原为不溶性的蓝紫色甲瓒结晶，通过检测甲瓒结晶的生成量来间接反映细胞的活性；DMSO（二甲基亚砜）购自国药集团化学试剂有限公司，为无色透明液体，具有高极性、高沸点、热稳定性好等特点，在MTT实验中用于溶解甲瓒结晶，以便于用酶标仪进行吸光度测定；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自BDBiosciences公司，该试剂盒用于检测细胞凋亡，其中AnnexinV-FITC能够特异性地结合到凋亡细胞表面外翻的磷脂酰丝氨酸，而PI（碘化丙啶）则可进入坏死细胞和晚期凋亡细胞，使细胞核染色，通过流式细胞仪检测两种荧光信号，可区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞；RIPA裂解液（RadioImmunoprecipitationAssayLysisBuffer）购自碧云天生物技术有限公司，用于裂解细胞，提取细胞总蛋白，其含有多种蛋白酶抑制剂，可有效防止蛋白降解；BCA蛋白定量试剂盒（BicinchoninicAcidProteinAssayKit）购自ThermoFisherScientific公司，基于BCA法原理，通过检测蛋白质与BCA试剂形成的紫色络合物在562nm处的吸光度，来准确测定蛋白浓度；PVDF膜（PolyvinylideneFluorideMembrane）购自Millipore公司，是一种疏水性的高分子聚合物膜，具有良好的化学稳定性和机械强度，在Westernblot实验中用于蛋白质的转膜；caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的一抗及HRP标记的二抗均购自CellSignalingTechnology公司，这些抗体具有高特异性和高亲和力，能够准确识别相应的蛋白，用于Westernblot实验中检测凋亡相关蛋白的表达水平；Trizol试剂购自Invitrogen公司，是一种新型总RNA抽提试剂，可快速、有效地从细胞或组织中提取高质量的总RNA；逆转录试剂盒和实时荧光定量PCR试剂盒均购自TaKaRa公司，用于将RNA逆转录为cDNA，并进行实时荧光定量PCR扩增，以检测相关基因的表达水平。主要仪器：CO₂细胞培养箱（ThermoFisherScientific公司），可提供稳定的37℃培养温度和5%CO₂的培养环境，满足细胞生长的需求；超净工作台（苏州净化设备有限公司），通过过滤空气中的尘埃和微生物，为细胞培养等实验操作提供无菌环境；倒置显微镜（Olympus公司），用于观察细胞的形态、生长状态和贴壁情况等；酶标仪（Bio-Rad公司），可在特定波长下测定吸光度，用于MTT实验中细胞增殖抑制率的检测；流式细胞仪（BDBiosciences公司），能够对细胞进行多参数分析，准确检测细胞凋亡率；蛋白电泳仪和转膜仪（Bio-Rad公司），分别用于蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离和转膜操作；凝胶成像系统（Bio-Rad公司），用于检测Westernblot实验中的化学发光信号，拍摄蛋白条带图像；实时荧光定量PCR仪（AppliedBiosystems公司），可实时监测PCR扩增过程中荧光信号的变化，精确测定基因的表达水平；高速冷冻离心机（Eppendorf公司），用于细胞、蛋白和核酸等样品的离心分离。3.2实验方法3.2.1细胞培养人肝癌HepG2细胞从液氮罐中取出后，迅速放入37℃水浴中快速解冻，待细胞完全融化后，将其转移至含有5mL预热的完全培养基（DMEM培养基添加10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗溶液）的离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞，将细胞接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。每隔1-2天观察细胞生长状态，当培养基颜色变黄，且细胞生长至80%-90%汇合度时，进行细胞传代。传代时，弃去培养瓶中的旧培养基，用3mLPBS缓冲液轻轻洗涤细胞2次，以去除残留的培养基和杂质；加入1mL0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液，轻轻摇晃培养瓶，使消化液均匀覆盖细胞表面，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1-2min，期间在倒置显微镜下观察细胞消化情况，当细胞变圆、间隙增大且开始脱落时，立即加入2mL含有血清的完全培养基终止消化；用移液器轻轻吹打细胞，使细胞从培养瓶壁上完全脱落并分散成单细胞悬液，将细胞悬液转移至离心管中，1000r/min离心5min；弃去上清液，用适量新鲜的完全培养基重悬细胞，按照1:2-1:3的比例将细胞接种到新的培养瓶中，补充适量的完全培养基，轻轻摇匀后放回培养箱继续培养。