免疫学检测技术

免疫学检测技术

生物技术学院抗体工程研究所

2010年3月7日

1

分子诊断学

0分子诊断学是以分子生物学理论为基础

,利用基因和蛋白质分析技术和方法来

研究人体内源性或外源性生物大分子体

系的存在、结构或表达调控的变化，为

疾病的监测、诊断、疗效判断和预后评

估、个体化治疗等提供信息和决策依据

的一门科学。

0随着分子诊断技术的不断发展，分子诊

断已从传统的DNA诊断概念发展到更全面

的核酸和蛋白质诊断的新概念；分子诊

断的内容也从早期的单一遗传性疾病的

诊断发展成为覆盖临床医学、预防医学

等众多领域的重要技术。

1

2008年国内临床诊断试剂市场

生化产品30%

v免疫产品25%

基因产品8%

v血液分析产品8%〜10%

v尿液分析产品3%~5%

微生物产品2%〜3%

占全球市场的1/14

1

免疫学检验项目分布情况

Source:UBSWarburgLLCestimates

Infectiousdiseases

Tumormarkers

主要内容

(1)酶免疫分析

(2)放射免疫分析

(3)免疫荧光分析

(4)时间分辨荧光免疫分析

(5)化学发光免疫分析

(6)金标和磁性免疫层析分析

(7)蛋白印迹

(8)AlphaScreen分析技术1

抗原抗体反应的特性

1、特异性

2、可见性

3、可逆性

+

AgAb

1

影响抗原抗体反应的因素

⑴抗原抗体的性质

⑵温度

⑶酸碱度（PH）

（4）电解质（离子强度

）

1

抗原和抗体的类别

抗原抗体

1

标记免疫学分析技术发展历程

0免疫荧光分析(Coons,1941)

0放射免疫分析(Berson和Yalow,I960)

0酶联免疫吸附分析(Engvall,1971)

0金标免疫分析(Faulk和Taylor,1971)

0化学发光免疫分析(Arakawa,1977)

0时间分辨荧光免疫分析(Soini和Hemmila,1979)

0电化学发光免疫分析(Leland,1990)

