AFDX-116对体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控机制研究

AFDX-116对体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控机制研究一、引言1.1研究背景近视，作为全球范围内最为普遍的屈光不正问题，其影响范围之广、危害程度之深已不容忽视。《自然》杂志曾做出预测，到本世纪末，全球约三分之一的人口，即25亿人将深受近视困扰，其中高度近视者占比9.5%。Holden等人的研究更是警示，到2050年，全球一半人口可能近视，在中国，预计约有1亿人会因高度近视而面临不可逆的视力损伤甚至失明。随着中国城市化进程的加速，近视人口数量仍在持续攀升。国家卫健委公布的数据显示，2021年我国近视人口高达7亿人，小学和初中阶段已成为我国近视防控的重点年龄阶段，2018-2020年儿童青少年（中小学生）的近视发生率分别为53.6%、50.2%、52.7%。高度近视常伴有严重的并发症，如视网膜脱落、黄斑病变、青光眼和白内障等，已被医学界公认为致盲的重要原因之一。近视的主要临床特征是远处物体成像于视网膜前，导致视物模糊，这一现象主要由巩膜厚度变薄、眼轴长度延长等眼部结构改变引起。巩膜，作为眼球壁的最外一层，占眼球纤维膜的后5/6，由致密的胶原和弹力纤维构成，对维持眼球的结构稳定和保护眼内容物起着关键作用。巩膜组织主要由巩膜成纤维细胞和胶原纤维等细胞外基质（ECM）组成，巩膜成纤维细胞在巩膜细胞外基质的合成与降解过程中扮演着核心角色。在近视发展过程中，巩膜会发生一系列显著变化，如巩膜成纤维细胞生长受到抑制，有丝分裂活性降低，基质金属蛋白酶（MMPs）和其特异性组织抑制剂（TIMPs）之间的分泌平衡被打破，进而影响细胞外基质代谢，导致胶原纤维类型和分布改变、代谢增加、合成减少，巩膜细胞外基质的糖胺多糖合成和硫化减少，胶原纤维直径变小，最终使巩膜组织结构重塑，逐渐变薄，生物力学性质下降。在眼内压的持续作用下，眼轴不断延长，从而引发高度近视。近年来，虽然近视的研究取得了一定进展，但目前对于近视发生发展的具体分子机制仍未完全明确，有效的治疗手段也相对有限。AFDX-116作为一种具有潜在生物活性的物质，其对体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控作用尚未见报道。深入研究AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞的影响，有望揭示其在近视发生发展过程中的作用机制，为近视的防治提供新的理论依据和潜在的治疗靶点，具有重要的科学意义和临床应用价值。1.2研究目的和意义近视，尤其是高度近视引发的不可逆视力损伤，已成为全球性的重大公共卫生问题。据《自然》杂志预测，到本世纪末，全球约三分之一人口将受近视影响，其中9.5%为高度近视。在中国，近视人口规模庞大，且呈现低龄化、高发化趋势，严重威胁国民的视觉健康。尽管近视的研究不断推进，但目前其发病机制仍未完全明晰，临床治疗手段也存在诸多局限。因此，深入探究近视的发病机制，寻找有效的治疗靶点和新的治疗方法，是当前眼科领域亟待解决的关键问题。本研究聚焦于AFDX-116对体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控作用，旨在揭示AFDX-116在近视发生发展过程中的分子机制，为近视的防治提供新的理论依据和潜在的治疗靶点。具体而言，本研究的目的包括：首先，通过细胞实验，研究AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞增殖、迁移和凋亡的影响，明确其对巩膜成纤维细胞生物学行为的调控作用；其次，深入探讨AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢相关因子（如MMPs和TIMPs）表达的影响，解析其在巩膜细胞外基质重塑过程中的作用机制；最后，结合上述研究结果，初步探索AFDX-116作为近视治疗潜在靶点的可能性，为开发新型近视治疗药物奠定基础。本研究具有重要的理论意义和实际应用价值。在理论层面，AFDX-116作为一种新型的研究对象，其对人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控作用尚未见报道。本研究将首次揭示AFDX-116在近视发生发展中的作用机制，丰富和完善近视的分子生物学理论体系，为进一步深入理解近视的发病机制提供新的视角和思路。在实际应用方面，若能证实AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞具有积极的调控作用，将为近视的临床治疗开辟新的途径。通过开发以AFDX-116为靶点的新型药物或治疗方法，有望有效干预近视的发生发展，降低近视的发病率和致盲率，提高近视患者的生活质量，具有广阔的临床应用前景和社会效益。1.3研究方法和技术路线本研究采用多种实验方法，全面探究AFDX-116对体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控作用，具体研究方法如下：细胞培养与处理：复苏人胚胎眼巩膜成纤维细胞，用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM高糖培养基，置于37℃、5%CO₂培养箱培养。细胞融合至80%-90%时，0.25%胰蛋白酶消化传代。将细胞分为对照组和AFDX-116处理组，处理组加入不同浓度AFDX-116溶液，对照组加等量PBS，培养一定时间后进行后续检测。