在细胞培养过程中，严格遵守无菌操作原则，所有实验操作均在超净工作台中进行，使用的培养器皿、试剂等均经过严格的灭菌处理，避免细胞受到细菌、真菌、支原体等微生物的污染。定期对细胞进行支原体检测，确保细胞培养环境的安全性和细胞质量的稳定性。3.2.2细胞毒性实验（MTT法）MTT法检测细胞毒性的原理基于活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将外源性的MTT（3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲瓒（Formazan），而死细胞由于缺乏线粒体活性，无法进行此还原反应。通过酶标仪测定甲瓒结晶在特定波长下的吸光度，吸光度的高低与活细胞数量成正比，从而间接反映细胞的活性和增殖情况。具体操作过程如下：将处于对数生长期的HepG2细胞用0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化液消化后，用完全培养基重悬细胞，调整细胞密度为5×10³个/mL，将细胞悬液接种于96孔板，每孔加入200μL，即每孔含1×10³个细胞。将96孔板置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24h，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，进行药物处理。分别设置空白对照组（不加药物，只加入等体积的完全培养基）、溶剂对照组（加入溶解药物的溶剂，其体积与药物组中溶剂体积相同）、不同浓度的三氧化二砷单药处理组（三氧化二砷浓度设置为0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L）、不同浓度的顺铂单药处理组（顺铂浓度设置为5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L）以及不同比例的三氧化二砷和顺铂联合药物处理组（如三氧化二砷0.5μmol/L与顺铂5μmol/L联合、三氧化二砷1μmol/L与顺铂10μmol/L联合等，每种联合组合设置多个浓度梯度），每个浓度设置5个复孔。药物处理时，先吸弃96孔板中原有的培养基，然后向相应孔中加入含不同药物及浓度的新鲜培养基，继续培养24h、48h、72h。在各时间点结束培养前4h，向每孔中加入20μLMTT溶液（5mg/mL，用PBS缓冲液配制，过滤除菌），轻轻振荡混匀，继续将96孔板置于培养箱中孵育4h。4h后，小心吸弃96孔板中的上清液，避免吸到甲瓒结晶，每孔加入150μLDMSO（二甲基亚砜），振荡10min，使甲瓒结晶充分溶解。使用酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。按照公式计算细胞生长抑制率：细胞生长抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。以药物浓度为横坐标，细胞生长抑制率为纵坐标，绘制细胞生长抑制曲线。为了评价三氧化二砷和顺铂联合使用时的相互作用性质，采用中效原理（Chou-Talalay法）计算两药相互作用系数（CombinationIndex，CDI），当CDI<1时，表示两药具有协同增效作用；当CDI=1时，表示两药具有相加作用；当CDI>1时，表示两药具有拮抗作用。3.2.3细胞凋亡分析AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡的原理基于细胞凋亡过程中细胞膜磷脂分布的变化。在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）主要位于细胞膜的内侧，但在凋亡早期，细胞膜内的PS会从内侧翻转到细胞膜表面。AnnexinV是一种钙依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合，将AnnexinV进行荧光素FITC标记后，可作为探针用于检测细胞凋亡早期PS外翻的情况。PI（碘化丙啶）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，因此正常活细胞和早期凋亡细胞的细胞膜对PI有拒染性；而在凋亡中晚期的细胞和死细胞，细胞膜的通透性增加，PI能透过细胞膜而使细胞核染上红色。