1

标记免疫学分析技术发展历程

⑥电化学发光

⑤时间分辨荧光

④化学发光

③酶联免疫

②放射免疫

①免疫荧光

1

丁酶免疫分析技术

酶免疫组织化学

酶免疫技术均相

酶免疫测定固相⑥闻

异相

液相

1

（一）ELISA技术

酶联免疫吸附测定(EnzymeLinkedImmuno

SorbentAssay,ELISA)基础是抗原或抗体

的固相化及抗原或抗体的酶标记，反应完成后

加入酶反应底物，底物被酶催化成为有色产物

,产物的量与标本中受检物质的量直接相关，

由此进行定性或定量分析。

1

标记用酶的要求

①来源方便，易于纯化；

②比活性高，性质稳定；

③与抗体或抗原交联后仍保持酶的活性；

④待测物中不存在该酶及其底物、抑制剂和其它干

扰因素；

⑤酶活性和量能用简单、快速、敏感的方法测定。

辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶

1

辣根过氧化物酶

0底物为邻苯二胺(OPD),橙红色，检测

波长492nll1；

0四甲基联苯胺(TMB),蓝绿色，检测波

长450nm

1

碱性磷酸酶

底物为PNP（对硝基磷酸苯酯），检测波长

405nm。

1

ELISA的必要试剂

0固相的抗原或抗体

0酶标记的抗原或抗体

0酶作用的底物

4根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具

备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

1

技术类型

0双抗体夹心法测抗原

0双抗原夹心法测抗体

0间接法测抗体

0竞争法测抗体

0竞争法测抗原

0捕获包被法测抗体

0B心比建法

1

⑴双抗体夹心法测抗原

底物

酶标抗体样品

酶标仪测定0D值终止液

此法适用于检验各种大分子抗原，例如

、、等。

HBsAgHBeAgAFP1

⑴双抗体夹心法测抗体

n在一步法测定中，如标本中受检抗原的含量很高

时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而

不再形成“夹心复合物'。所得结果将低于实际的含

量，这种现象被称为钩状效应(hookeffect)o

n类风湿因子(RF)的干扰。RF是一种自身抗体

，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。表

现出假阳性反应。

⑵双抗原夹心法测抗体

反应模式与双抗体夹心法类似。

用特异性抗原进行包被和制备酶结

合物，以检测相应的抗体。抗诳

、抗十乂抗邨的检测常采用本

法。

1

⑶间接法测抗体

样品稀释液样品酶标抗体

终止液底物

一些传染病的诊断(Torch)。包被抗原利用

酶标二抗建立检测相应抗体的方法。

1

⑷竞争法测抗体

样品酶标抗体

终止液底物

当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到

足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。如

抗-HBc等常用该方法。1

⑸竞争法测抗原

其原理是标本中的抗原和一定量的酶标

抗原竞争与固相抗体结合。标本中抗原量含

量愈多，结合在固相上的酶标抗原愈少，最

后的显色也愈浅。小分子激素（T3、T4）、药

物等ELISA测定多用此法。

1

⑹捕获包被法测抗体

样品特异性抗原酶标抗体

终止液底物

13M的检测常用于传染病的诊断。用抗人igM抗

体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括

针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。

此法常用于病毒性感染的早期诊断。

1

⑺的田楼法

①：固相支持物；

②：样品；

③：特异性IgG；

④：生物素化抗小鼠IgG(Biotin)；

⑤：辣根过氧化物酶HRP-酶标链亲和素(Avidin)；

@：DAB显色液；

⑦：显色；1

酶标记抗原或抗体的方法

1.戊二醛法

一步法：将HRP和抗体与戊二醛同时反应连接

而成。一步法操作简单，但所得产物质量不均

一，抗体活性损失大，结合物的产率低。

二步法：将HRP按一定比例与戊二醛反应，形

成HRP-戊二醛结合物，透析除去未结合的戊二

醛后，再加入抗体。二步法制备的结合物产量

虽无提高，但质量均一，活性高。

1

酶标记抗原或抗体的方法

2.过碘酸钠法

过碘酸钠将酶分子上的糖羟基氧化成醛基,

醛基与抗体（或抗原）中的游离氨基结合形成

Schiffs碱，经NaBH4还原生成稳定的酶结合

物。

该法快速简便、安全，酶结合物的产率高、

活性好，已成为目前最常用的酶标记方法。

1

酶标记物的纯化

0硫酸钱盐析法

OS^hafeG-200凝胶过滤

0SBV亲和层析

1

酶标记物的鉴定

评价最好好一般

酶含量(mg/ml)>1.0>0.50.4

酶结合率(%)>309-107

克分子比(酶/igG)>1.51.00.7

0酶含量(mg/mI)=OD403x0.42

0IgG#i(mg/ml)=(OD28O-OD4O3xO.3O)xO.62

0酶的结合率=结合物中酶量(mg/ml)/标记时加入酶量(mg/ml)xlOO%j

最适工作浓度的选择（间接法）

酶标抗体工作浓度包被抗原工作浓度

1

间接ELISA法包被抗原工作浓度的选择

各抗原稀度的吸光度

参考血清1:80

1:501:1001:2001:400

0

强阳性1.261.080.860.680.42

弱阳性0.680.410.300.220.18

性0.250.130.050.040.03

稀液0.090.020.020.020.04

1

双抗体夹心法工作浓度的选择（棋盘法）

酶抗体各抗原度的吸光度

包被抗体度稀

度25n^/ml1.5ng/ml性

1:2000

5pg/ml1:4000

1:8000

1:2000

3|Lig/ml1:4000

1:8000

lRg/ml1:2000

1:4000

CL，1：迎。

425ng/ml的抗原OD值约加8-阴性OD值小于0.1；

ELISA技术操作要点

0固相载体的选择

0包被

0封闭

0加样

0保温

0洗涤

。显色

1

试剂盒试剂操作前的注意事项

n不同批号的试剂盒不要混用。

n整个实验过程应尽量建立在干净无

尘的环境下进行。

n试剂盒与待检样本使用前必须平衡

至室温。

1

酶标板

0酶标板最常用的材料是聚苯乙烯。聚苯

乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体

或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免

疫学活性。

0良好的酶标板应该是吸附性

能好，空白值低，孔底透明

度高，各板之间、同一板各

孔之间性能相近。

1

酶标板的检定

以一定浓度的人IgG（一般为10ng/mI）

包被ELISA板各孔，洗涤后每孔内加入适当稀

释度的酶标抗人IgG抗体，保温后洗涤，加底

物显色，终止酶反应后，分别测每孔溶液的

吸光度。控制反应条件，使各孔读数在吸光

度0.8左右。计算全部读数的平均值。所有单

个读数与全部读数的均数之差，应小于10%

1

O

包被

n包被液：碳酸盐缓冲溶液殖由此

西4),Tnsffl.距8)