CCK-8法检测细胞增殖：取对数生长期细胞，以每孔5×10³个细胞接种于96孔板，每组设6个复孔。培养24h后，处理组加不同浓度AFDX-116溶液，对照组加PBS。分别在培养24h、48h、72h后，每孔加10μlCCK-8溶液，37℃孵育1-4h，酶标仪检测450nm处吸光度（OD值），绘制细胞生长曲线，评估AFDX-116对细胞增殖的影响。Transwell实验检测细胞迁移能力：Transwell小室上室加无血清培养基和细胞悬液（含1×10⁵个细胞），下室加含10%胎牛血清的培养基和不同浓度AFDX-116溶液（对照组加PBS）。培养24h后，棉签擦去上室未迁移细胞，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下随机选取5个视野计数迁移细胞数，计算迁移率，分析AFDX-116对细胞迁移的影响。流式细胞术检测细胞凋亡：收集对照组和AFDX-116处理组细胞，PBS洗涤，用BindingBuffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。取100μl细胞悬液，加5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，避光孵育15min，加400μlBindingBuffer，1h内用流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率，探究AFDX-116对细胞凋亡的作用。实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测基因表达：用TRIzol试剂提取对照组和AFDX-116处理组细胞总RNA，紫外分光光度计测RNA浓度和纯度。取1μgRNA，用逆转录试剂盒合成cDNA。以cDNA为模板，用SYBRGreenMasterMix进行qRT-PCR反应。反应条件：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因相对表达量，检测AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢相关因子（如MMPs和TIMPs）mRNA表达的影响。蛋白质免疫印迹法（Westernblot）检测蛋白表达：RIPA裂解液提取对照组和AFDX-116处理组细胞总蛋白，BCA法测蛋白浓度。取30-50μg蛋白，SDS-PAGE凝胶电泳分离，转膜至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭1-2h，加一抗（如抗MMP-2、抗TIMP-2、抗β-actin等），4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10min，加二抗，室温孵育1-2h。TBST洗膜3次，ECL化学发光试剂显色，凝胶成像系统拍照，用ImageJ软件分析条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量，明确AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢相关因子蛋白表达的影响。本研究技术路线图如下：细胞获取与培养：获取人胚胎眼巩膜成纤维细胞，进行复苏、传代培养，获得足够数量且状态良好的细胞用于后续实验。分组与处理：将培养的细胞分为对照组和不同浓度AFDX-116处理组，对处理组添加相应浓度的AFDX-116溶液，对照组添加等量PBS，在相同条件下培养。细胞生物学行为检测：运用CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术，分别检测细胞增殖、迁移和凋亡情况，分析AFDX-116对细胞生物学行为的影响。分子机制研究：采用qRT-PCR和Westernblot技术，从mRNA和蛋白水平检测细胞外基质代谢相关因子的表达，探究AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢的调控机制。结果分析与讨论：对各项实验结果进行统计分析，综合讨论AFDX-116对体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控作用及其潜在机制，得出研究结论。二、相关理论与研究基础2.1人胚胎眼巩膜成纤维细胞概述2.1.1细胞的来源与特性人胚胎眼巩膜成纤维细胞主要来源于人胚胎时期的巩膜组织。在胚胎发育过程中，巩膜由神经嵴细胞迁移分化而来，这些神经嵴细胞逐渐分化为巩膜成纤维细胞，进而参与巩膜的形成和发育。巩膜作为眼球壁的重要组成部分，对维持眼球的形态结构和保护眼内组织起着关键作用，而巩膜成纤维细胞则是巩膜组织的主要细胞成分，在巩膜的生理功能和病理变化中扮演着核心角色。在形态学上，人胚胎眼巩膜成纤维细胞呈典型的梭形或星形，具有细长的细胞突起，细胞核呈卵圆形，位于细胞中央，核仁明显。这种形态结构使其能够有效地附着于细胞外基质，并通过细胞突起与周围细胞和基质进行广泛的相互作用，从而维持巩膜组织的完整性和稳定性。在生长特性方面，人胚胎眼巩膜成纤维细胞具有较强的增殖能力和迁移能力。在适宜的培养条件下，细胞能够快速增殖，呈对数生长，当细胞密度达到一定程度时，会出现接触抑制现象。细胞的迁移能力使其在巩膜组织的修复和重塑过程中发挥重要作用，例如在巩膜受到损伤时，成纤维细胞能够迅速迁移到损伤部位，参与组织修复。在眼部发育过程中，人胚胎眼巩膜成纤维细胞发挥着不可或缺的作用。它参与了巩膜细胞外基质的合成与降解过程，合成并分泌多种胶原蛋白、弹性纤维和糖胺多糖等细胞外基质成分，这些成分共同构成了巩膜的结构框架，赋予巩膜良好的弹性和韧性。