生物化学实验：实验一 酶的底物专一性

生物化学实验40学时

（生物工程、生物信息、张之洞班）生物化学技术60学时

（生物技术、应用生物技术、生物科学）实验内容（40学时）

（生物工程、生物信息、张之洞班）1.酶的底物专一性（4）2.总糖和还原糖的测定（4）2.蛋白质N端分析（4）4.植物DNA的提取（4）5.DNA的酶切和电泳（4）6.酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12）7.SDS测定蛋白质分子量（8）实验内容（60学时）

（生物技术、应用生物技术、生物科学）酶的底物专一性（4）总糖和还原糖的测定（4）蛋白质N端分析（4）植物DNA的提取（4）DNA的酶切和电泳（4）酵母醇脱氢酶的提取和纯化（12）亲和层析分离纯化蛋白质（14）WesternBlot鉴定目的蛋白（14）实验要求按时上课，不得缺席预习实验内容认真观察实验现象，如实记录实验数据独立分析实验结果，按时完成实验报告实验室守则★保持室内安静、整洁★严格按操作规程使用仪器设备，节约试剂和实验材料★实验过程中注意水、电、门窗安全★实验完毕后，将仪器、器皿放归原处★做好实验室卫生特别注意★若发生仪器故障其它事故，应立即切断相关电源，及时报告老师★违反操作规程造成事故、仪器损坏，将按学校有关规定赔偿★每位学生一套基本的实验物品，放置在抽屉中，对照有物品清单，每次做完实验后，清点无误后归回抽屉；每次实验另外发放的实验物品，用完清洗后放置在实验台面上。★每次做完实验后，由班长安排4名同学做清洁卫生，做完后必须由实验老师检查通过。实验报告●每人1份，下次实验课前交。生物化学实验成绩★出勤和实验室综合表现15分★实验报告35分★实验课考试50分酶的底物专一性实验一目的了解酶的专一性掌握检查酶专一性的原理和方法学会排除干扰因素，设计酶学实验实验内容

本实验以唾液淀粉酶（内含淀粉酶及少量麦芽糖酶）、蔗糖酶对淀粉及蔗糖的催化作用，观察淀粉酶、蔗糖酶的底物专一性。原理

酶的专一性是指一种酶只能对一种底物或一类底物起催化作用，对其他底物无催化作用。酶的专一性程度分为：键专一性：只要求作用于一定类型的键，对键两端基团无严格要求。如脂酶、核酶基团专一性：只对键两端一个基团要求严格，如α-、β-葡萄糖苷酶，转移酶绝对专一性：只作用于一种底物，如某些核酸工具酶立体异构专一性：旋光异构专一性和几何异构专一性酶的专一性淀粉直链淀粉:由200-300个α-葡萄糖以α-1，4糖苷键相连成一直链支链淀粉:有α-1，4糖苷键和α-1，6糖苷键，在直链淀粉的基础上形成分支

直链淀粉的相对分子质量比支链淀粉小，直链淀粉的分子是由许多α-D-葡萄糖经过α-1，4-苷键反复连接而成的线状聚合物。直链淀粉

直链淀粉的形状并不是伸展状态的直链，而是有规律的卷曲成螺旋状，每一螺旋圈约有6个葡萄糖结构单位。

直链淀粉遇碘液显蓝色，加热煮沸时颜色消失，冷却后又重新显色。这个反应很灵敏，常用来检验淀粉或碘的存在。

支链淀粉比直链淀粉由更多的D-葡萄糖组成，其连接方式也有所不同。支链淀粉中D-葡萄糖之间以α-1，4苷键连接成主链，每隔20－25个葡萄糖单位便分枝出1个支链，支链上还有分枝，而支链的连接点即分枝处为α-l，6糖苷键。支链淀粉支链淀粉分枝状结构

由α-葡萄糖和β-果糖以α-1，2糖苷键相连而成的双糖蔗糖Benedict反应

Benedict试剂是碱性硫酸铜溶液，具有一定的氧化能力，能与还原性糖的半缩醛羟基发生氧化还原反应，生成氧化亚铜（Cu2O）砖红色沉淀。淀粉和蔗糖都不能反应，而它们的水解产物葡萄糖能够发生Benedict反应，所以，用颜色反应来观察淀粉酶、蔗糖酶对淀粉及蔗糖的水解作用。半缩醛羟基在右边，即与氧环同侧——α-D-葡萄糖；半缩醛羟基在左边，即与氧环异侧——β-D-葡萄糖。

试剂淀粉酶溶液：唾液2mL倒入10mL量筒中（不包括泡沫），用蒸馏水稀释到5mL，静置10分钟后，去掉上层泡沫和下层的沉淀。（自制）蔗糖酶溶液：干酵母1g置研钵中，加半勺石英沙及蒸馏水少许（约4mL），用力研磨10分钟，转移到50mL离心管中，另用25mL蒸馏水洗涤研钵，并将洗涤液一起转移到离心管中，摇匀，静置5分钟，离心(离心前对称放置的两只离心管要等重配平，精确到0.01g)，小心取出上清液（含蔗糖酶）备用。（自制）0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）（取前摇匀）2%蔗糖溶液Benedict试剂Benedict试剂

在600mL蒸馏水中溶解173g柠檬酸钠和100g无水碳酸钠，冷却后稀释到850mL。在100mL热蒸馏水中溶解17.4g无水硫酸铜。冷却后稀释到150mL。把硫酸铜溶液缓缓倒入柠檬酸钠－碳酸钠溶液中，边加边搅拌，如产生沉淀。要过滤，班氏试剂配制后能长期使用。如存放较久而产生沉淀时，可取上层清液使用，不必重配。实验步骤检查试剂试管1试管2试管30.5%淀粉溶液/mL32%蔗糖溶液/mL3蒸馏水/mL3Benedict试剂/mL222摇匀，沸水煮2分钟观察记录结果原因淀粉酶的专一性试管4试管5试管6稀释的唾液淀粉酶/ml1110.5%淀粉溶液/ml32%蔗糖溶液/ml3蒸馏水/ml3摇匀，37℃保温30分钟Benedict试剂/ml222

摇匀，沸水煮沸2分钟观察记录结果原因蔗糖酶的专一性试管7试管8试管9蔗糖酶溶液/ml1110.5%淀粉溶液/ml32%蔗糖溶液/ml3蒸馏水/ml3摇匀，3