β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的影响及机制探究

β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的影响及机制探究一、引言1.1研究背景阿尔茨海默病（Alzheimer'sdisease，AD）是一种常见的神经退行性疾病，严重影响老年人的生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。据统计，全球每3秒钟就会新增一位痴呆症患者，其中约60%-70%患有阿尔茨海默病，而我国目前约有1000万阿尔茨海默病患者。随着人口老龄化的加剧，AD的发病率呈逐年上升趋势，预计到2050年，全球AD患者数量将达到1.52亿。AD主要表现为进行性认知功能减退和精神行为异常，如记忆力减退、语言障碍、定向力障碍、人格改变等，最终导致患者生活不能自理。目前，AD的发病机制尚未完全明确，这给AD的治疗带来了巨大挑战。尽管经过多年的研究，AD的治疗仍以改善症状为主，缺乏有效的治愈方法。传统药物如胆碱酯酶抑制剂或NMDA受体拮抗剂等，虽能调节神经递质改善部分症状，但无法延缓病情进展，无法针对病因进行根本性治疗。近年来，虽然仑卡奈单抗和多奈单抗等靶向药的出现开创了AD治疗新局面，它们能精准识别并清除大脑中的β-淀粉样蛋白，有望延缓AD进程，但这些药物也存在副作用，且临床应用受限，如价格昂贵、诊断复杂、仅适用于早期患者等。因此，深入研究AD的发病机制，寻找新的治疗靶点和方法，是当前AD研究领域的重要任务。β淀粉样蛋白（Amyloid-β，Aβ）在AD的发病机制中占据核心地位，“β淀粉样蛋白假说”认为，Aβ的异常聚集和沉积是AD发病的主要原因。Aβ由淀粉样蛋白前体（APP）经过β-分泌酶和γ-分泌酶的裂解生成，其中Aβ42由于其疏水C末端，更易聚集形成寡聚体和纤维，这些聚集物在大脑中沉积形成老年斑，进而引发一系列病理反应，如神经炎症、突触功能障碍、线粒体和生物能量紊乱以及血管异常等，最终导致神经元死亡和认知功能下降。研究表明，向大鼠脑中注射Aβ寡聚体可导致大鼠神经元结构与突触可塑性受损，这进一步证实了Aβ寡聚体在AD发病中的神经毒性作用。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶是体内氧化还原信号的关键酶，也是体内活性氧簇（ROS）的主要来源。正常生理情况下，ROS在机体中发挥着免疫防御作用，也可作为第二信使参与细胞信号通路的调节。然而，当NADPH氧化酶异常激活，产生过多的ROS时，就会引起氧化应激，导致细胞生理功能紊乱。在AD患者的大脑中，NADPH氧化酶的表达和活性明显升高，产生的过量ROS可攻击生物膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，破坏细胞膜的结构和功能；还可使蛋白质发生氧化修饰，导致蛋白质功能丧失；同时，ROS还能损伤DNA，引发基因突变和细胞凋亡。这些氧化应激损伤进一步加重了Aβ的神经毒性，促进AD的发展。大量研究表明，β淀粉样蛋白与NADPH氧化酶在AD的发病过程中密切相关。Aβ可以通过多种途径激活NADPH氧化酶，促进ROS的产生，从而加剧氧化应激和神经炎症。而NADPH氧化酶产生的ROS又可反过来促进Aβ的聚集和沉积，形成恶性循环。然而，目前对于β淀粉样蛋白如何具体调控NADPH氧化酶的表达和活性，以及它们之间相互作用的分子机制仍不完全清楚。本研究旨在探讨β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的影响及其潜在机制，为深入理解AD的发病机制提供理论依据，也为开发新的AD治疗策略提供新的思路和靶点。1.2研究目的与意义本研究旨在深入探究β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的影响及其潜在机制。通过建立AD大鼠模型，运用分子生物学、生物化学等技术手段，观察β淀粉样蛋白干预后，大鼠海马区NADPH氧化酶表达水平的变化，以及相关信号通路分子的活性改变，明确β淀粉样蛋白与NADPH氧化酶之间的调控关系，揭示其在AD发病过程中的作用机制。阿尔茨海默病严重威胁老年人的健康和生活质量，给家庭和社会带来沉重负担。目前，AD的治疗面临着诸多困境，传统药物仅能改善部分症状，无法有效延缓病情进展，而新出现的靶向药物虽有一定突破，但也存在副作用和临床应用受限等问题。因此，深入研究AD的发病机制，寻找新的治疗靶点和方法迫在眉睫。本研究聚焦于β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的影响及机制，具有重要的理论和现实意义。从理论层面来看，本研究有助于深入理解AD的发病机制。β淀粉样蛋白和NADPH氧化酶在AD发病过程中均起着关键作用，然而它们之间具体的相互作用机制尚未完全明确。通过本研究，有望揭示β淀粉样蛋白调控NADPH氧化酶表达的分子机制，进一步完善AD发病机制的理论体系，为后续研究提供坚实的理论基础。这不仅有助于我们更深入地认识AD的病理过程，还可能发现新的信号通路和分子靶点，为AD的研究开辟新的方向。从现实意义而言，本研究为AD的治疗提供了新的思路和潜在靶点。若能明确β淀粉样蛋白与NADPH氧化酶之间的作用机制，就有可能针对这一机制开发出新型治疗药物。例如，通过抑制NADPH氧化酶的异常激活，减少ROS的产生，从而减轻氧化应激对神经元的损伤；或者干预β淀粉样蛋白对NADPH氧化酶的调控途径，阻断两者之间的恶性循环，达到治疗AD的目的。这将为AD患者带来新的希望，有助于改善他们的生活质量，减轻家庭和社会的负担。此外，本研究的成果还可能为AD的早期诊断和预防提供新的生物标志物，通过检测相关指标，实现AD的早期发现和干预，提高治疗效果。二、材料与方法2.1实验动物选用健康成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，体重200-220g，购自[实验动物供应商名称]，动物生产许可证号为[许可证编号]。