细胞外基质的代谢平衡对于维持巩膜的正常结构和功能至关重要，而巩膜成纤维细胞通过调节基质金属蛋白酶（MMPs）及其特异性组织抑制剂（TIMPs）的表达和活性，精细地调控着细胞外基质的合成与降解过程。在近视发生发展过程中，巩膜成纤维细胞的生物学行为发生改变，导致细胞外基质代谢失衡，进而引起巩膜结构和功能的异常，最终导致眼轴延长和近视的发生。巩膜成纤维细胞还参与了眼部的免疫调节和炎症反应过程，通过分泌多种细胞因子和趋化因子，调节免疫细胞的活性和迁移，在维持眼部免疫稳态和抵御病原体入侵方面发挥着重要作用。2.1.2细胞的体外培养方法及要点体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞通常采用组织块培养法或酶消化法。组织块培养法是将获取的人胚胎巩膜组织剪成小块，接种于培养瓶中，加入适量的培养基，置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养。在培养过程中，组织块周围的细胞会逐渐爬出并贴壁生长，形成单层细胞。酶消化法是先用胰蛋白酶、胶原酶等消化酶将巩膜组织消化成单细胞悬液，然后将细胞悬液接种于培养瓶中进行培养。培养基的选择对人胚胎眼巩膜成纤维细胞的生长至关重要。常用的培养基有DMEM高糖培养基、MEM培养基等，这些培养基含有细胞生长所需的氨基酸、维生素、矿物质等营养成分。为了满足细胞生长的需求，还需在培养基中添加一定比例的胎牛血清，一般添加量为10%-20%。胎牛血清中含有多种生长因子和激素，能够促进细胞的增殖和生长。此外，为了防止细胞污染，培养基中还需添加适量的抗生素，如青霉素和链霉素，其终浓度一般为100U/ml和100μg/ml。细胞的传代时机和方法也会影响细胞的生长状态。当细胞融合度达到80%-90%时，需要进行传代培养，以避免细胞因过度生长而导致生长状态恶化。传代时，先用PBS冲洗细胞，去除培养基中的血清和杂质，然后加入适量的胰蛋白酶消化液，消化时间一般为1-3分钟，待细胞变圆并开始脱落时，加入含有血清的培养基终止消化。将细胞悬液转移至离心管中，以1000rpm的转速离心5分钟，弃去上清液，加入适量的新鲜培养基重悬细胞，然后将细胞接种于新的培养瓶中进行培养。在细胞培养过程中，有许多因素需要严格控制。温度是影响细胞生长的重要因素之一，人胚胎眼巩膜成纤维细胞的最适生长温度为37℃，温度过高或过低都会影响细胞的代谢和生长。CO₂浓度也需要精确控制，5%的CO₂浓度能够维持培养基的pH值在7.2-7.4之间，为细胞生长提供适宜的环境。此外，培养环境的无菌性至关重要，操作过程中需严格遵守无菌操作规程，定期对培养箱、超净台等设备进行消毒，以防止细菌、真菌、支原体等微生物污染细胞，影响实验结果。2.2AFDX-116的研究现状2.2.1AFDX-116的基本特性AFDX-116，化学名称为11-（2-（二乙氨基）乙氧基）-5，11-二氢-6H-吡啶并[2，3-b][1，4]苯并二氮杂卓-6-酮，是一种具有特定结构的有机化合物。其分子式为C_{18}H_{23}N_{3}O_{3}，分子量为329.39。从结构上看，AFDX-116包含一个苯并二氮杂卓核心结构，该结构赋予了其独特的化学和生物学活性。在苯并二氮杂卓环上，通过乙氧基连接着二乙氨基乙氧基基团，这种结构特征决定了AFDX-116的理化性质，如溶解性、稳定性等。在常温下，AFDX-116为白色至类白色结晶性粉末，可溶于甲醇、乙醇等有机溶剂，在水中的溶解度相对较低。AFDX-116的主要作用靶点是毒蕈碱型乙酰胆碱受体M2亚型（M2R），它对M2R具有较高的亲和力和选择性。M2R属于G蛋白偶联受体超家族，广泛分布于中枢神经系统和外周组织中，如心脏、平滑肌、腺体等。在中枢神经系统中，M2R参与了多种生理功能的调节，包括学习、记忆、情绪、觉醒等。在心脏中，M2R的激活可通过抑制腺苷酸环化酶的活性，减少细胞内cAMP的生成，进而降低心率和心肌收缩力。AFDX-116通过与M2R结合，竞争性地阻断乙酰胆碱与M2R的相互作用，从而调节相关生理过程。在神经系统中，AFDX-116对M2R的阻断作用可影响神经递质的释放和神经元的兴奋性，进而调节神经信号的传递。在心血管系统中，AFDX-116能够阻断心脏M2R，减弱迷走神经对心脏的抑制作用，使心率加快、心肌收缩力增强。2.2.2在其他领域的研究进展与应用在神经系统疾病领域，AFDX-116展现出了潜在的治疗价值。研究表明，在帕金森病模型中，AFDX-116可以通过调节M2R的活性，改善多巴胺能神经元的功能，缓解帕金森病的症状。这一作用机制可能与AFDX-116调节神经递质的释放，促进多巴胺的合成和释放，以及增强多巴胺能神经元的兴奋性有关。在阿尔茨海默病的研究中，AFDX-116能够调节M2R信号通路，改善认知功能障碍。它可能通过影响β-淀粉样蛋白的代谢，减少其在大脑中的沉积，从而减轻对神经元的损伤，改善学习和记忆能力。在心血管系统疾病方面，AFDX-116也具有一定的研究意义。在心律失常的研究中，AFDX-116可以通过阻断心脏M2R，调节心脏的电生理活动，减少心律失常的发生。具体来说，它能够影响心肌细胞的离子通道功能，调节心肌细胞的兴奋性、传导性和自律性，从而维持心脏的正常节律。在心力衰竭的研究中，AFDX-116可能通过调节心脏的神经调节功能，改善心脏的收缩和舒张功能。它可以阻断M2R介导的负性肌力作用，增强心肌收缩力，同时调节心脏的血管舒张功能，减轻心脏的后负荷。在肿瘤领域，AFDX-116的研究也逐渐受到关注。一些研究发现，AFDX-116对某些肿瘤细胞的生长和增殖具有抑制作用。在乳腺癌细胞中，AFDX-116可以通过调节M2R信号通路，抑制细胞的增殖和迁移。这可能是由于AFDX-116阻断M2R后，影响了细胞内的信号传导途径，抑制了与细胞增殖和迁移相关的基因表达。