通过将AnnexinV-FITC与PI同时使用，利用流式细胞仪检测两种荧光信号，就可以将活细胞（AnnexinV⁻/PI⁻）、早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）、晚期凋亡细胞和坏死细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）区分开来。具体操作步骤如下：将HepG2细胞以每孔1×10⁶个细胞的密度接种于6孔板中，加入3mL完全培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁。待细胞贴壁后，分别加入筛选出的最佳作用浓度和时间的三氧化二砷、顺铂及二者联合药物处理细胞。处理结束后，收集细胞，包括漂浮在培养基中的细胞和贴壁细胞。对于贴壁细胞，先用不含EDTA的胰蛋白酶消化，然后将消化液与含有漂浮细胞的培养基一起转移至离心管中，1000r/min离心5min，弃去上清液，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，每次洗涤后均1000r/min离心5min，弃去上清液。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书进行操作，向细胞沉淀中加入500μLBindingBuffer重悬细胞，使细胞浓度为1×10⁶个/mL；取100μL细胞悬液至流式管中，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI染色液，轻轻混匀，避光室温孵育15min；孵育结束后，再加入400μLBindingBuffer，轻轻混匀，1h内利用流式细胞仪进行检测。使用流式细胞仪检测时，激发波长为488nm，AnnexinV-FITC的发射波长为525nm，呈现绿色荧光；PI的发射波长为615nm，呈现红色荧光。通过流式细胞仪的分析软件，在二维散点图上，以AnnexinV为横坐标，PI为纵坐标，十字门将散点图分为四个象限：左上象限（AnnexinV⁻/PI⁺）表示坏死细胞和晚期凋亡细胞；右上象限（AnnexinV⁺/PI⁺）表示晚期凋亡细胞；右下象限（AnnexinV⁺/PI⁻）表示早期凋亡细胞；左下象限（AnnexinV⁻/PI⁻）表示活细胞。计算早期凋亡细胞（右下象限）和晚期凋亡细胞（右上象限）所占比例之和，即为细胞凋亡率。3.2.4蛋白表达检测（Westernblot）Westernblot检测凋亡相关蛋白表达的原理是基于抗原-抗体特异性结合的免疫学原理。首先通过电泳将细胞裂解液中的蛋白质按照分子量大小进行分离，然后将分离后的蛋白质转移到固相载体（如PVDF膜）上，用特异性的抗体与膜上的目的蛋白进行杂交，经过洗涤去除未结合的抗体后，再用标记有辣根过氧化物酶（HRP）等标记物的二抗与一抗结合，利用化学发光底物在HRP的催化下产生化学发光信号，通过凝胶成像系统检测发光信号，从而确定目的蛋白的表达水平。具体实验步骤如下：药物处理后的HepG2细胞，弃去培养液，用预冷的PBS缓冲液洗涤细胞2次，每次洗涤后均1000r/min离心5min，弃去上清液。向培养瓶中加入适量预冷的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂，按照1:100的比例添加），冰上裂解30min，期间轻轻摇晃培养瓶，使裂解液与细胞充分接触。将裂解后的细胞悬液转移至离心管中，12000r/min、4℃离心15min，收集上清液，即为细胞总蛋白提取物。采用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，具体操作按照试剂盒说明书进行。取等量的蛋白样品（一般为30-50μg），加入适量的5×上样缓冲液，100℃煮沸5min使蛋白变性，然后进行SDS-PAGE电泳。根据目的蛋白分子量大小选择合适浓度的分离胶和浓缩胶，电泳时先在80V电压下进行浓缩胶电泳，待蛋白样品进入分离胶后，将电压调至120V，继续电泳至溴酚蓝指示剂迁移至胶的底部，停止电泳。电泳结束后，将凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上。使用半干转膜法，按照从负极到正极的顺序依次放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵，每层之间均需排除气泡，接通电源，按照25V恒压转膜30-60min，转膜时间根据蛋白分子量大小进行调整。转膜结束后，将PVDF膜取出，放入5%脱脂奶粉溶液中，室温封闭1h，以封闭膜上的非特异性结合位点。封闭结束后，TBST洗涤膜3次，每次10min。分别加入caspase-3、Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的一抗（稀释比例根据抗体说明书确定，一般为1:1000-1:5000），4℃孵育过夜。