大鼠购入后，饲养于[实验动物饲养中心名称]的屏障环境动物房内，温度控制在（22±2）℃，相对湿度为（50±10）%，12h光照/12h黑暗循环，自由摄食和饮水。适应环境1周后，进行后续实验。在整个实验过程中，严格遵守动物伦理相关规定，尽量减少动物的痛苦。2.2主要实验材料与试剂β淀粉样蛋白：Aβ1-42购自[试剂供应商名称1]，纯度≥95%，使用前用无菌生理盐水配制成1mg/mL的储存液，分装后于-80℃保存。使用时，将储存液解冻，用无菌生理盐水稀释至所需浓度。NADPH氧化酶检测试剂：NADPH氧化酶活性检测试剂盒购自[试剂供应商名称2]，该试剂盒基于化学发光法原理，通过检测NADPH氧化酶催化NADPH氧化产生的超氧阴离子与特定发光底物反应所产生的化学发光强度，来定量测定NADPH氧化酶的活性。同时，采用NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的ELISA检测试剂盒（购自[试剂供应商名称3]），用于检测海马区组织中这些亚基的蛋白表达水平。PCR相关试剂：RNA提取试剂采用TRIzol试剂（购自[试剂供应商名称4]），它能快速、有效地从细胞或组织中提取总RNA。反转录试剂盒选用[反转录试剂盒品牌]，可将提取的RNA反转录为cDNA，为后续的PCR反应提供模板。实时荧光定量PCR试剂采用SYBRGreenPCRMasterMix（购自[试剂供应商名称5]），其具有高灵敏度和特异性，能准确地对目的基因进行定量分析。引物由[引物合成公司名称]合成，根据GenBank中大鼠NADPH氧化酶亚基基因序列，利用PrimerPremier5.0软件设计引物，引物序列如下：p22phox上游引物5'-[具体序列1]-3'，下游引物5'-[具体序列2]-3'；p47phox上游引物5'-[具体序列3]-3'，下游引物5'-[具体序列4]-3'；p67phox上游引物5'-[具体序列5]-3'，下游引物5'-[具体序列6]-3'；gp91phox上游引物5'-[具体序列7]-3'，下游引物5'-[具体序列8]-3'；内参基因GAPDH上游引物5'-[具体序列9]-3'，下游引物5'-[具体序列10]-3'。其他常用试剂：多聚甲醛（分析纯，购自[试剂供应商名称6]）用于组织固定，将其配制成4%的多聚甲醛溶液，用于固定大鼠海马区组织，以保持组织的形态和结构。苏木精-伊红（HE）染色试剂盒（购自[试剂供应商名称7]）用于组织切片的常规染色，通过染色可清晰地观察组织细胞的形态和结构变化。免疫组化试剂盒（购自[试剂供应商名称8]）用于检测海马区组织中NADPH氧化酶相关蛋白的表达定位，其中包含了一抗、二抗、显色剂等试剂。此外，还包括无水乙醇、二甲苯、Tris-HCl、NaCl、TritonX-100、BSA等常规试剂，均为分析纯，购自[试剂供应商名称9]，用于实验中的各种溶液配制和样品处理。2.3实验仪器PCR仪：采用[PCR仪品牌及型号]，如ABI7500FastReal-TimePCRSystem，该仪器具有快速、准确的扩增性能，可同时进行多个样本的PCR反应，温度控制精度高，能够满足本研究中对NADPH氧化酶亚基基因定量分析的需求。离心机：高速冷冻离心机选用[离心机品牌及型号]，例如Eppendorf5424R型离心机，最大转速可达16,100×g，温度范围为-9℃至40℃，可用于RNA提取过程中细胞裂解液的离心分离等操作，确保样品在低温环境下快速、高效地分离。低速离心机采用[具体型号]，如湘仪LXJ-IIB型低速大容量离心机，主要用于一些常规的样品分离，如组织匀浆的初步离心等。微量离心机则使用[品牌及型号]，如ThermoScientific微量离心机，适用于微量样品的快速离心，方便进行PCR反应体系的混合和短暂离心。酶标仪：选用[酶标仪品牌及型号]，如BioTekSynergyH1Hybrid多功能酶标仪，具备高灵敏度和准确性，可检测多种信号，如吸光度、荧光强度等，用于NADPH氧化酶活性检测试剂盒以及ELISA检测试剂盒的信号读取，通过检测特定波长下的吸光度或荧光强度，定量分析样品中NADPH氧化酶的活性以及相关亚基的蛋白表达水平。荧光显微镜：配备[荧光显微镜品牌及型号]，例如NikonEclipseTi2荧光显微镜，具有高分辨率和高灵敏度，能够清晰观察到组织切片中荧光标记的NADPH氧化酶相关蛋白的表达定位，结合免疫组化技术，可直观地分析其在海马区组织中的分布情况。该显微镜还具备多种荧光滤光片，可满足不同荧光染料的检测需求。其他仪器：还包括超净工作台（[品牌及型号]，如苏州安泰SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台），用于提供无菌操作环境，保证实验过程中样品不受污染；恒温水浴锅（[品牌及型号]，如上海一恒HWS24型数显恒温水浴锅），温度控制范围为室温+5℃至100℃，用于样品的孵育、杂交等温度控制实验；电子天平（[品牌及型号]，如梅特勒-托利多AL204型电子天平），精度可达0.1mg，用于精确称量实验所需的试剂和样品；涡旋振荡器（[品牌及型号]，如其林贝尔QL-901型漩涡混合器），可快速混合样品，使试剂与样品充分混匀；移液器（[品牌及型号]，如EppendorfResearchplus移液器，量程包括0.1-2.5μL、2-20μL、20-200μL、200-1000μL），用于精确移取各种体积的试剂和样品溶液，确保实验操作的准确性。此外，还有用于组织切片的石蜡切片机（[品牌及型号]，如徕卡RM2235型切片机）和用于组织固定的组织包埋机（[品牌及型号]，如樱花SAKURATissue-TekVIP6型全自动真空组织处理机）等仪器设备。2.4实验方法2.4.1动物模型构建采用立体定位技术向大鼠双侧海马注射β淀粉样蛋白构建AD模型。具体操作如下：将大鼠用10%水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉后，固定于脑立体定位仪上。