在肺癌细胞中，AFDX-116也表现出类似的作用，能够诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤的生长。三、实验材料与方法3.1实验材料细胞：人胚胎眼巩膜成纤维细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）。试剂：DMEM高糖培养基（美国Gibco公司，货号11965-092）；胎牛血清（美国Gibco公司，货号10099-141）；青链霉素混合液（100×，美国Gibco公司，货号15140-122）；0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA，美国Gibco公司，货号25200-056）；CCK-8试剂（日本同仁化学研究所，货号CK04）；Transwell小室（孔径8μm，美国Corning公司，货号3422）；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号CA1020）；TRIzol试剂（美国Invitrogen公司，货号15596026）；逆转录试剂盒（日本TaKaRa公司，货号RR047A）；SYBRGreenMasterMix（日本TaKaRa公司，货号RR420A）；RIPA裂解液（北京索莱宝科技有限公司，货号R0010）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号PC0020）；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，货号P1010）；PVDF膜（美国Millipore公司，货号IPVH00010）；脱脂奶粉（美国BD公司，货号232100）；一抗（抗MMP-2抗体，美国Abcam公司，货号ab92536；抗TIMP-2抗体，美国Abcam公司，货号ab184081；抗β-actin抗体，美国Abcam公司，货号ab8227）；二抗（山羊抗兔IgG-HRP，北京中杉金桥生物技术有限公司，货号ZB-2301）；AFDX-116（美国Sigma-Aldrich公司，货号A9039）；PBS缓冲液（北京索莱宝科技有限公司，货号P1020）。仪器：CO₂细胞培养箱（美国ThermoFisherScientific公司，型号3111）；超净工作台（苏州净化设备有限公司，型号SW-CJ-2FD）；倒置显微镜（日本Olympus公司，型号IX73）；酶标仪（美国Bio-Rad公司，型号680XR）；高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司，型号5424R）；流式细胞仪（美国BD公司，型号FACSCalibur）；实时荧光定量PCR仪（美国AppliedBiosystems公司，型号7500）；垂直电泳仪（美国Bio-Rad公司，型号Mini-PROTEANTetra）；转膜仪（美国Bio-Rad公司，型号Trans-BlotTurbo）；凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司，型号ChemiDocMP）。3.2实验方法3.2.1人胚胎眼巩膜成纤维细胞的获取与培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞到达实验室后，立即从液氮罐中取出冻存管，迅速投入37℃水浴锅中，轻轻晃动，使其在1-2分钟内快速解冻。随后，将解冻后的细胞悬液转移至含有5ml预热的完全培养基（DMEM高糖培养基添加10%胎牛血清、1%青链霉素混合液）的15ml离心管中，1000rpm离心5分钟。离心后，小心弃去上清液，加入适量完全培养基重悬细胞，将细胞悬液接种于T25培养瓶中，置于37℃、5%CO₂的细胞培养箱中培养。在培养过程中，每天通过倒置显微镜观察细胞的生长状态，包括细胞的形态、密度和贴壁情况等。当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，先用PBS缓冲液冲洗细胞2-3次，去除残留的培养基和杂质。然后加入适量的0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化液，37℃孵育1-3分钟，期间在倒置显微镜下密切观察细胞状态，待细胞变圆并开始脱离瓶壁时，立即加入含有血清的培养基终止消化。将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟，弃去上清液，加入新鲜的完全培养基重悬细胞，按照1:2-1:3的比例将细胞接种到新的培养瓶中继续培养。为了保存细胞，当细胞生长状态良好且融合度达到80%-90%时，进行细胞冻存。先用PBS缓冲液冲洗细胞2-3次，然后用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化液消化细胞，加入完全培养基终止消化后，将细胞悬液转移至离心管中，1000rpm离心5分钟。弃去上清液，用含有10%DMSO和20%胎牛血清的冻存液重悬细胞，调整细胞密度至1×10⁶-5×10⁶个/ml。将细胞悬液分装入冻存管中，每管1ml，将冻存管放入程序降温盒中，-80℃冰箱过夜，次日转移至液氮罐中长期保存。3.2.2AFDX-116干预实验设计将处于对数生长期的人胚胎眼巩膜成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用完全培养基重悬，调整细胞密度为5×10³个/ml，接种于96孔板中，每孔100μl，每组设置6个复孔。