n包被浓度：lOOng/ml-20ug/ml

n温度和时间：在4-8C过夜或37c4、时

1

封闭

封闭（blocking）是继包被之后用高浓度的

无关蛋白质溶液再包被的过程。

u0.05%-0.5%的牛血清白蛋白

ulO%的小牛血清

ul%明胶

u5%脱脂奶粉

1

加样

在ELISA中一般有3次加样步聚，即

加标本，加酶结合物，加底物。

r:吸头应悬空，避免因吸头碰到小孔边缘或其中

试剂而造成污染

n每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染；

n酶结合物工作液和底物可用多道加液器，使加

液过程迅速完成。

1

孵育

037c是实验室中常用的保温温度，也是大多

数抗原抗体结合的合适温度；

0室温较37c可避免蒸发，为加速反应，可辅

以摇床振荡；

0抗原抗体反应在4c过夜反应更为彻底。

1

洗涤

决定着实验的成败

0ELSIA靠洗涤来分离游离的和结合的酶标记物。

通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗

体结合的物质，以及在反应过程中非特异性地吸附

于固相载体的干扰物质。常用洗涤液为pH7.4

PBS-Tween-20。

0手工洗板时要注意防止气泡产生。

0洗板机在使用前应进行校正注液量和残留量，注

意管道是否通畅。洗涤时，确认每孔中的洗涤液都

注满微孔，洗涤后，每个孔必须是干的，如果仍有

水可倒扣在无尘吸水纸上拍干。

显色

HRP-TMB显色系统受光照的影响不大

,可在室温中置于操作台上，边反应观察结

果。但为保证实验结果的稳定性，宜在规定

的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，

约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小

时后即可完全消退至无色。各类酸性终止液

(2mol/LH2so4)则会使蓝色转变成黄色，此

时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。

1

ELISA试剂盒

(1)已包被抗原或抗体的固相载体；

(2)酶标记的抗原或抗体(结合物)；

(3)酶的底物；

(4)阴性对照品和阳性对照品(定性测定中)，参考

标准品(定量测定中)；

(5)标本稀释液；

(6)洗涤液；

(7)终止液。

1

实验仪器：ELISA操作的标准化

BIORAD550酶标仪BIORAD1575洗板仪

变频振荡器全自动酶联免疫分析仪1

ELISA技术的应用

⑴在医学检测中的应用

0病原体及其抗体的检测

0蛋白质的检测

0非肽类激素的检测

。药物的检测

0毒品检测

1

ELISA技术的应用

⑵在食品检测中的应用

。食品微生物的检测

0食品毒素的检测

0食品中残留农药的检测

0食品中残留抗生素的检测

0转基因食品的检测

1

ELISA技术的优点

V与放射免疫测定相比，标记物比较稳定，无

放射性的危害。

V与免疫荧光技术相比，结果判定更加客观。

V操作简单，易自动化。

V酶标仪普及、价格低廉。

1

ELISA技术的缺点

vO.D值仅在低浓度范围与酶活性呈线性

关系，出±效应严重。

酶的活性容易失活，使即业的灵敏度

不高。

血乱的大分子标记容易影响被标记物

的空间结构，使得HJS的灵敏度进一步

提高受到限制。

1

（二）酶免疫组织化学技术

免疫组化技术又称免疫细胞化学，以酶

标记抗体（或抗原）用于免疫学检测，通过

相应底物被酶解后的显色反应，对细胞和组

织标本中的抗原一抗体复合物进行定位、定

性分析和鉴定。它把免疫反应的特异性、组

织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微

镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平

检测各种抗原。

1

主要类型

0直接法

0间接法

0酶桥法

