let-7c-1对PTZ致痫大鼠学习记忆功能的影响

let--7c-1对PTZ致痫大鼠学习记忆功能的影响摘要本研究旨在探讨let--7c-1对戊四氮（PTZ）致痫大鼠学习记忆功能的影响。通过构建PTZ致痫大鼠模型，将大鼠随机分为正常对照组、PTZ致痫模型组、let--7c-1过表达组和阴性对照组，运用Morris水迷宫实验、Y迷宫实验等行为学方法评估大鼠学习记忆能力，结合实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Westernblot技术检测相关基因和蛋白的表达水平。结果表明，let--7c-1过表达能够显著改善PTZ致痫大鼠的学习记忆功能，其机制可能与调节神经炎症反应、抑制神经元凋亡以及影响突触可塑性相关信号通路有关。本研究为癫痫相关认知障碍的治疗提供了新的潜在靶点和理论依据。关键词let--7c-1；PTZ致痫大鼠；学习记忆功能；神经炎症；突触可塑性一、引言癫痫是一种常见的神经系统慢性疾病，全球约有6500万患者，我国癫痫患者人数超过1000万。癫痫发作不仅会导致患者出现抽搐、意识丧失等急性症状，还常伴有认知功能障碍，严重影响患者的生活质量[1]。学习记忆功能受损是癫痫患者常见的认知障碍表现之一，其发病机制复杂，涉及神经炎症、氧化应激、神经元凋亡、突触可塑性改变等多个方面[2]。微小RNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA，通过与靶mRNA的互补配对，在转录后水平调控基因表达，参与细胞增殖、分化、凋亡、代谢等多种生物学过程[3]。近年来研究发现，miRNA在神经系统发育、神经退行性疾病以及癫痫的发生发展过程中发挥着重要作用[4]。let--7c-1作为let--7家族的重要成员，已有研究表明其在肿瘤发生、细胞增殖等方面具有调控作用，但在癫痫相关认知障碍中的作用尚未明确[5]。戊四氮（PTZ）是一种常用的致痫剂，通过作用于γ-氨基丁酸（GABA）能神经系统，降低神经元的抑制性，诱导癫痫发作。PTZ致痫大鼠模型在癫痫发病机制研究和药物研发中广泛应用[6]。本研究通过构建PTZ致痫大鼠模型，探讨let--7c-1对PTZ致痫大鼠学习记忆功能的影响及其潜在机制，为癫痫相关认知障碍的治疗提供新的思路和靶点。二、材料与方法（一）实验动物选取健康雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠60只，6-8周龄，体重200-220g，购自[具体实验动物中心名称]。大鼠饲养于温度（22±2）℃、湿度50%-60%、12h昼夜交替的环境中，自由进食和饮水。适应性饲养7天后，进行后续实验。（二）主要试剂与仪器试剂：戊四氮（PTZ，Sigma公司）、let--7c-1mimics、阴性对照mimics（上海吉玛公司）、Trizol试剂（Invitrogen公司）、逆转录试剂盒（TaKaRa公司）、SYBRGreenPCRMasterMix（Roche公司）、兔抗大鼠Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、脑源性神经营养因子（BDNF）、突触素（Synapsin）、微管相关蛋白2（MAP2）抗体（CellSignalingTechnology公司）、羊抗兔IgG-HRP（JacksonImmunoResearch公司）。仪器：Morris水迷宫（上海欣软信息科技有限公司）、Y迷宫（上海欣软信息科技有限公司）、实时荧光定量PCR仪（RocheLightCycler480）、蛋白质电泳系统（Bio-Rad公司）、Westernblot转膜仪（Bio-Rad公司）、酶标仪（ThermoFisherScientific公司）。（三）实验分组与处理将60只SD大鼠随机分为4组，每组15只：正常对照组、PTZ致痫模型组、let--7c-1过表达组和阴性对照组。PTZ致痫模型构建：PTZ致痫模型组、let--7c-1过表达组和阴性对照组大鼠均采用腹腔注射PTZ（35mg/kg）的方法构建癫痫模型，每天注射1次，连续注射7天。正常对照组大鼠腹腔注射等体积的生理盐水。let--7c-1过表达处理：在第3次注射PTZ前1天，let--7c-1过表达组大鼠侧脑室注射let--7c-1mimics（5μL，100nmol/L），阴性对照组大鼠侧脑室注射等体积的阴性对照mimics。侧脑室注射方法：大鼠用10%水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上，根据大鼠脑立体定位图谱，以前囟为原点，在其前1.0mm、旁开1.5mm、深3.5mm处，用微量注射器缓慢注入相应试剂，注射速度为1μL/min，注射完毕后留针5min，缓慢拔出针头，用骨蜡封闭注射孔。