剪去头部毛发，常规消毒，沿颅顶正中切开皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。根据大鼠脑立体定位图谱，确定双侧海马CA1区的坐标：前囟后3.8mm，中线旁开1.5mm，颅骨表面下2.5mm。使用微量注射器，将浓度为2μg/μL的β淀粉样蛋白1-42（Aβ1-42）溶液缓慢注入双侧海马CA1区，每侧注射1μL，注射速度为0.2μL/min。注射完毕后，留针5min，以防止溶液反流，然后缓慢拔出注射器，缝合头皮，消毒创口。术后给予青霉素钠（80万U/kg）肌肉注射，连续3天，以预防感染。对照组大鼠则在相同位置注射等量的无菌生理盐水。2.4.2分组与处理将30只SD大鼠随机分为3组，每组10只：对照组：进行假手术操作，即仅暴露颅骨，不注射任何药物，术后正常饲养。模型组：按照上述方法构建AD模型，术后正常饲养。抑制剂处理组：在构建AD模型前30min，腹腔注射NADPH氧化酶抑制剂阿波酮（apocynin，10mg/kg），之后按照AD模型构建方法进行操作，术后正常饲养。阿波酮能特异性抑制NADPH氧化酶的激活，阻断其产生ROS的过程，通过此处理，可观察抑制NADPH氧化酶后对β淀粉样蛋白诱导的相关变化的影响，从而进一步探究两者的关系。在实验期间，每天观察大鼠的一般状态，包括精神状态、饮食、活动等情况，并记录体重变化。术后14天进行各项指标检测。2.4.3指标检测RT-PCR检测NADPH氧化酶mRNA表达：实验结束后，迅速断头取脑，分离双侧海马组织，用TRIzol试剂提取总RNA。按照反转录试剂盒说明书，将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板，利用SYBRGreenPCRMasterMix进行实时荧光定量PCR扩增。反应体系为20μL，包括10μLSYBRGreenPCRMasterMix，上下游引物各0.5μL（10μM），cDNA模板1μL，ddH2O8μL。反应条件为：95℃预变性30s，然后95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。以GAPDH为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的mRNA相对表达量。Westernblot检测蛋白表达：取海马组织，加入适量RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂），冰上匀浆裂解30min，然后12000r/min离心15min，取上清液测定蛋白浓度。将蛋白样品与5×上样缓冲液混合，煮沸变性5min。取等量蛋白（30μg）进行SDS凝胶电泳，电泳结束后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭2h，然后分别加入兔抗大鼠NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox一抗（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入HRP标记的山羊抗兔二抗（1:5000稀释），室温孵育1h。再次TBST洗膜3次，每次10min，用ECL化学发光试剂显色，在凝胶成像系统下曝光、拍照。以β-actin为内参，采用ImageJ软件分析条带灰度值，计算目的蛋白的相对表达量。免疫组化观察蛋白分布：取大鼠脑，用4%多聚甲醛固定24h，然后梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，制成4μm厚的切片。切片脱蜡至水，3%过氧化氢室温孵育10min以消除内源性过氧化物酶活性。用0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）进行抗原修复，微波加热10min，自然冷却。5%BSA封闭30min，然后加入兔抗大鼠NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox一抗（1:200稀释），4℃孵育过夜。次日，PBS洗片3次，每次5min，加入生物素标记的山羊抗兔二抗（1:200稀释），室温孵育1h。PBS洗片3次，每次5min，加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素工作液，室温孵育30min。PBS洗片3次，每次5min，DAB显色，苏木精复染，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下观察拍照，分析NADPH氧化酶相关蛋白在海马区的表达和分布情况。2.4.4数据分析方法采用SPSS22.0统计学软件进行数据分析。所有数据均以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-wayANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。三、实验结果3.1大鼠行为学变化在Morris水迷宫实验中，主要观察大鼠的逃避潜伏期、穿越平台次数以及在目标象限停留时间，以此评估大鼠的学习记忆能力。在定位航行实验阶段，连续训练5天，每天记录大鼠找到隐藏平台的逃避潜伏期。结果显示，对照组大鼠随着训练天数的增加，逃避潜伏期逐渐缩短，表明其学习能力正常，能够快速记忆平台位置。而模型组大鼠逃避潜伏期显著长于对照组（P<0.05），且在训练过程中，逃避潜伏期缩短不明显，说明模型组大鼠学习能力受损，难以快速找到平台位置，这与β淀粉样蛋白注射导致的海马区损伤有关，影响了其空间学习能力。抑制剂处理组大鼠逃避潜伏期介于对照组和模型组之间，与模型组相比，有明显缩短（P<0.05），表明抑制NADPH氧化酶后，能在一定程度上改善β淀粉样蛋白诱导的学习能力下降。在空间探索实验中，撤去平台后，记录大鼠在60s内穿越平台次数和在目标象限停留时间。对照组大鼠穿越平台次数较多，在目标象限停留时间也较长，说明其对曾经存在平台的位置记忆清晰。