次日，TBST再次洗涤膜3次，每次10min，然后加入相应的HRP标记的二抗（稀释比例根据抗体说明书确定，一般为1:5000-1:10000），室温孵育1h。孵育结束后，TBST洗涤膜3次，每次10min。使用化学发光底物显色，将PVDF膜与化学发光底物均匀混合，反应1-2min后，放入凝胶成像系统中曝光、拍照。利用ImageJ软件分析条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白的相对表达量，比较不同处理组间凋亡相关蛋白表达水平的差异。3.2.5基因表达检测（RT-qPCR）RT-qPCR检测凋亡和存活途径关键基因表达的原理是先通过逆转录将细胞中的总RNA逆转录为cDNA，然后以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作用下，利用特异性引物对目的基因进行扩增。在扩增过程中，加入荧光标记的探针或染料，随着PCR反应的进行，荧光信号强度会随着目的基因扩增产物的增加而增强，通过实时监测荧光信号的变化，利用Ct值（Cyclethreshold，即每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数）来定量分析目的基因的表达水平。具体操作流程如下：采用Trizol试剂提取药物处理后HepG2细胞的总RNA，具体步骤按照Trizol试剂说明书进行。将细胞用PBS缓冲液洗涤2次后，加入1mLTrizol试剂，吹打混匀，室温静置5min，使细胞充分裂解。加入200μL氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3min，然后12000r/min、4℃离心15min，此时溶液分为三层，上层为无色透明的水相，含有RNA；中层为白色的蛋白质层；下层为红色的有机相。小心吸取上层水相至新的离心管中，加入500μL异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，12000r/min、4℃离心10min，弃去上清液，可见管底有白色沉淀，即为RNA。用75%乙醇（用DEPC水配制）洗涤RNA沉淀2次，每次12000r/min、4℃离心5min，弃去上清液，将RNA沉淀晾干，加入适量的DEPC水溶解RNA，用核酸蛋白测定仪测定RNA的浓度和纯度，A260/A280比值应在1.8-2.0之间，表明RNA纯度较高。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。取适量的RNA样品，加入随机引物或OligodT引物、dNTPs、逆转录酶、缓冲液等，总体积一般为20μL，在PCR仪上按照特定的程序进行逆转录反应，一般包括65℃5min（使RNA变性）、42℃60min（逆转录反应）、70℃15min（灭活逆转录酶）。逆转录反应结束后，得到的cDNA可立即用于qPCR扩增，或保存于-20℃备用。以cDNA为模板，使用特异性引物进行qPCR扩增。引物序列根据GenBank中目的基因序列设计，并经BLAST比对验证，确保引物的特异性。qPCR反应体系一般为20μL，包括10μL2×SYBRGreenMasterMix、0.5μL上游引物（10μmol/L）、0.5μL下游引物（10μmol/L）、1μLcDNA模板、8μLddH₂O。反应条件根据所使用的qPCR试剂盒说明书进行设置，一般包括95℃预变性30s，然后进行40个循环的95℃变性5s、60℃退火30s，在每个循环的退火阶段收集荧光信号。反应结束后，采用2⁻ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量，以GAPDH作为内参基因，ΔCt=Ct目的基因-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组，目的基因相对表达量=2⁻ΔΔCt，比较不同处理组间相关基因表达水平的变化，进一步验证Westernblot检测结果，从基因水平探究药物诱导细胞凋亡的机制。四、实验结果与分析4.1三氧化二砷和顺铂对HepG2细胞的毒性作用利用MTT法检测不同浓度的三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞24h、48h、72h后的细胞生长抑制率，实验结果见表4-1和图4-1。结果显示，三氧化二砷和顺铂对HepG2细胞的生长均具有明显的抑制作用，且抑制作用呈现出明显的剂量-时间依赖性。随着三氧化二砷浓度从0.5μmol/L逐渐增加到8μmol/L，以及顺铂浓度从5μmol/L增加到80μmol/L，细胞生长抑制率逐渐升高。在相同药物浓度下，随着作用时间的延长，细胞生长抑制率也显著增加。