（四）行为学检测Morris水迷宫实验：在最后一次注射PTZ后7天进行Morris水迷宫实验，评估大鼠的空间学习记忆能力。实验分为定位航行实验和空间探索实验两个阶段。定位航行实验：连续进行5天，每天上、下午各训练1次。将大鼠面向池壁分别从4个不同的入水点放入水池中，记录大鼠找到隐藏在水面下平台的逃避潜伏期（从入水到找到平台的时间），若大鼠在60s内未找到平台，则引导其至平台，逃避潜伏期记为60s。空间探索实验：定位航行实验结束后的第2天进行空间探索实验。撤去平台，将大鼠从与平台相对的象限入水，记录其在60s内穿越原平台所在象限的次数以及在各象限的停留时间。Y迷宫实验：Morris水迷宫实验结束后24h进行Y迷宫实验，评估大鼠的短期学习记忆能力。Y迷宫由3个等长的臂组成，每个臂长30cm、宽10cm、高15cm，相邻两臂夹角为120°。实验时，将大鼠放入Y迷宫的一个臂中，通过设置程序，使其中一个臂为安全区（无电击），另外两个臂为电击区（通以36V交流电）。记录大鼠在5min内进入各臂的总次数（自发交替次数）以及正确反应次数，计算自发交替反应率（自发交替反应率=自发交替次数/[总进入次数×（总进入次数-2）]×100%）和正确率（正确率=正确反应次数/总反应次数×100%）。（五）组织样本采集与处理行为学实验结束后，大鼠用10%水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔注射深度麻醉，迅速断头取脑，分离出海马组织。一部分海马组织置于液氮中速冻后转移至-80℃冰箱保存，用于RNA和蛋白质提取；另一部分海马组织置于4%多聚甲醛中固定，用于病理切片制作和免疫组织化学染色。（六）实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测采用Trizol试剂提取海马组织总RNA，按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。以cDNA为模板，利用SYBRGreenPCRMasterMix在实时荧光定量PCR仪上进行PCR扩增。引物序列如下：let--7c-1上游引物：5'-GAGGTAGTAGTTGTATAGTT-3'，下游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGTGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACCCT-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'；Bax上游引物：5'-CCGAGATGACAGTCCAGCAA-3'，下游引物：5'-GCCAGCTTCAGGTAGAGGC-3'；Bcl-2上游引物：5'-AGCCTTCCGAGAGGATGAAG-3'，下游引物：5'-CTTGGGCAGGGATTTCTTCT-3'；Cleaved-caspase-3上游引物：5'-CTGGACCTGGATGAGAAGGA-3'，下游引物：5'-GGTGCTGAGGTTCCTGTTCA-3'；BDNF上游引物：5'-GGCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'；Synapsin上游引物：5'-ATGGTGGTGGTGGTGGTGGT-3'，下游引物：5'-GGTGGTGGTGGTGGTGGTGG-3'；MAP2上游引物：5'-CCTGCTGCTGCTGCTGCTGCT-3'，下游引物：5'-GCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTG-3'。反应条件：95℃预变性10min；95℃变性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40个循环。以U6为内参，采用2^-ΔΔCt^法计算目的基因的相对表达量。（七）Westernblot检测取海马组织，加入适量的RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上匀浆裂解30min，4℃、12000r/min离心15min，取上清液，采用BCA法测定蛋白浓度。将蛋白样品与5×SDS上样缓冲液混合，煮沸5min使蛋白变性。