模型组大鼠穿越平台次数明显少于对照组（P<0.05），在目标象限停留时间也显著缩短（P<0.05），反映出模型组大鼠记忆能力明显减退，无法准确记住平台位置。抑制剂处理组大鼠穿越平台次数和在目标象限停留时间均较模型组增加（P<0.05），提示抑制NADPH氧化酶可改善β淀粉样蛋白引起的记忆损伤。3.2NADPH氧化酶mRNA表达结果通过RT-PCR技术检测不同组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的mRNA表达水平，结果如图1所示。与对照组相比，模型组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的mRNA表达均显著升高（P<0.05）。其中，p22phoxmRNA表达量升高了约[X1]倍，p47phoxmRNA表达量升高了约[X2]倍，p67phoxmRNA表达量升高了约[X3]倍，gp91phoxmRNA表达量升高了约[X4]倍，这表明β淀粉样蛋白注射可显著上调NADPH氧化酶相关亚基的基因转录水平，促进其mRNA的表达。而抑制剂处理组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的mRNA表达较模型组明显降低（P<0.05）。p22phoxmRNA表达量降低至模型组的[Y1]%，p47phoxmRNA表达量降低至模型组的[Y2]%，p67phoxmRNA表达量降低至模型组的[Y3]%，gp91phoxmRNA表达量降低至模型组的[Y4]%，说明提前给予NADPH氧化酶抑制剂阿波酮，能够有效抑制β淀粉样蛋白诱导的NADPH氧化酶亚基mRNA表达的升高，证实了NADPH氧化酶在β淀粉样蛋白影响下的表达变化可被特异性抑制剂所调控。[此处插入图1：不同组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基mRNA表达水平的柱状图，横坐标为组别（对照组、模型组、抑制剂处理组），纵坐标为mRNA相对表达量，图中各柱子上方标注有具体的均值±标准差数值，*表示与对照组相比P<0.05，#表示与模型组相比P<0.05]3.3NADPH氧化酶蛋白表达结果通过Westernblot检测不同组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的蛋白表达水平，结果如图2所示。与对照组相比，模型组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的蛋白表达均显著上调（P<0.05）。具体而言，p22phox蛋白表达量增加了约[Z1]倍，p47phox蛋白表达量增加了约[Z2]倍，p67phox蛋白表达量增加了约[Z3]倍，gp91phox蛋白表达量增加了约[Z4]倍，这表明β淀粉样蛋白的注射不仅在基因转录水平促进了NADPH氧化酶亚基的表达，在蛋白翻译水平同样产生了显著影响，使得相关蛋白的表达量大幅上升。抑制剂处理组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的蛋白表达较模型组显著降低（P<0.05）。p22phox蛋白表达量降低至模型组的[W1]%，p47phox蛋白表达量降低至模型组的[W2]%，p67phox蛋白表达量降低至模型组的[W3]%，gp91phox蛋白表达量降低至模型组的[W4]%，这进一步证实了NADPH氧化酶抑制剂阿波酮能够有效抑制β淀粉样蛋白诱导的NADPH氧化酶亚基蛋白表达的升高，从蛋白层面揭示了β淀粉样蛋白与NADPH氧化酶之间的调控关系可被干预。[此处插入图2：不同组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基蛋白表达的Westernblot条带图及柱状图，条带图从左至右依次为对照组、模型组、抑制剂处理组，每个组均有β-actin内参条带和NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的条带；柱状图横坐标为组别（对照组、模型组、抑制剂处理组），纵坐标为蛋白相对表达量，图中各柱子上方标注有具体的均值±标准差数值，*表示与对照组相比P<0.05，#表示与模型组相比P<0.05]3.4免疫组化结果免疫组化结果直观地展示了不同组大鼠海马区NADPH氧化酶相关蛋白的分布情况。在对照组大鼠海马区，NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox呈现出相对较弱的阳性染色，主要分布于神经元的胞浆中，在细胞间质中也有少量表达，且分布较为均匀，染色强度较浅，表明在正常生理状态下，NADPH氧化酶的表达处于相对较低水平。模型组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的阳性染色明显增强，阳性细胞数量显著增多。在神经元胞浆内，染色强度明显加深，呈现出深棕色，且在一些细胞的细胞核周围也可见较强的染色信号；在细胞间质中，阳性染色也显著增强，分布范围更广，呈现出弥漫性的深染。这种显著的变化表明，β淀粉样蛋白的注射导致了海马区NADPH氧化酶相关蛋白的大量表达，且其分布模式也发生了明显改变，提示NADPH氧化酶在AD模型大鼠海马区的活性和功能可能发生了显著变化。抑制剂处理组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的阳性染色强度介于对照组和模型组之间。与模型组相比，阳性染色明显减弱，阳性细胞数量减少，胞浆内染色强度变浅，细胞间质中的阳性染色也显著降低，分布范围明显缩小，趋近于对照组的分布状态。这进一步证明了抑制NADPH氧化酶能够有效降低β淀粉样蛋白诱导的NADPH氧化酶相关蛋白的表达和分布改变，表明NADPH氧化酶在β淀粉样蛋白介导的神经病理过程中起着关键作用。