0出去

0亲和素一生物素方法

1

主要类型

直接法间接法酶桥法去

1

实验步骤

08%甲醇+Q3H202处理切片15〜30min,封闭内源

性过氧化酶的活性；

00.05%Tferr20用洗涤；

00.1〜1%侬湿盒内孵育15〜25min；

0加第一抗体（50〜804）,湿盒内孵育1〜2h；

00.05%1ferr2（W洗涤；

0加HP酶标记二抗湿盒内孵育45~60min；

0的票洗欹；

00.01~0・05%四显色10~15111111（暗处）。

1

二、放射免疫分析

v放射免疫分析(Radioimmunoassay,

RIA)1959年由Berson和Yalow仓ij建，是以放

射性核素为标记物的标记免疫分析法，RIA

将放射性核素分析的高灵敏度与抗原抗体反

应的特异性相结合，

v用于测定标本中抗原

v或抗体的量。

1

放射免疫分析岫

PriortoTest

+

Labeled

Ag

Test

+++

LabeledPatient's

Agsample

1

免疫放射分析

v1968年Mil好唯1笔应用放射性

核素标记的抗胰岛素抗体检测牛血清中

胰岛素获得成功。为了区别于经典的放

射免疫测定㈣)，他们将其命名为免

疫放射分析6mmunoradiometricass^

，IM)O

i

Labeled

Ab

Agin

Patient's

sampleAg

Immobilized

Solid

Phase

1

放射性核素的选择原则

0高比活度

0适宜的半衰期

0对抗原和抗体损害小

0容易标记

1

放射性核素

一般实验室不易开展，放射性废物处理困难，应

用受限制。

01311/口1251:125

氨酸的蛋白质用'王

射线，可以晶体闪烁计数仪直接测量射线;1251

半衰期长（60天）、比活度高（95%）较31

天，比活度仅20%）更为适用。1（中装历8

125

I标记方法分类

0直接标记法：标记含酪氨酸的化合物，可将I

直接结合于蛋白质侧链残基的酪氨酸上，此法

操作简便，反应时间短，标记物的比活度高。

0间接标记法：常用环核甘酸、前列腺素等小分

子化合物的标记。先将I标记在载体上，再与

蛋白质结合。此法操作较复杂，标记蛋白质的

比活度也低于直接法。但标记反应较为温和，

可以避免因蛋白质直接加入I引起的生物活性

125

1

的丧失。

125

I标记物的纯化

0葡聚糖凝胶：S叩hadex

1500~

分子量<700<1500<5000

20000

型号G10G15G25G50

3000-4000~5000~5000~

刀厂里70000150000800000300000

型号(75G100G150G200

1

125

I标记物的鉴定

1.放射性化学纯度

是指结合于抗原上的放射性强度占总放

射性总强度的百分率。一般要求游离碘含量

占总放射性碘的5%以下。标记抗原在贮存

过久后会出现标记物的脱碘，如游离碘超过

5%则应重新纯化去除这部分游离碘。

1

125

I标记物的鉴定

2.免疫活性

指标记抗原结合于抗体的放射性占总放

射性的百分率。方法是用小量的标记抗原

加过量的抗体(10倍量)，反应后分离结合

部分(B)和游离部分(F),分别测定放射性

,算出B/T%。此值应在80%以上，该值

越大，表示抗原损伤越少。

1

125

I标记物的鉴定

3.比度：

指单位化学量标记物中所含的放射性强度

,即每分子被标记物平均所标记放射性原子

数目，Ci/g、RCi/mg等单位。

1

抗原抗体反应类型

1.平衡饱和法

指抗原和抗体反应达到再不结合、也不解离的

平衡状态，称为饱和状态。操作时在反应管内同

时加入标准品(或样品)、标记抗原和特异性抗体,

混匀后在一定温度下孵育一定时间，使三种成分

的反应几率相同。一般来说，平衡法的反应时间

需较长，低温(4℃)或室温为1天，但操作方便

,精密度较好。

1

抗原抗体反应类型

2.顺序加样法

将标准品（或样品）先与抗体一同温育反应一定

时间，使抗原与抗体充分结合，甚至达到平衡，