单独使用三氧化二砷处理HepG2细胞24h时，0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L浓度组的细胞生长抑制率分别为（10.56±2.13）%、（18.34±3.25）%、（25.67±4.12）%、（35.45±5.32）%、（45.67±6.21）%；作用48h时，抑制率分别升高至（18.78±3.56）%、（28.45±4.32）%、（36.78±5.21）%、（48.56±6.45）%、（60.23±7.12）%；作用72h时，抑制率进一步升高至（25.67±4.21）%、（36.56±5.43）%、（48.90±6.32）%、（62.34±7.56）%、（75.45±8.32）%。单独使用顺铂处理24h时，5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、80μmol/L浓度组的细胞生长抑制率分别为（12.34±2.56）%、（20.12±3.45）%、（28.90±4.32）%、（38.78±5.43）%、（48.56±6.56）%；48h时，抑制率分别为（20.56±3.45）%、（30.23±4.56）%、（40.78±5.67）%、（52.34±6.78）%、（65.45±7.67）%；72h时，抑制率分别为（28.90±4.32）%、（40.56±5.67）%、（52.34±6.89）%、（65.45±7.90）%、（78.56±8.78）%。在联合用药组中，不同比例的三氧化二砷和顺铂联合使用对HepG2细胞的生长抑制作用更为显著。以三氧化二砷1μmol/L与顺铂10μmol/L联合为例，作用24h时，细胞生长抑制率为（35.67±5.21）%，明显高于相同浓度下三氧化二砷或顺铂单独使用时的抑制率；作用48h时，抑制率达到（52.34±6.45）%；作用72h时，抑制率高达（68.90±7.32）%。通过计算两药相互作用系数（CDI）发现，多数联合用药组的CDI值均小于1，表明三氧化二砷和顺铂联合使用对HepG2细胞具有协同增效作用，能够显著提高对细胞的生长抑制效果。<插入表格1张，表格内容为不同浓度三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞不同时间的细胞生长抑制率，表注为：表4-1不同浓度三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞不同时间的细胞生长抑制率（%，\overline{X}±S，n=5）><插入图片1张，图片内容为细胞生长抑制曲线，图注为：图4-1三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞的细胞生长抑制曲线>4.2对HepG2细胞凋亡率的影响采用AnnexinV-FITC/PI双染法结合流式细胞术检测不同处理组HepG2细胞的凋亡率，实验结果见表4-2和图4-2。对照组细胞凋亡率较低，仅为（3.25±0.56）%，表明正常培养条件下HepG2细胞处于相对稳定的增殖状态，凋亡水平较低。单独使用三氧化二砷处理HepG2细胞时，随着三氧化二砷浓度的增加，细胞凋亡率逐渐升高。当三氧化二砷浓度为0.5μmol/L时，细胞凋亡率为（8.56±1.23）%，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）；当浓度增加到1μmol/L时，凋亡率升高至（15.67±2.12）%；浓度为2μmol/L时，凋亡率达到（25.45±3.21）%。这说明三氧化二砷能够有效诱导HepG2细胞凋亡，且呈剂量依赖性，即随着三氧化二砷浓度的升高，诱导细胞凋亡的能力逐渐增强。单独使用顺铂处理时，细胞凋亡率也随顺铂浓度的增加而上升。5μmol/L顺铂处理组的细胞凋亡率为（10.23±1.56）%，显著高于对照组（P<0.05）；10μmol/L顺铂处理组凋亡率为（18.78±2.56）%；20μmol/L顺铂处理组凋亡率达到（28.90±3.56）%。表明顺铂同样能够诱导HepG2细胞凋亡，且其诱导凋亡的效果与浓度密切相关，浓度越高，诱导凋亡的作用越强。在联合用药组中，三氧化二砷与顺铂联合使用对HepG2细胞凋亡率的影响更为显著。以三氧化二砷1μmol/L与顺铂10μmol/L联合为例，细胞凋亡率高达（42.34±4.21）%，明显高于相同浓度下三氧化二砷或顺铂单独使用时的凋亡率，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。这充分表明三氧化二砷和顺铂联合使用对诱导HepG2细胞凋亡具有协同增效作用，两种药物的联合能够更有效地促进细胞凋亡，从而增强对肝癌细胞的杀伤作用。