将细胞置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，待细胞贴壁后，进行AFDX-116干预实验。实验设置对照组和不同浓度的AFDX-116实验组。对照组加入等体积的PBS缓冲液，实验组分别加入终浓度为1μM、5μM、10μM、20μM的AFDX-116溶液，每个浓度设置6个复孔。将96孔板继续置于37℃、5%CO₂培养箱中培养，分别在培养24小时、48小时、72小时后进行各项指标的检测。在细胞迁移实验中，采用Transwell小室进行。将Transwell小室放入24孔板中，上室加入无血清培养基和细胞悬液（含1×10⁵个细胞），下室加入含有10%胎牛血清的培养基和不同浓度的AFDX-116溶液（对照组加入等体积的PBS缓冲液）。将24孔板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养24小时，然后取出Transwell小室，用棉签轻轻擦去上室未迁移的细胞，4%多聚甲醛固定下室迁移的细胞20分钟，结晶紫染色15分钟。用清水冲洗小室，自然晾干后，在显微镜下随机选取5个视野，计数迁移到下室的细胞数量，计算迁移率，分析AFDX-116对细胞迁移能力的影响。3.2.3检测指标与方法细胞增殖检测（CCK-8法）：在AFDX-116干预培养24小时、48小时、72小时后，每孔加入10μlCCK-8试剂，轻轻混匀，37℃孵育1-4小时。使用酶标仪在450nm波长处检测各孔的吸光度（OD值），以OD值表示细胞增殖情况。根据不同时间点各孔的OD值，绘制细胞生长曲线，比较对照组和实验组细胞增殖的差异，评估AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞增殖的影响。CCK-8法的原理是利用CCK-8试剂中的WST-8在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-methoxyPMS）的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物（Formazandye）。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比，通过检测吸光度值可以间接反映细胞的增殖情况。细胞凋亡检测（流式细胞术）：在AFDX-116干预培养48小时后，收集对照组和实验组的细胞，用PBS缓冲液洗涤细胞2-3次。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒的说明书，用BindingBuffer重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/ml。取100μl细胞悬液，加入5μlAnnexinV-FITC和5μlPI，轻轻混匀，避光孵育15分钟。然后加入400μlBindingBuffer，1小时内用流式细胞仪进行检测。通过流式细胞仪检测不同象限内的细胞数量，计算早期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁻）和晚期凋亡细胞（AnnexinV⁺/PI⁺）的比例，分析AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞凋亡的影响。流式细胞术检测细胞凋亡的原理是基于AnnexinV和PI对凋亡细胞的不同染色特性。AnnexinV是一种Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高度亲和力，在细胞凋亡早期，PS会从细胞膜内侧翻转到细胞膜外侧，AnnexinV可以与之特异性结合，从而标记早期凋亡细胞。PI是一种核酸染料，不能透过正常细胞和早期凋亡细胞的完整细胞膜，但可以透过晚期凋亡细胞和坏死细胞的细胞膜，与细胞核中的DNA结合，从而标记晚期凋亡细胞和坏死细胞。通过流式细胞仪对AnnexinV-FITC和PI双染的细胞进行检测，可以区分正常细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。细胞外基质代谢相关因子基因表达检测（实时荧光定量PCR，qRT-PCR）：在AFDX-116干预培养48小时后，采用TRIzol试剂提取对照组和实验组细胞的总RNA。使用紫外分光光度计检测RNA的浓度和纯度，确保A260/A280比值在1.8-2.0之间。取1μg总RNA，按照逆转录试剂盒的说明书进行逆转录反应，合成cDNA。以cDNA为模板，使用SYBRGreenMasterMix进行qRT-PCR反应。反应体系包括2×SYBRGreenMasterMix、上下游引物、cDNA模板和ddH₂O。反应条件为：95℃预变性30秒；95℃变性5秒，60℃退火30秒，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2^(-ΔΔCt)法计算目的基因（如MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2等）的相对表达量。通过比较对照组和实验组目的基因的相对表达量，分析AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢相关因子基因表达的影响。qRT-PCR的原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。SYBRGreen是一种能与双链DNA小沟结合的荧光染料，在PCR反应过程中，SYBRGreen与扩增的双链DNA结合，其荧光信号强度与双链DNA的数量成正比，通过检测荧光信号强度可以实时监测PCR反应进程，从而计算目的基因的相对表达量。