然后加入标记抗原再短时温育，与剩余的抗体结

合，最后分离B与F。此法使非标记抗原与抗体结

合形成复合物的几率大于标记抗原，相当于使非

标记抗原具有较高的竞争能力，结果使剂量反应

曲线的斜率增加，有利于提高分析的灵敏度。

1

RIAB、F分离方法

1.第二抗体沉淀法

在抗原与抗体反应后加入第二抗体，形成双抗体

复合物。但因第一抗体浓度甚低，其复合物亦极少

,无法进行离心分离，为此在分离时加入一定量的

与一抗同种动物的血清或IgG,使之与第二抗体形

成可见的沉淀物，与上述抗原的双抗体复合物形成

共沉淀。经离心即可使含有结合态抗原(B)的沉

淀物沉淀，与上清液中的游离标记抗原(F)分离。

该血清或IgG通常称为分析试剂。

1

RIAB.F分离方法

2.聚乙二醇（PEG）沉淀法

是以PEG溶液代替第二抗体作沉淀剂。在测定不

含有血浆蛋白的样品时，用PEG沉淀剂分离B、F,

必须加适量蛋白或正常人混合血清，以增加蛋白的

含量，便于沉淀。PEG沉淀剂的主要优点是制备方

便、沉淀完全。缺点是非特异性结合率比用第二抗

体为高，且温度高于30℃时沉淀物容易复溶。

1

RIAB、F分离方法

3.PR试剂法

是一种将双抗体与PEG二法相结合的方法

O此法保持了两者的优点，节省了两者的用

量，而且分离快速、简便。

1

RIAB.F分离方法

4.活性炭吸附法

小分子游离抗原或半抗原被活性炭吸附，大分子

复合物留在溶液中。在抗原与特异性抗体反应后，

加入葡聚糖一活性炭。放置5〜lOmin,使游离抗原

吸附在活性炭颗粒上，离心使颗粒沉淀，上清液中

含有结合的标记抗原。此法适用于测定类固醇激素

、强心糖甘和各种药物，因为它们是相对非极性的

,又比抗原抗体复合物小，易被活性炭吸附。

1

IRMAB>F分离方法

固相分离法

利用聚乙烯、聚丙烯和聚苯乙烯塑料试管

（小珠）作为固相载体，将特异性抗体或抗

原直接吸附于管壁（小珠），利用固相抗体

或抗原分离B和F。

1

RIA与IRMA的比较

免疫放射分析放射免疫分析

物抗体抗原

物用量量限量

直接合，反争性合，反

反方式参数与待抗参数与待抗原

原量成正比量成反比

反速率快慢

B、'分离方固相抗体等第二抗体等

特异性高高

灵敏度高高1

放射免疫分析实验注意事项

U所有试剂最好平衡到室温后加样。由于血清

标准或样品长时间保存后会出现上稀下浓现象

,分离剂更是如此，所以试剂包括样品在内加

样前应摇匀。

U不同批号的试剂最好不要混合使用。加样或

溶解时，注意各试剂之间不要相互污染。

1

放射免疫分析实验注意事项

U同次实验要保证所有管中加入的标记物、抗

体完全一致。当一次检测大量样品时将两瓶或

两瓶以上的标记物混合在一起后加样，以保证

实验的一致性。

U抽吸上清液时，应特别注意不要将沉淀抽走

,否则将严重影响测定结果的准确性。

U对于药盒（100管）中提供2瓶标记物的多肽类

产品，一般标记物、标准品稳定性欠佳，要求

现用现溶，复溶后低温冰冻保存，应尽量减少

液体状态放置的时间。1

放免技术的缺点

1、放射性（125“工丁3

危害，该方法已亚为翻脚［篥除

少

O（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）

2、1251的半衰期短而导致其试剂有效期短。

3、标记物125I的稳定性差，导致试剂盒批间

、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须

每次定标，造成浪费。

4、操作繁琐，出报告时间长。

5、无法保存备用。

1

二免疫荧光技术（FIA）

U以荧光物质标记抗体进行抗原定位称为荧光

抗体法；

U用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗

体的方法称为荧光抗原法。

U用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗

原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或