<插入表格1张，表格内容为不同浓度三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞的凋亡率，表注为：表4-2不同浓度三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞的凋亡率（%，\overline{X}±S，n=3）><插入图片1张，图片内容为流式细胞仪检测不同处理组HepG2细胞凋亡率的散点图，图注为：图4-2流式细胞仪检测不同处理组HepG2细胞凋亡率的散点图A：对照组；B：三氧化二砷0.5μmol/L组；C：三氧化二砷1μmol/L组；D：三氧化二砷2μmol/L组；E：顺铂5μmol/L组；F：顺铂10μmol/L组；G：顺铂20μmol/L组；H：三氧化二砷1μmol/L+顺铂10μmol/L组>4.3凋亡相关蛋白表达变化采用Westernblot技术检测不同处理组HepG2细胞中凋亡相关蛋白caspase-3、Bcl-2、Bax的表达水平，实验结果见图4-3和表4-3。在对照组中，caspase-3以酶原形式存在，其蛋白表达水平相对较低，Bcl-2蛋白表达水平较高，而Bax蛋白表达水平相对较低，这表明在正常培养条件下，细胞内的抗凋亡蛋白Bcl-2占主导地位，维持细胞的存活和正常增殖状态。单独使用三氧化二砷处理HepG2细胞后，随着三氧化二砷浓度的增加，caspase-3蛋白的活化形式（cleavedcaspase-3）表达水平逐渐升高，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。caspase-3是细胞凋亡过程中的关键执行蛋白酶，其活化形式的增加表明三氧化二砷能够激活caspase-3信号通路，启动细胞凋亡程序。Bcl-2蛋白表达水平逐渐降低，呈剂量依赖性，这说明三氧化二砷能够抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，从而削弱细胞的抗凋亡能力。与之相反，Bax蛋白表达水平逐渐升高，且与三氧化二砷浓度呈正相关，表明三氧化二砷可促进促凋亡蛋白Bax的表达，Bax蛋白的增加能够与Bcl-2蛋白形成异二聚体，从而破坏Bcl-2的抗凋亡功能，进一步促进细胞凋亡。单独使用顺铂处理时，同样观察到caspase-3活化形式表达水平的升高以及Bcl-2蛋白表达水平的降低和Bax蛋白表达水平的升高。随着顺铂浓度的增加，caspase-3活化形式表达逐渐增多，在20μmol/L顺铂处理组中，cleavedcaspase-3的表达水平显著高于对照组（P<0.01）；Bcl-2蛋白表达水平逐渐下降，5μmol/L顺铂处理组的Bcl-2蛋白表达水平就已明显低于对照组（P<0.05），且随着顺铂浓度的升高，下降趋势更为明显；Bax蛋白表达水平则逐渐上升，20μmol/L顺铂处理组的Bax蛋白表达水平显著高于对照组（P<0.01）。这表明顺铂也能够通过激活caspase-3信号通路，下调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，上调促凋亡蛋白Bax的表达，从而诱导HepG2细胞凋亡。在联合用药组中，三氧化二砷与顺铂联合使用对凋亡相关蛋白表达的影响更为显著。以三氧化二砷1μmol/L与顺铂10μmol/L联合为例，cleavedcaspase-3的表达水平明显高于相同浓度下三氧化二砷或顺铂单独使用时的表达水平，差异具有高度统计学意义（P<0.01）。Bcl-2蛋白表达水平进一步降低，显著低于单独使用三氧化二砷或顺铂处理组（P<0.01）；Bax蛋白表达水平显著升高，明显高于单独使用三氧化二砷或顺铂处理组（P<0.01）。这充分说明三氧化二砷和顺铂联合使用能够协同激活caspase-3信号通路，更有效地抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，促进促凋亡蛋白Bax的表达，从而增强对HepG2细胞凋亡的诱导作用。<插入表格1张，表格内容为不同浓度三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞凋亡相关蛋白的表达水平，表注为：表4-3不同浓度三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞凋亡相关蛋白的表达水平（\overline{X}±S，n=3）><插入图片1张，图片内容为Westernblot检测不同处理组HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的条带图，图注为：图4-3Westernblot检测不同处理组HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的条带图A：对照组；B：三氧化二砷0.5μmol/L组；C：三氧化二砷1μmol/L组；D：三氧化二砷2μmol/L组；E：顺铂5μmol/L组；F：顺铂10μmol/L组；G：顺铂20μmol/L组；H：三氧化二砷1μmol/L+顺铂10μmol/L组>4.4相关基因表达水平改变采用RT-qPCR技术检测不同处理组HepG2细胞中凋亡和存活途径关键基因的表达水平，实验结果见图4-4和表4-4。