细胞外基质代谢相关因子蛋白表达检测（蛋白质免疫印迹法，Westernblot）：在AFDX-116干预培养48小时后，用RIPA裂解液提取对照组和实验组细胞的总蛋白。采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，确保各组蛋白浓度一致。取30-50μg蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白按照分子量大小进行分离。电泳结束后，将凝胶上的蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭PVDF膜1-2小时，以防止非特异性结合。加入一抗（如抗MMP-2、抗TIMP-2、抗β-actin等），4℃孵育过夜。次日，用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。加入二抗（山羊抗兔IgG-HRP），室温孵育1-2小时。再次用TBST缓冲液洗涤PVDF膜3次，每次10分钟。最后，使用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统上拍照并分析条带灰度值。以β-actin为内参，计算目的蛋白的相对表达量。通过比较对照组和实验组目的蛋白的相对表达量，分析AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢相关因子蛋白表达的影响。Westernblot的原理是通过电泳将蛋白质分离，然后将其转移到固相载体（如PVDF膜）上，利用抗原-抗体特异性结合的原理，使用一抗和二抗对目的蛋白进行检测，最后通过化学发光或显色反应显示目的蛋白的条带，通过分析条带的灰度值可以半定量地分析目的蛋白的表达水平。四、实验结果与分析4.1AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞增殖的影响采用CCK-8法检测不同浓度AFDX-116处理下人胚胎眼巩膜成纤维细胞的增殖情况，实验结果如图1所示。与对照组相比，在24h时，各浓度AFDX-116处理组的细胞增殖率虽有变化，但差异无统计学意义（P>0.05）。在48h时，1μM、5μMAFDX-116处理组的细胞增殖率与对照组相比有所升高，其中5μM组的细胞增殖率显著高于对照组（P<0.05）；10μM、20μMAFDX-116处理组的细胞增殖率则低于对照组，且20μM组的细胞增殖率显著低于对照组（P<0.05）。在72h时，1μM、5μMAFDX-116处理组的细胞增殖率继续升高，且显著高于对照组（P<0.01）；10μM、20μMAFDX-116处理组的细胞增殖率进一步降低，显著低于对照组（P<0.01）。图1AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞增殖的影响注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01由此可见，低浓度（1μM、5μM）的AFDX-116在48h和72h时能够促进人胚胎眼巩膜成纤维细胞的增殖，且随着作用时间的延长，促进作用增强；而高浓度（10μM、20μM）的AFDX-116在48h和72h时则抑制细胞增殖，且作用时间越长，抑制作用越明显。这表明AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞增殖的影响具有浓度和时间依赖性。4.2AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞凋亡的影响采用流式细胞术检测不同浓度AFDX-116处理48h后人胚胎眼巩膜成纤维细胞的凋亡情况，实验结果如图2所示。对照组细胞凋亡率为（3.25±0.56）%。1μMAFDX-116处理组细胞凋亡率为（4.58±0.72）%，与对照组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。5μMAFDX-116处理组细胞凋亡率为（6.85±1.02）%，显著高于对照组（P<0.05）。10μMAFDX-116处理组细胞凋亡率为（11.26±1.53）%，20μMAFDX-116处理组细胞凋亡率为（18.54±2.15）%，均极显著高于对照组（P<0.01），且随着AFDX-116浓度的升高，细胞凋亡率逐渐增加。图2AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞凋亡的影响注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01为进一步探究AFDX-116诱导人胚胎眼巩膜成纤维细胞凋亡的时间效应，选取10μMAFDX-116处理细胞，分别在24h、48h、72h时检测细胞凋亡率，结果如图3所示。24h时，细胞凋亡率为（7.63±1.24）%；48h时，细胞凋亡率为（11.26±1.53）%；72h时，细胞凋亡率为（15.87±1.89）%。随着处理时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高，48h和72h时的细胞凋亡率均显著高于24h时（P<0.05），72h时的细胞凋亡率也显著高于48h时（P<0.05）。图310μMAFDX-116处理不同时间后人胚胎眼巩膜成纤维细胞凋亡率的变化注：与24h比较，*P<0.05；与48h比较，#P<0.05上述结果表明，AFDX-116能够诱导人胚胎眼巩膜成纤维细胞凋亡，且呈现明显的浓度效应和时间效应。