组织）化学技术。

1

荧光色素应具备的条件

0能与蛋白质分子形成共价键，结合后不易解离，未

结合及其降解产物易清除；

0荧光效率高，与蛋白质结合仍保持较高的效率；

0荧光的颜色与背景组织的颜色对比鲜明

0结合蛋白质后，不影响其活性

。标记方法简单、结合物稳定，易于保存；

0安全无毒，不具有附加的抗原性。

1

常用荧光色素

U异硫氧酸荧光素（黄），FITC,应用最广泛，

呈黄绿色荧光，分子量为3894。

u四乙基罗丹明，RB200,荧光效率低，多用于

FITC的衬比染色或双标记，橙色荧光

四甲基异硫氟酸罗丹明，TRITC,发橙红色荧

光。

U藻红蛋白，PE,发橙色荧光，荧光强度比

FITC强19倍。

1

荧光的标记

W衣据欲标记的蛋白总量（溶于生理盐水或碳酸盐

缓冲液），按每毫克蛋白加O.OlmgFITC。

u边搅拌边将称取的FITC粉末逐渐加入球蛋白溶液

中（5〜lOmin内加完），加完后4℃持续搅拌

12-18ho

u结合完毕后，将球蛋白溶液2500r/min离心

20min,取上清装入透析袋中，用pH8.0缓冲盐水

透析（0〜4℃）过夜。

u取透析过夜的标记物，过葡聚糖凝胶G-25或G-

50柱,分离游离FITC,o

1

荧光的标记

2.Chadwick方法

u用0〜4℃pH8.0PBS溶液将球蛋白溶液稀释至浓

度为30〜40mg/ml,后冰浴。

u按每毫克蛋白加入FITCO.Olmg,用3%重碳酸

钠水溶液溶解。

u将准备的抗体与FITC等量混合，充分搅匀后，在

0〜4℃冰浴结合18〜24h。

u透析和层析同Marshall方法。

1

1

直接法

①滴加适当稀释的荧光标记的抗

体溶液，保温30min。

Fluorochrome

②取出玻片，先用PBS冲洗后，LabeledAb

再按顺序过PBS溶液三缸浸泡

，每缸3-5min,不时振荡。

③取出玻片，用滤纸吸去多余水

Ag

分，但不使标本干燥，缓冲甘

TissueSection

油封固，荧光显微镜观察。

1

直接法需设置的对照

①标本自发荧光对照：标本加1〜2滴

O.Olmol/LpH7.4的PBS。

②特异性对照（抑制试验）：标本加未

标记的特异性抗体，再加荧光标记的

特异性抗体。

③阳性对照：已知的阳性标本加荧光标

记的特异性抗体。

1

间接法

①滴加适当稀释的抗体，37℃保温

30min。Fluorochrome

②取出玻片，先用PBS冲洗1〜2次，然LabeledAnti-Ig

后按顺序过PBS三缸浸泡，每缸5min

,不时振荡。

③取出玻片，用滤纸吸去多余水分，滴

加一滴一定稀释度荧光标记的抗人球

蛋白抗体。37℃保温30min。

Ag

④重复操作2。

⑤取出玻片，用滤纸吸去多余水分，缓TissueSection

冲甘油封固，荧光显微镜观察。

1

间接法需设置的对照

①阳性对照：阳性血清+荧光标记物。

②阴性对照：阴性血清+荧光标记物。

③荧光标记物对照：PBS+荧光标记物。

阳性阴性

对照对照

1

补体法

①吸取经适当稀释的免疫血清及补体等量混

合液滴于切片上，37c作用30min。

②用缓冲盐水洗2次，每次5min,吸干标本

周围水液。

③滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体，

37c作用30min,水洗同上。

④蒸储水洗Imin,缓冲甘油封固，荧光显微

镜视野下观察。1

补体法需设置的对照

①阳性血清对照

②正常阴性血清对照

③灭活补体对照：将补体经56℃处

理30min后，进行补体法染色。

双重染色法

U一步法双染色

先将两种标记抗体按适当比例混合（

A+B）,按直接法进行染色。

u二步法双染色

先用RB200标记的B抗体染色，不必

洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按

间接法进行。

1

结果判定

0"》:无或可见微弱荧光；

0伴：仅能见明确可见的荧光;