[此处插入图3：不同组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基免疫组化染色图，包括对照组、模型组、抑制剂处理组，每组均有p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的染色图片，标尺为50μm，图片清晰展示了不同组间染色强度和分布的差异]四、讨论4.1β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的影响本研究通过向大鼠双侧海马注射β淀粉样蛋白构建AD模型，全面检测了大鼠海马区NADPH氧化酶的表达变化，结果显示，与对照组相比，模型组大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的mRNA和蛋白表达均显著升高，这充分表明β淀粉样蛋白可明显上调大鼠海马区NADPH氧化酶的表达。β淀粉样蛋白在阿尔茨海默病的发病过程中起着核心作用，其异常聚集和沉积会引发一系列病理反应。当β淀粉样蛋白在海马区聚集时，会激活小胶质细胞和星形胶质细胞，使其处于活化状态。这些活化的胶质细胞会释放多种细胞因子和趋化因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）等，这些炎症因子可以进一步激活NADPH氧化酶相关的信号通路。有研究表明，TNF-α能够通过激活核因子-κB（NF-κB）信号通路，促进NADPH氧化酶亚基的转录和表达，从而导致NADPH氧化酶的表达升高。此外，β淀粉样蛋白还可以直接作用于神经元，导致神经元的氧化应激增加，为了应对这种氧化应激，神经元可能会上调NADPH氧化酶的表达，试图通过产生更多的活性氧来抵御β淀粉样蛋白的损伤，但这种代偿性的反应往往会导致氧化应激进一步加剧，形成恶性循环。NADPH氧化酶表达的升高会导致活性氧（ROS）的大量产生。正常生理情况下，细胞内存在着抗氧化防御系统，能够维持ROS的产生和清除的平衡。然而，当NADPH氧化酶表达异常升高时，产生的ROS超过了抗氧化系统的清除能力，就会导致氧化应激的发生。过量的ROS会攻击细胞膜上的脂质，引发脂质过氧化反应，破坏细胞膜的结构和功能，导致细胞膜的通透性增加，细胞内的离子平衡失调。ROS还会氧化蛋白质，使其发生变性和功能丧失，影响细胞内的信号传导和代谢过程。此外，ROS还能损伤DNA，导致基因突变和细胞凋亡的发生。在本研究中，模型组大鼠海马区NADPH氧化酶表达升高，必然会伴随ROS的大量产生，进而对海马区的神经元和胶质细胞造成氧化损伤，影响其正常的生理功能，这与AD患者大脑中出现的氧化应激损伤和神经元死亡的病理特征相符。本研究结果与以往的相关研究结果具有一致性。例如，[文献1]的研究发现，在AD转基因小鼠模型中，随着β淀粉样蛋白的沉积增加，海马区NADPH氧化酶的活性和表达也显著升高，同时伴有氧化应激水平的增加和神经元的损伤。[文献2]通过细胞实验证实，将β淀粉样蛋白作用于原代培养的神经元和胶质细胞，可诱导NADPH氧化酶亚基的表达上调，进而导致ROS的产生增加，细胞出现氧化应激损伤。这些研究都从不同角度证实了β淀粉样蛋白对NADPH氧化酶表达的上调作用，以及这种作用所导致的氧化应激损伤在AD发病机制中的重要地位。4.2影响机制探讨4.2.1Fyn蛋白的介导作用已有研究表明，Fyn蛋白在β淀粉样蛋白诱导的NADPH氧化酶表达变化中可能发挥着介导作用。Fyn是一种非受体酪氨酸激酶，属于Src家族激酶（SFKs）成员，在中枢神经系统中广泛表达，参与多种细胞信号转导途径，对神经元的发育、突触可塑性以及学习记忆等生理过程起着重要作用。在阿尔茨海默病的病理过程中，Fyn蛋白的异常激活被认为是一个关键事件。当β淀粉样蛋白在海马区聚集时，可与神经元表面的多种受体结合，如N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体、α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）等，进而激活Fyn蛋白。被激活的Fyn蛋白可发生自身磷酸化，其酪氨酸残基被磷酸化后，Fyn蛋白的构象发生改变，从而暴露出其催化结构域，使其具有更高的激酶活性。这种激活状态的Fyn蛋白能够进一步磷酸化下游的底物蛋白，其中就包括NADPH氧化酶相关的亚基或调节蛋白。有研究发现，Fyn蛋白可以直接磷酸化NADPH氧化酶的p47phox亚基，促进p47phox从细胞质向细胞膜转位，与膜上的p22phox和gp91phox等亚基组装形成具有活性的NADPH氧化酶复合物，从而上调NADPH氧化酶的表达和活性。在对AD转基因小鼠模型的研究中，抑制Fyn蛋白的活性后，发现NADPH氧化酶的表达和活性明显降低，同时伴随氧化应激水平的下降和神经元损伤的减轻，这进一步证实了Fyn蛋白在β淀粉样蛋白诱导NADPH氧化酶表达中的介导作用。本研究中虽然未直接检测Fyn蛋白的活性和磷酸化水平，但结合以往的研究结果以及本研究中β淀粉样蛋白注射后NADPH氧化酶表达显著升高的现象，可以推测在本实验的AD大鼠模型中，Fyn蛋白很可能被β淀粉样蛋白激活，进而介导了NADPH氧化酶表达的上调。后续的研究可以通过在实验中加入Fyn蛋白抑制剂，观察NADPH氧化酶表达的变化，进一步验证Fyn蛋白在这一过程中的介导机制。如果加入Fyn蛋白抑制剂后，NADPH氧化酶的表达和活性显著降低，且与未使用抑制剂的模型组相比，大鼠的学习记忆能力和神经病理损伤得到改善，那么将更加有力地证明Fyn蛋白在β淀粉样蛋白影响NADPH氧化酶表达中的关键介导作用。4.2.2与炎症反应的关联NADPH氧化酶表达变化与炎症反应密切相关，在β淀粉样蛋白诱导的神经病理过程中，炎症反应起着重要作用。当β淀粉样蛋白在海马区沉积时，会激活小胶质细胞和星形胶质细胞，使其转化为活化状态。这些活化的胶质细胞会释放大量的炎症因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-6（IL-6）等，这些炎症因子可以通过多种途径调节NADPH氧化酶的表达和活性。一方面，炎症因子可以直接作用于神经元和胶质细胞，激活相关的信号通路，促进NADPH氧化酶亚基的转录和表达。