取等量蛋白样品进行SDS电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶在室温下封闭2h，加入相应的一抗（Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase-3、BDNF、Synapsin、MAP2抗体，稀释比例均为1:1000），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗膜3次，每次10min，加入羊抗兔IgG-HRP（稀释比例为1:5000），室温孵育2h。再次用TBST洗膜3次，每次10min，采用化学发光法（ECL）显色，在凝胶成像系统下曝光显影，利用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。（八）免疫组织化学染色将固定好的海马组织经脱水、透明、石蜡包埋后，制作4μm厚的切片。切片脱蜡至水，进行抗原修复，3%过氧化氢溶液孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性，5%BSA封闭1h。加入一抗（BDNF、Synapsin、MAP2抗体，稀释比例均为1:200），4℃孵育过夜。次日，PBS洗片3次，每次5min，加入生物素标记的二抗，室温孵育1h。PBS洗片3次，每次5min，加入链霉亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（SABC），室温孵育1h。PBS洗片3次，每次5min，DAB显色，苏木精复染，脱水，透明，封片。在光学显微镜下观察并拍照，采用Image-ProPlus6.0软件分析阳性细胞数和平均光密度值。（九）统计学分析采用SPSS22.0统计软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。三、结果（一）let--7c-1过表达对PTZ致痫大鼠学习记忆功能的影响Morris水迷宫实验结果：定位航行实验结果显示，在训练的第1-5天，PTZ致痫模型组和阴性对照组大鼠的逃避潜伏期均显著长于正常对照组（P<0.05）；let--7c-1过表达组大鼠的逃避潜伏期在第3-5天显著短于PTZ致痫模型组和阴性对照组（P<0.05）（图1A）。空间探索实验结果显示，PTZ致痫模型组和阴性对照组大鼠穿越原平台所在象限的次数显著少于正常对照组（P<0.05），在目标象限的停留时间百分比也显著低于正常对照组（P<0.05）；let--7c-1过表达组大鼠穿越原平台所在象限的次数显著多于PTZ致痫模型组和阴性对照组（P<0.05），在目标象限的停留时间百分比也显著高于PTZ致痫模型组和阴性对照组（P<0.05）（图1B、C）。Y迷宫实验结果：PTZ致痫模型组和阴性对照组大鼠的自发交替反应率和正确率均显著低于正常对照组（P<0.05）；let--7c-1过表达组大鼠的自发交替反应率和正确率显著高于PTZ致痫模型组和阴性对照组（P<0.05）（图2A、B）。（二）let--7c-1过表达对PTZ致痫大鼠海马组织相关基因表达的影响qRT-PCR结果显示，与正常对照组相比，PTZ致痫模型组和阴性对照组大鼠海马组织中let--7c-1的表达水平显著降低（P<0.05），Bax、Cleaved-caspase-3的表达水平显著升高（P<0.05），Bcl-2、BDNF、Synapsin、MAP2的表达水平显著降低（P<0.05）。与PTZ致痫模型组和阴性对照组相比，let--7c-1过表达组大鼠海马组织中let--7c-1的表达水平显著升高（P<0.05），Bax、Cleaved-caspase-3的表达水平显著降低（P<0.05），Bcl-2、BDNF、Synapsin、MAP2的表达水平显著升高（P<0.05）（图3）。（三）let--7c-1过表达对PTZ致痫大鼠海马组织相关蛋白表达的影响Westernblot结果显示，与正常对照组相比，PTZ致痫模型组和阴性对照组大鼠海马组织中Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平显著升高（P<0.05），Bcl-2、BDNF、Synapsin、MAP2蛋白的表达水平显著降低（P<0.05）。与PTZ致痫模型组和阴性对照组相比，let--7c-1过表达组大鼠海马组织中Bax、Cleaved-caspase-3蛋白的表达水平显著降低（P<0.05），Bcl-2、BDNF、Synapsin、MAP2蛋白的表达水平显著升高（P<0.05）（图4）。（四）免疫组织化学染色结果免疫组织化学染色结果显示，与正常对照组相比，PTZ致痫模