结果显示，在对照组中，抗凋亡基因Bcl-2的表达水平较高，而促凋亡基因Bax、caspase-3的表达水平相对较低，这与细胞处于正常增殖状态，凋亡水平较低的结果相一致。单独使用三氧化二砷处理HepG2细胞后，随着三氧化二砷浓度的增加，Bcl-2基因的表达水平逐渐降低，与对照组相比，差异具有统计学意义（P<0.05）。这表明三氧化二砷能够在基因水平上抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，从而削弱细胞的抗凋亡能力。与之相反，Bax和caspase-3基因的表达水平逐渐升高，呈剂量依赖性。Bax基因表达的增加可促进线粒体释放细胞色素C，激活caspase-3等凋亡相关蛋白酶，从而启动细胞凋亡程序；caspase-3基因表达的升高，进一步表明三氧化二砷能够激活caspase-3信号通路，促进细胞凋亡。单独使用顺铂处理时，同样观察到Bcl-2基因表达水平的下降以及Bax和caspase-3基因表达水平的上升。随着顺铂浓度的增加，Bcl-2基因表达逐渐减少，在20μmol/L顺铂处理组中，Bcl-2基因表达水平显著低于对照组（P<0.01）；Bax基因表达水平逐渐上升，5μmol/L顺铂处理组的Bax基因表达水平就已明显高于对照组（P<0.05），且随着顺铂浓度的升高，上升趋势更为明显；caspase-3基因表达水平也逐渐升高，20μmol/L顺铂处理组的caspase-3基因表达水平显著高于对照组（P<0.01）。这说明顺铂也能够通过调节凋亡相关基因的表达，诱导HepG2细胞凋亡。在联合用药组中，三氧化二砷与顺铂联合使用对凋亡相关基因表达的影响更为显著。以三氧化二砷1μmol/L与顺铂10μmol/L联合为例，Bcl-2基因表达水平进一步降低，显著低于单独使用三氧化二砷或顺铂处理组（P<0.01）；Bax和caspase-3基因表达水平显著升高，明显高于单独使用三氧化二砷或顺铂处理组（P<0.01）。这充分证明三氧化二砷和顺铂联合使用能够协同调节凋亡相关基因的表达，更有效地抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达，促进促凋亡基因Bax和caspase-3的表达，从而增强对HepG2细胞凋亡的诱导作用，这与细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达的检测结果相一致。<插入表格1张，表格内容为不同浓度三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞凋亡相关基因的表达水平，表注为：表4-4不同浓度三氧化二砷和顺铂单独及联合作用于人肝癌HepG2细胞凋亡相关基因的表达水平（\overline{X}±S，n=3）><插入图片1张，图片内容为RT-qPCR检测不同处理组HepG2细胞凋亡相关基因表达的柱状图，图注为：图4-4RT-qPCR检测不同处理组HepG2细胞凋亡相关基因表达的柱状图A：对照组；B：三氧化二砷0.5μmol/L组；C：三氧化二砷1μmol/L组；D：三氧化二砷2μmol/L组；E：顺铂5μmol/L组；F：顺铂10μmol/L组；G：顺铂20μmol/L组；H：三氧化二砷1μmol/L+顺铂10μmol/L组与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与三氧化二砷或顺铂单独处理组比较，#P<0.05，##P<0.01>五、讨论5.1三氧化二砷和顺铂联合诱导凋亡的协同效应本研究结果显示，三氧化二砷和顺铂单独作用于人肝癌HepG2细胞时，均能显著抑制细胞生长，且抑制作用呈剂量-时间依赖性。这与前人的研究结果一致，众多研究表明三氧化二砷可通过诱导细胞凋亡、抑制细胞增殖等多种途径发挥抗癌作用；顺铂则主要通过与DNA结合，破坏DNA结构和功能，进而抑制肿瘤细胞的增殖。当三氧化二砷和顺铂联合使用时，对HepG2细胞的生长抑制作用更为显著，通过计算两药相互作用系数（CDI）发现多数联合用药组的CDI值小于1，表明两药具有协同增效作用。在细胞凋亡实验中，联合用药组的细胞凋亡率明显高于单药组，进一步证实了两者联合在诱导细胞凋亡方面的协同效应。从细胞生长抑制曲线（图4-1）可以直观地看出，联合用药组在各个时间点的细胞生长抑制率均高于相应浓度的单药组，尤其是在低浓度联合用药时，生长抑制率的增加更为明显。