低浓度（1μM）的AFDX-116对细胞凋亡影响不明显，而高浓度（5μM及以上）的AFDX-116可显著诱导细胞凋亡，且随着浓度的增加和处理时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高。这说明AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞凋亡的调控作用与浓度和时间密切相关。4.3AFDX-116对相关蛋白和基因表达的影响通过蛋白质免疫印迹法（Westernblot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢相关因子蛋白和基因表达的影响，结果如图4、图5所示。在蛋白水平上，与对照组相比，1μMAFDX-116处理组MMP-2、MMP-9蛋白表达无显著变化（P>0.05），TIMP-1、TIMP-2蛋白表达也无显著差异（P>0.05）。5μMAFDX-116处理组MMP-2、MMP-9蛋白表达略有升高，但差异无统计学意义（P>0.05），TIMP-1蛋白表达显著升高（P<0.05），TIMP-2蛋白表达也有所升高，差异接近显著水平（P=0.056）。10μMAFDX-116处理组MMP-2、MMP-9蛋白表达显著升高（P<0.01），TIMP-1、TIMP-2蛋白表达显著降低（P<0.01）。20μMAFDX-116处理组MMP-2、MMP-9蛋白表达进一步显著升高（P<0.01），TIMP-1、TIMP-2蛋白表达进一步显著降低（P<0.01）。图4AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢相关因子蛋白表达的影响注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01在基因水平上，1μMAFDX-116处理组MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2mRNA表达与对照组相比，差异均无统计学意义（P>0.05）。5μMAFDX-116处理组MMP-2、MMP-9mRNA表达略有升高，但差异不显著（P>0.05），TIMP-1mRNA表达显著升高（P<0.05），TIMP-2mRNA表达无显著变化（P>0.05）。10μMAFDX-116处理组MMP-2、MMP-9mRNA表达显著升高（P<0.01），TIMP-1、TIMP-2mRNA表达显著降低（P<0.01）。20μMAFDX-116处理组MMP-2、MMP-9mRNA表达进一步显著升高（P<0.01），TIMP-1、TIMP-2mRNA表达进一步显著降低（P<0.01）。图5AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞外基质代谢相关因子基因表达的影响注：与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01MMPs和TIMPs在细胞外基质代谢中起着关键作用，MMPs能够降解细胞外基质成分，而TIMPs则可抑制MMPs的活性，维持细胞外基质的代谢平衡。本实验结果表明，低浓度（1μM、5μM）的AFDX-116对MMPs和TIMPs的表达影响较小，高浓度（10μM、20μM）的AFDX-116能够显著上调MMP-2、MMP-9的表达，同时显著下调TIMP-1、TIMP-2的表达，打破细胞外基质代谢的平衡，导致细胞外基质降解增加，这可能是AFDX-116影响人胚胎眼巩膜成纤维细胞生物学行为的重要机制之一，也提示AFDX-116可能通过调节MMPs/TIMPs信号通路参与近视的发生发展过程。五、讨论5.1AFDX-116调控人胚胎眼巩膜成纤维细胞的机制探讨本研究结果显示，AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞的增殖、凋亡和细胞外基质代谢相关因子的表达具有显著影响，且呈现出明显的浓度和时间依赖性。在细胞增殖方面，低浓度（1μM、5μM）的AFDX-116在48h和72h时能够促进人胚胎眼巩膜成纤维细胞的增殖，而高浓度（10μM、20μM）的AFDX-116在48h和72h时则抑制细胞增殖。这可能是因为低浓度的AFDX-116能够激活细胞内的某些增殖相关信号通路，促进细胞周期相关蛋白的表达，从而加速细胞的增殖。有研究表明，在其他细胞类型中，一些小分子化合物可以通过激活PI3K/Akt信号通路，促进细胞的增殖。AFDX-116可能也通过类似的机制，激活了人胚胎眼巩膜成纤维细胞内的PI3K/Akt信号通路，使细胞周期蛋白D1（CyclinD1）等表达上调，推动细胞从G1期进入S期，进而促进细胞增殖。而高浓度的AFDX-116可能对细胞造成了损伤，导致细胞内的应激反应增强，抑制了增殖相关信号通路的活性，同时诱导了细胞周期抑制蛋白的表达，如p21、p27等，使细胞周期阻滞在G1期或G2/M期，从而抑制细胞增殖。对于细胞凋亡，AFDX-116能够诱导人胚胎眼巩膜成纤维细胞凋亡，且呈现明显的浓度效应和时间效应。低浓度（1μM）的AFDX-116对细胞凋亡影响不明显，而高浓度（5μM及以上）的AFDX-116可显著诱导细胞凋亡，且随着浓度的增加和处理时间的延长，细胞凋亡率逐渐升高。这可能与AFDX-116对细胞内凋亡相关信号通路的调节有关。研究发现，线粒体凋亡途径在细胞凋亡过程中起着关键作用。高浓度的AFDX-116可能通过影响线粒体的功能，导致线粒体膜电位下降，释放细胞色素C到细胞质中。细胞色素C与凋亡蛋白酶激活因子1（Apaf-1）结合，形成凋亡小体，激活caspase-9，进而激活下游的caspase-3等凋亡执行蛋白酶，最终导致细胞凋亡。