0^:可见有明亮的荧光；

0^:可见耀眼的荧光。

免疫荧光技术实验注意事项

U应在暗室中进行检查。进入暗室后，点燃超

高压汞灯5〜15min,待光源发出强光稳定后，

眼睛完全适应暗室，再开始观察标本。

u防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应

戴上防护眼镜。

u检查时间每次以1〜2h为宜，超过90min超高

压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱。

1

免疫荧光技术实验注意事项

0荧光显微镜光源寿命有限，标本应

集中检查，以节省时间，保护光源，

避免数次点燃光源。

。标本染色后应立即观察，标本受紫

外线照射3〜5min后，荧光也明显减

弱，若将标本放在聚乙烯塑料袋中

4c保存，可延缓荧光减弱时间。

1

免疫荧光技术应用

0细菌学检验方面

0病毒学检验方面

0寄生虫学检验方面

0自身抗体的检测

0细胞免疫学方面

1

免疫荧光技术的缺点

0标本不能永久保存，荧光有自然消退现象

,需及时观察及照相；

0有非特异性荧光的干扰；

0对组织细胞进行微细结构的观察做不到；

0用荧光显微镜观察；

0需用经验丰富的技术人员。

1

流式细胞术(flowcytometry,FCM)

流式细胞术是将免

OneParameterHistogram

疫荧光技术应用于流式

细胞仪，对单个细胞的Unstainedcells

表面标志（抗原或受体

）进行快速、精确的分FITC-labeledcells

析和自动检测，并可将

不同类型的细胞分选收GreenFluorescenceIntensity

集。

1

四、时间分辨荧光免疫分析

(time-resolvedfluoroimmunoassay,TRFIA)

是用锢系稀土元素螯合物标记抗体或抗原

,检测标本中相应的抗原或抗体，用时间分辨荧光免

疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度。根据产物

荧光强度和相对荧光强度的比值，判断反应体系中分

析物的浓度，从而达到定量分析。

1

TRFIA：

标记物为稀土金属-锢系元素

nlRRA中使用的镀［系元素包括：铸®、

彩(Sm)、得⑯、镉(Dy)等。

n铺面最为常用。

1

偶I系元素荧光特点：

U荧光寿命极长

0锢系元素螯合物（600-900us）[It：714us]

0普通荧光免疫中荧光团：1-lOOus

样本中蛋白质荧光：1-lOus,易猝灭。

uStokes位移大（大约290nm）

u铺：发射光613nm、激发光340nm,

u荧光素的Stokes位移为28nm。

u荧光特异性强。（发射光谱带很窄：613±5nm）

u解离-增强技术可使其荧光性提高100万倍。

1

TRFIA的技术特点（一）：时间分辨

时间分辨：利用镯系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检

测特异性荧光，而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为0。1

TRFIA的技术特点（二）：波长分辨

波长分辨：发射光谱与激发光谱间存在的巨大

Stokds位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱

与激发光谱完全分离。

1

TRFIA的技术特点（三）：多标记

1

TRFIA的技术特点（四）：

解离增强技术

增强液作用机理：加入增强液后，可以使Eu3+从反应复合物中解离下来，

游离的Eu3+同增强液中的另一种螯合剂形成一种胶态分子团，这种分子团

在激发光的激发下能够发出强烈荧光，信号可以增强100万倍。

增强液是提高检测灵敏度的一个关键因素。

1

WallacAutoDELFIA

1235

DR-M6601

1

五、化学发光免疫技术

0化学发光酶免疫分析(CLEIA)

。化学发光标记免疫分析(CLIA)

0电化学发光免疫分析(ECLIA)