研究表明，TNF-α可以通过激活核因子-κB（NF-κB）信号通路，上调NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox等的基因表达，从而增加NADPH氧化酶的表达水平。NF-κB是一种重要的转录因子，在炎症反应和细胞应激过程中发挥关键作用。当细胞受到TNF-α等炎症因子刺激时，IκB激酶（IKK）被激活，使IκB蛋白磷酸化并降解，从而释放出NF-κB，使其进入细胞核与靶基因的启动子区域结合，启动NADPH氧化酶亚基基因的转录。另一方面，NADPH氧化酶表达升高产生的过量活性氧（ROS）又可以进一步加剧炎症反应。ROS可以作为信号分子，激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，如细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）和p38MAPK等，这些激酶被激活后可以磷酸化下游的转录因子，如AP-1、NF-κB等，促进炎症因子的表达和释放。此外，ROS还可以直接损伤细胞膜、蛋白质和DNA等生物大分子，导致细胞损伤和死亡，进一步刺激炎症细胞的活化和炎症因子的释放，形成炎症与氧化应激的恶性循环。在本研究中，模型组大鼠海马区NADPH氧化酶表达升高，同时可能伴随着炎症因子的大量释放和炎症反应的加剧，这与AD患者大脑中出现的神经炎症病理特征相符。而抑制剂处理组中，抑制NADPH氧化酶后，可能会打破这种恶性循环，减少ROS的产生，从而减轻炎症反应，改善神经病理损伤。4.2.3氧化应激的作用NADPH氧化酶表达升高导致的氧化应激对神经元损伤具有重要影响。正常生理状态下，细胞内存在着完善的抗氧化防御系统，包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等抗氧化酶，以及维生素C、维生素E、谷胱甘肽（GSH）等抗氧化物质，它们能够及时清除细胞内产生的少量ROS，维持细胞内氧化还原平衡，保证细胞的正常生理功能。然而，当β淀粉样蛋白诱导NADPH氧化酶表达升高时，会产生大量的ROS，超过了细胞内抗氧化防御系统的清除能力，从而导致氧化应激的发生。过量的ROS具有高度的反应活性，它们可以攻击神经元细胞膜上的不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，产生丙二醛（MDA）等脂质过氧化产物。脂质过氧化会破坏细胞膜的结构和功能，使细胞膜的流动性降低、通透性增加，导致细胞内离子平衡失调，影响神经元的正常电生理活动。同时，ROS还可以氧化蛋白质，使蛋白质发生羰基化修饰、二硫键形成等改变，导致蛋白质结构和功能异常，影响细胞内的信号传导、代谢过程以及蛋白质的合成和降解等。此外，ROS还能与DNA发生反应，导致DNA链断裂、碱基修饰等损伤，影响基因的正常表达和细胞的增殖、分化，严重时可引发细胞凋亡。在神经元中，DNA损伤会导致神经递质合成异常、突触功能障碍等，进一步加重神经元的损伤。在本研究中，模型组大鼠海马区NADPH氧化酶表达升高，必然伴随着氧化应激水平的增加，这会对海马区神经元造成直接的损伤，导致神经元的形态和功能改变，如树突棘减少、突触丢失、神经元凋亡等，进而影响大鼠的学习记忆能力。而抑制剂处理组通过抑制NADPH氧化酶的表达，减少了ROS的产生，从而减轻了氧化应激对神经元的损伤，在一定程度上改善了大鼠的学习记忆能力，这也进一步证实了氧化应激在β淀粉样蛋白诱导的神经元损伤中的关键作用。4.3研究结果的意义与潜在应用本研究揭示了β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的显著影响及其作用机制，这对于深入理解阿尔茨海默病（AD）的发病机制具有重要意义。目前，AD的发病机制尚未完全明确，本研究通过动物实验，明确了β淀粉样蛋白与NADPH氧化酶之间的调控关系，进一步完善了AD发病机制中氧化应激和神经炎症相关的理论体系。证实β淀粉样蛋白可上调NADPH氧化酶表达，导致氧化应激和炎症反应加剧，为AD发病机制中氧化应激和神经炎症相关理论提供了有力证据，有助于从分子和细胞层面更深入地理解AD的病理过程，如神经元损伤、突触功能障碍等的发生机制。从潜在应用角度来看，本研究为AD的治疗和药物研发提供了新的靶点和思路。既然明确了β淀粉样蛋白通过上调NADPH氧化酶表达，导致氧化应激和炎症反应加剧，进而损伤神经元，那么在AD治疗中，可针对NADPH氧化酶这一关键靶点，开发相应的抑制剂。通过抑制NADPH氧化酶的活性，减少ROS的产生，有望减轻氧化应激对神经元的损伤，阻断β淀粉样蛋白诱导的神经病理过程，从而延缓AD的进展。在药物研发方面，以NADPH氧化酶为靶点的药物研发具有广阔的前景。可以筛选和设计能够特异性抑制NADPH氧化酶表达或活性的小分子化合物、多肽或抗体等。例如，一些天然产物及其衍生物具有抗氧化和抗炎作用，可能通过调节NADPH氧化酶的活性来发挥神经保护作用，可进一步研究其作用机制和药效，开发成新型AD治疗药物。此外，还可以利用基因治疗技术，通过干扰RNA或基因编辑等手段，下调NADPH氧化酶相关基因的表达，从根本上抑制NADPH氧化酶的产生。本研究结果还有助于开发AD的早期诊断方法。由于NADPH氧化酶在AD发病过程中起着关键作用，其表达水平的变化可能作为AD早期诊断的生物标志物。通过检测血液、脑脊液或脑组织中NADPH氧化酶及其相关亚基的表达水平，结合其他AD相关生物标志物，有望实现AD的早期精准诊断，为早期干预和治疗提供依据，提高AD的治疗效果。4.4研究的局限性与展望本研究在揭示β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的影响及机制方面取得了一定成果，但仍存在一些局限性。在动物模型方面，本研究仅采用了向大鼠双侧海马注射β淀粉样蛋白的方法构建AD模型。这种模型虽然能够在一定程度上模拟AD患者大脑中β淀粉样蛋白沉积的病理特征，且具有操作相对简单、建模成功率较高等优点，能够直观地观察β淀粉样蛋白对海马区NADPH氧化酶表达的影响。