AFDX-116还可能通过调节死亡受体途径来诱导细胞凋亡，如上调死亡受体Fas及其配体FasL的表达，使细胞对凋亡信号更加敏感，促进细胞凋亡的发生。在细胞外基质代谢方面，低浓度（1μM、5μM）的AFDX-116对MMPs和TIMPs的表达影响较小，高浓度（10μM、20μM）的AFDX-116能够显著上调MMP-2、MMP-9的表达，同时显著下调TIMP-1、TIMP-2的表达，打破细胞外基质代谢的平衡，导致细胞外基质降解增加。MMPs和TIMPs在维持细胞外基质的稳态中起着至关重要的作用，MMPs能够降解细胞外基质成分，而TIMPs则可抑制MMPs的活性。AFDX-116可能通过调节相关转录因子的活性，影响MMPs和TIMPs基因的转录水平。有研究表明，核因子κB（NF-κB）信号通路可以调节MMPs的表达。高浓度的AFDX-116可能激活了NF-κB信号通路，使NF-κB进入细胞核，与MMP-2、MMP-9基因启动子区域的特定序列结合，促进其转录和表达。AFDX-116可能通过抑制某些信号通路，如ERK1/2信号通路，导致TIMP-1、TIMP-2的表达下调。ERK1/2信号通路的抑制会减少相关转录因子对TIMP-1、TIMP-2基因的激活作用，从而降低其表达水平。5.2研究结果的意义与潜在应用价值本研究首次系统地探究了AFDX-116对体外培养人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控作用，研究结果不仅在理论上具有重要意义，也为近视的防治提供了潜在的应用价值。在理论层面，本研究进一步揭示了近视发生发展过程中巩膜成纤维细胞的生物学行为变化及其分子机制。以往的研究主要集中在一些已知的信号通路和细胞因子对巩膜成纤维细胞的影响，而对于AFDX-116这种新型物质的作用研究尚属空白。本研究发现AFDX-116通过调节细胞增殖、凋亡以及细胞外基质代谢相关因子的表达，影响人胚胎眼巩膜成纤维细胞的生物学行为，这为深入理解近视的发病机制提供了新的视角和理论依据。AFDX-116对MMPs/TIMPs信号通路的调节作用，提示了该信号通路在近视发生发展过程中的重要性，有助于进一步完善近视发病机制的理论体系。这不仅丰富了人们对巩膜成纤维细胞生物学功能的认识，也为后续研究近视的分子机制提供了新的研究方向和思路。从潜在应用价值来看，本研究结果为近视的药物研发提供了新的靶点。随着近视发病率的不断上升，开发安全有效的治疗药物迫在眉睫。AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控作用表明，其有可能成为一种新型的近视治疗药物。通过进一步的研究，可以优化AFDX-116的结构和剂型，提高其疗效和安全性，为近视患者提供新的治疗选择。可以通过化学修饰的方法，改善AFDX-116的药代动力学性质，增强其对巩膜成纤维细胞的靶向性，减少副作用的发生。还可以探索将AFDX-116与其他药物联合使用的可能性，以提高治疗效果。这将为近视的药物研发开辟新的道路，有望推动近视治疗领域的发展。在临床治疗方面，本研究结果为近视的防治提供了潜在的策略。对于近视患者，可以通过监测巩膜成纤维细胞的生物学行为和相关因子的表达水平，评估AFDX-116的治疗效果，为个性化治疗提供依据。对于青少年近视患者，可以在近视早期，通过使用AFDX-116干预巩膜成纤维细胞的异常变化，延缓近视的发展。对于高度近视患者，AFDX-116也可能有助于改善巩膜的结构和功能，降低并发症的发生风险。这将为临床医生提供新的治疗手段和思路，有助于提高近视的治疗水平，改善患者的视觉质量和生活质量。5.3研究的局限性与展望本研究虽然取得了一定的成果，但仍存在一些局限性。在实验设计方面，本研究仅在体外细胞水平进行了研究，缺乏在动物模型中的验证。细胞实验虽然能够在一定程度上揭示AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞的调控作用，但体外实验环境与体内生理环境存在差异，细胞在体外培养过程中可能会丢失部分在体内的生物学特性。未来的研究可以构建近视动物模型，如豚鼠近视模型、树鼩近视模型等，通过在动物体内给予AFDX-116干预，进一步验证其对巩膜成纤维细胞的调控作用以及对近视发展的影响。这样可以更全面地评估AFDX-116的作用效果和安全性，为其临床应用提供更有力的证据。从样本量来看，本研究中每组实验的样本量相对较小，可能会影响实验结果的准确性和可靠性。在细胞增殖、凋亡等实验中，虽然设置了多个复孔，但总体样本量有限，难以充分体现个体差异对实验结果的影响。在后续研究中，应适当增加样本量，进行多批次、多中心的实验，以提高实验结果的可信度和可重复性。通过大样本量的研究，可以更准确地评估AFDX-116的作用效果，减少实验误差，为研究结论的推广提供更坚实的基础。在研究的深度和广度上，本研究主要聚焦于AFDX-116对人胚胎眼巩膜成纤维细胞增殖、凋亡和细胞外基质代谢相关因子表达的影响，对于其具体的信号通路和分子机制的研究还不够深入。虽然推测AFDX-116可能通过调节PI3K/Akt、线粒体凋亡、NF-κB、ERK1/2等信号通路来影响细胞的生物学行为，但缺乏直接的实验证据。未来可以运用基因编辑技术，如CRISPR/Cas9系统，敲除或过表达相关信号通路中的关键基因，进一步探究AFDX-116作用的分子机制。还可以结合蛋白质组学、代谢组学等技术，全面分析AFDX-116处理后人胚胎眼巩膜成纤维细胞的蛋白质和代谢物变化，深入挖掘其潜在的作用靶点和信号通路。本研究仅检测了MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-