1

化学发光酶免疫分析

(chemiluminescenceenzymeimmunoassay,CLE

0步骤与酶免疫测定相同，仅最后一步酶

反应所用底物为发光剂，通过化学反应

所发出的光在特定的仪器上进行测定。

0标记酶：HRP、AP

0发光剂：鲁米诺及衍生物、螺旋金刚烷

环氧化物苯磷酸酯等

1

EH2O2

AgH2O2

Ab

鲁米诺光信号检测器

CLEIA原理

1

化学发光酶免疫分析

0AO1系统：美国雅培公司

0XS系统：德国拜耳公司

0UAISON系统：德国W&ngtec公司

1

化学发光标记免疫分析

(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA)

0用化学发光剂直接标记抗原或抗体的一类免疫

测定。

。发光剂：三价铁一鲁米诺、口丫咤酯

0口丫咤酯/H2O2系统：即用口丫咤酯标记抗体或抗

原，用H2O2和NaOH作发光启动试剂，固相载

体为极细小的磁性颗粒。

1

++

Ag

发光物标记Ag

固相抗体

CLIA原理

1

化学发光标记免疫分析

0VitaKI系统：美国强生公司

QAooess系统：美国贝克曼公司

01mmuLite系统：美国DPC公司

1

电化学发光免疫分析

(electrochemiluminescenceimmunoassay,ECLIA

0限1皿)42+为标记物：

三联毗咤钉为水溶性，高稳定性的小分

子，可以确保电化学发光的高效性及稳定

性，并且无噪音干扰。

唾：类似EIA中底物，是01中的电子供

体，氧化后生成的中间产物是形成激发态

的如^的化学能来源

1

2+

电化学发光免疫测定原理

反应在阳电极表面进行，三联毗嗟钉和TPA可

同时失去电子发生氧化反应。二价的Ru(bpy)32+

被氧化成Ru(bpy)3,3+TPA被氧化成阳离子自由

基TPA;后者失去一个质子，成为自由基TPA•

,这是一个强还原剂，可将一个电子递给

Ru(bpy)3,使其成为激发态的Ru(bpy)3,

而TPA自身被氧化成TPA氧化产物，激发态的

Ru(bpy)3荏衰减时发射一个波长为620nm的

光字，重新生成基态的Ru(bpy)32+、寺一、计产人

电极表面周而复始地进行，产生许多兜子？便光

信号得以增强。1

电化学发光的发光及检测系统

Ru

acid

TPAi

H+

2+

RuRuTPA

alkalinestate3+TPA+i

Platinumelectrode

Magnet

独特的磁性微粒子

。微珠以及表面的凸凹使

包被面积极联式放大。

0载体悬浮于反应体系中

，使异相反应成类似均相

反应，大大加快反应速度

磁性微珠方便吸引分离

01

电化学发光全自动免疫分析系统

ElecsyslOlOElecsys2010

Elecsys2010E170

1

六、金标和磁珠免疫层析技术

原理：以微孔滤膜为载体，包被已知抗原

或抗体，加入待检标本后，经滤膜的毛细

管作用使标本中的抗体或抗原与膜上包被

的抗原或抗体结合，再通过胶体金或超顺

磁性纳米微粒结合物达到检测目的。

0斑点金免疫渗滤技术（DIGFA或GIFA）

0金标免疫层析技术（GICA）

0磁性免疫层析技术（MICT）

1

斑点金免疫渗滤

(Dotimmunogoldfiltration,DIGFA)

盖

微孔膜

吸水垫料

底

1

金标免疫层析法

(GoldImmunochromatographyAassay,

GICA)

1

胶体金免疫层析试纸条的检测原理及结果判定

质控线

检测线

阳性阴性失效

标记单抗及样品流动方向

1

磁性免疫层析技术

(MagneticImmuneChromatographicTest

，MICT)

ConventionalMARMagnetic

ImmunoassayImmunoassay

Antibody•GoldColloid

conjugate•Enzyme

•FluorophoresSuperparamagnetic

•LuminescentParticles60-380nm

Molecules

ExcitationEnzymesubstrateOscillating

LaserorvisiblelightMagneticField

Detection

VisualMeasures

AbsorptionMagnetizationof