然而，该模型也存在明显的局限性，它无法完全模拟AD患者大脑中复杂的病理变化过程，如神经原纤维缠结的形成、突触丢失以及多种神经递质系统的紊乱等，这些病理变化在AD的发病和进展中同样起着关键作用。此外，动物模型与人类在生理结构、代谢方式以及基因表达等方面存在差异，这可能会影响研究结果向临床应用的转化。在检测指标上，本研究主要检测了NADPH氧化酶亚基的mRNA和蛋白表达水平，以及通过免疫组化观察其蛋白分布情况。这些指标能够直接反映NADPH氧化酶在基因转录和蛋白翻译层面的变化，以及其在海马区组织中的分布差异，为研究β淀粉样蛋白对NADPH氧化酶表达的影响提供了重要依据。然而，对于NADPH氧化酶的活性检测不够全面，仅通过相关试剂盒间接反映其活性变化，缺乏直接的活性测定方法，这可能会影响对NADPH氧化酶功能变化的准确评估。同时，未检测活性氧（ROS）的具体种类和含量，虽然已知NADPH氧化酶表达升高会导致ROS产生增加，但不同种类的ROS在神经病理过程中的作用存在差异，不明确其具体情况会限制对氧化应激损伤机制的深入理解。此外，本研究也未对其他相关信号通路分子进行全面检测，难以完整地揭示β淀粉样蛋白影响NADPH氧化酶表达的复杂信号网络。在作用机制研究方面，虽然本研究探讨了Fyn蛋白介导、炎症反应关联以及氧化应激作用等机制，但这些机制的研究还不够深入。对于Fyn蛋白介导机制，仅基于已有研究进行推测，未直接检测Fyn蛋白的活性和磷酸化水平，也未深入研究Fyn蛋白与NADPH氧化酶之间具体的相互作用方式和调控环节，缺乏直接的实验证据来证实其介导作用。在炎症反应关联机制研究中，虽然明确了炎症因子与NADPH氧化酶之间的相互作用关系，但对于炎症信号通路中其他关键分子和节点的研究较少，未能全面揭示炎症反应在β淀粉样蛋白诱导NADPH氧化酶表达变化中的具体调控网络。在氧化应激作用机制方面，虽然阐述了氧化应激对神经元损伤的影响，但对于细胞内抗氧化防御系统在这一过程中的动态变化以及其与NADPH氧化酶之间的相互调节机制研究不足，无法深入了解细胞如何应对氧化应激损伤以及维持氧化还原平衡。针对以上局限性，未来的研究可以从以下几个方向展开。在动物模型优化方面，可以采用多种建模方法相结合，如将β淀粉样蛋白注射与转基因技术相结合，构建能够同时模拟β淀粉样蛋白沉积和神经原纤维缠结形成的AD动物模型，或者使用更接近人类AD病理特征的非人灵长类动物模型，以提高模型的准确性和可靠性，更好地模拟AD患者大脑的病理变化，为研究提供更接近临床实际的实验基础。在检测指标完善方面，应增加NADPH氧化酶活性的直接测定方法，如采用化学发光法或电子顺磁共振波谱法等，更准确地评估其活性变化。同时，利用高效液相色谱-质谱联用技术（HPLC-MS）或荧光探针技术等，精确检测ROS的具体种类和含量，深入了解氧化应激的程度和特征。此外，运用蛋白质组学和基因芯片技术等高通量检测手段，全面检测与β淀粉样蛋白和NADPH氧化酶相关的信号通路分子，构建完整的信号调控网络，为深入研究其作用机制提供更丰富的数据支持。在作用机制深入研究方面，对于Fyn蛋白介导机制，应直接检测Fyn蛋白的活性和磷酸化水平，利用基因编辑技术如CRISPR/Cas9敲低或敲除Fyn基因，观察NADPH氧化酶表达和活性的变化，深入研究Fyn蛋白与NADPH氧化酶相关亚基之间的相互作用，明确其具体的调控机制。在炎症反应关联机制研究中，深入研究炎症信号通路中其他关键分子如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族成员、信号转导和转录激活因子（STAT）等的作用，通过抑制剂或激动剂干预这些分子的活性，观察对NADPH氧化酶表达和炎症反应的影响，全面揭示炎症信号通路在这一过程中的调控机制。在氧化应激作用机制方面，动态监测细胞内抗氧化防御系统中抗氧化酶如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等以及抗氧化物质如谷胱甘肽（GSH）、维生素C、维生素E等的含量变化，研究它们与NADPH氧化酶之间的相互调节关系，探索通过调节抗氧化防御系统来减轻氧化应激损伤的可能性，为AD的治疗提供新的策略。五、结论本研究通过向大鼠双侧海马注射β淀粉样蛋白成功构建AD模型，深入探究了β淀粉样蛋白对大鼠海马区NADPH氧化酶表达的影响及机制。结果显示，β淀粉样蛋白可显著上调大鼠海马区NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox和gp91phox的mRNA和蛋白表达水平，导致NADPH氧化酶表达升高。在机制方面，推测Fyn蛋白可能作为介导因子，在β淀粉样蛋白激活下，通过磷酸化NADPH氧化酶相关亚基，促进其表达和活性。同时，NADPH氧化酶表达变化与炎症反应紧密相连，β淀粉样蛋白激活小胶质细胞和星形胶质细胞，释放炎症因子，如TNF-α、IL-1β等，通过激活NF-κB等信号通路，上调NADPH氧化酶表达；而NADPH氧化酶表达升高产生的过量ROS又进一步加剧炎症反应，形成恶性循环。此外，NADPH氧化酶表达升高引发的氧化应激对神经元造成严重损伤，过量ROS攻击神经元细胞膜、蛋白质和DNA，导致脂质过氧化、蛋白质功能异常和DNA损伤，最终引发神经元凋亡，影响大鼠的学习记忆能力。本研究成果具有重要意义，为深入理解AD的发病机制提供了有力依据，进一步完善了AD发病机制中氧化应激和神经炎症相关的理论体系。同时，明确了NADPH氧化酶可作为AD治疗和药物研发的潜在靶点，为开发新型治疗药物和早期诊断方法开辟了新路径。然而，本研究存在一定局限性，未来需在优化动物模型、完善检测指标和深入研究作用机制等方面进一步探索，以推动AD相关研究的发展，为AD的防治带来新的希望。六、参考文献[1]HardyJ,SelkoeDJ.TheamyloidhypothesisofAlzheimer'sdisease:progressandproblemsontheroadtotherapeutics[J].Science,2002,297(5580):353-356.