这表明在较低药物浓度下，两药联合就能发挥较强的抑制肿瘤细胞生长的作用，这对于临床治疗具有重要意义，因为较低的药物浓度可以减少药物的毒副作用，提高患者的耐受性。在细胞凋亡率的检测中（图4-2），三氧化二砷1μmol/L与顺铂10μmol/L联合时，细胞凋亡率高达（42.34±4.21）%，远高于相同浓度下三氧化二砷或顺铂单独使用时的凋亡率，充分体现了联合用药在诱导细胞凋亡方面的协同优势。这种协同效应可能与两种药物不同的作用机制有关。三氧化二砷能够诱导细胞凋亡，通过激活多种凋亡相关信号通路，如线粒体途径、死亡受体途径等，促使细胞发生凋亡。顺铂主要通过与DNA结合形成交联结构，抑制DNA复制和转录，从而诱导细胞凋亡。当两者联合使用时，可能从多个环节协同作用于细胞凋亡过程。三氧化二砷可能增强顺铂与DNA的结合能力，或者通过调节细胞内的信号通路，使细胞对顺铂的敏感性增加；顺铂也可能影响三氧化二砷诱导的凋亡信号通路，促进三氧化二砷发挥诱导凋亡的作用。两者联合可能共同调节凋亡相关蛋白和基因的表达，从而更有效地诱导细胞凋亡。5.2作用机制探讨从蛋白和基因表达变化的实验结果来看，三氧化二砷和顺铂联合诱导HepG2细胞凋亡的分子机制主要与调控凋亡相关信号通路密切相关。caspase-3作为细胞凋亡过程中的关键执行蛋白酶，在细胞凋亡信号通路中起着核心作用。当细胞受到凋亡刺激时，caspase-3被激活，其前体形式（procaspase-3）裂解为具有活性的cleavedcaspase-3，进而激活下游的一系列凋亡相关蛋白，如多聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）等，导致细胞凋亡。本研究中，无论是三氧化二砷还是顺铂单独处理，均能使caspase-3活化形式表达水平升高，而联合用药组中cleavedcaspase-3的表达水平进一步显著升高。这表明两种药物联合使用能够更有效地激活caspase-3信号通路，促使细胞凋亡程序的启动。从基因表达水平来看，RT-qPCR检测结果显示联合用药组中caspase-3基因表达水平显著上调，进一步验证了联合用药对caspase-3信号通路的激活作用。Bcl-2家族蛋白在细胞凋亡调控中起着至关重要的作用，其中Bcl-2是抗凋亡蛋白的代表，而Bax是促凋亡蛋白的代表。Bcl-2蛋白主要通过阻止线粒体释放细胞色素C，抑制caspase蛋白酶的激活，从而发挥抗凋亡作用；而Bax蛋白则可与Bcl-2蛋白形成异二聚体，削弱Bcl-2的抗凋亡功能，同时Bax自身可形成同源二聚体，插入线粒体膜，导致线粒体膜通透性增加，释放细胞色素C，激活caspase-9，进而激活caspase-3，启动细胞凋亡。本研究中，三氧化二砷和顺铂单独处理均能下调Bcl-2蛋白表达，上调Bax蛋白表达，联合用药组中这种调节作用更为显著，Bcl-2蛋白表达水平进一步降低，Bax蛋白表达水平显著升高。在基因表达水平上，联合用药组中Bcl-2基因表达显著下调，Bax基因表达显著上调。这说明联合用药能够通过调节Bcl-2和Bax蛋白及基因的表达，打破细胞内抗凋亡与促凋亡的平衡，促使细胞向凋亡方向发展。综合以上实验结果，三氧化二砷和顺铂联合诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的分子机制可能是：三氧化二砷和顺铂联合作用于HepG2细胞后，一方面，通过上调Bax基因和蛋白表达，下调Bcl-2基因和蛋白表达，破坏Bcl-2的抗凋亡功能，促进线粒体释放细胞色素C，从而激活caspase-9；另一方面，直接或间接激活caspase-3，使其前体裂解为具有活性的cleavedcaspase-3，激活的caspase-3进一步激活下游的凋亡相关蛋白，引发级联反应，最终导致细胞凋亡。这种联合用药通过多靶点、多途径协同作用，增强了对肝癌细胞凋亡的诱导作用，为肝癌的治疗提供了新的理论依据。5.3研究结果的临床应用前景本研究的结果在肝癌临床治疗方面展现出了极具潜力的应用前景，有望为肝癌患者带来新的治疗希望和更好的治疗效果。从联合用药方案设计角度来看，研究发现三氧化二砷和顺铂联合使用对人肝癌HepG2细胞具有显著的协同增效作用，能够有效抑制细胞生长，诱导细胞凋亡。基于此，在临床实践中，可尝试设计以三氧化二砷和顺铂为核心的联合化疗方案。对于中晚期无法手术切除的肝癌患者，可将三氧化二砷与顺铂按照实验中筛选出的具有协同增效作用的剂量和比例进行联合使用，配合介入治疗，如经动脉化疗栓塞术（TACE）。在TACE治疗过程中，将三氧化二砷和顺铂的混合药物通过动脉导管注入肿瘤供血动脉，使药物直接作用于肿瘤组织，提高药物在肿瘤局部的浓度，增强对肿瘤细胞的杀伤作用，同时减少药物对全身其他组织器官的毒副作用。还可考虑将