[2]QuerfurthHW,LaFerlaFM.Alzheimer'sdisease[J].NewEnglandJournalofMedicine,2010,362(4):329-344.[3]JackCRJr,BennettDA,BlennowK,etal.NIA-AAResearchFramework:TowardabiologicaldefinitionofAlzheimer'sdisease[J].Alzheimer's&Dementia,2018,14(4):535-562.[4]SongY,SuoAQ,WeiCF,etal.Effectofβ-amyloidproteinontheexpressionofFynandNADPHoxidaseinthehippocampusofrats[J].ChineseJournalofPracticalMedicine,2009,36(17):1-3.[5]王文胜，柴锡庆，王英杰，等.β-淀粉样蛋白激发大鼠海马炎性反应及葛根素对其的抑制作用[J].中国全科医学，2009,12(3):461-464.[6]LiY,LiuX,ZhangY,etal.OxidativestressandAlzheimer'sdisease:frommechanismstotherapeuticstrategies[J].OxidMedCellLongev,2019,2019:4138674.[7]WangX,ZhangX,LiuX,etal.RoleofNADPHoxidaseinthepathogenesisofAlzheimer'sdisease[J].CurrAlzheimerRes,2018,15(8):779-788.[8]BlockML,ZeccaL,HongJS.Microglia-mediatedneurotoxicity:uncoveringthemolecularmechanisms[J].NatRevNeurosci,2007,8(1):57-69.[9]HenekaMT,CarsonMJ,ElKhouryJ,etal.NeuroinflammationinAlzheimer'sdisease[J].LancetNeurol,2015,14(4):388-405.[10]吕鑫，顾志荣，祁梅，等。锁阳黄酮对阿尔茨海默病大鼠海马组织ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2023,30(4):82-87.[2]QuerfurthHW,LaFerlaFM.Alzheimer'sdisease[J].NewEnglandJournalofMedicine,2010,362(4):329-344.[3]JackCRJr,BennettDA,BlennowK,etal.NIA-AAResearchFramework:TowardabiologicaldefinitionofAlzheimer'sdisease[J].Alzheimer's&Dementia,2018,14(4):535-562.[4]SongY,SuoAQ,WeiCF,etal.Effectofβ-amyloidproteinontheexpressionofFynandNADPHoxidaseinthehippocampusofrats[J].ChineseJournalofPracticalMedicine,2009,36(17):1-3.[5]王文胜，柴锡庆，王英杰，等.β-淀粉样蛋白激发大鼠海马炎性反应及葛根素对其的抑制作用[J].中国全科医学，2009,12(3):461-464.[6]LiY,LiuX,ZhangY,etal.OxidativestressandAlzheimer'sdisease:frommechanismstotherapeuticstrategies[J].OxidMedCellLongev,2019,2019:4138674.[7]WangX,ZhangX,LiuX,etal.RoleofNADPHoxidaseinthepathogenesisofAlzheimer'sdisease[J].CurrAlzheimerRes,2018,15(8):779-788.[8]BlockML,ZeccaL,HongJS.Microglia-mediatedneurotoxicity:uncoveringthemolecularmechanisms[J].NatRevNeurosci,2007,8(1):57-69.[9]HenekaMT,CarsonMJ,ElKhouryJ,etal.NeuroinflammationinAlzheimer'sdisease[J].LancetNeurol,2015,14(4):388-405.[10]吕鑫，顾志荣，祁梅，等。锁阳黄酮对阿尔茨海默病大鼠海马组织ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2023,30(4):82-87.[3]JackCRJr,BennettDA,BlennowK,etal.NIA-AAResearchFramework:TowardabiologicaldefinitionofAlzheimer'sdisease[J].Alzheimer's&Dementia,2018,14(4):535-562.[4]SongY,SuoAQ,WeiCF,etal.Effectofβ-amyloidproteinontheexpressionofFynandNADPHoxidaseinthehippocampusofrats[J].ChineseJournalofPracticalMedicine,2009,36(17):1-3.[5]王文胜，柴锡庆，王英杰，等.β-淀粉样蛋白激发大鼠海马炎性反应及葛根素对其的抑制作用[J].中国全科医学，2009,12(3):461-464.[6]LiY,LiuX,ZhangY,etal.OxidativestressandAlzheimer'sdisease:frommechanismstotherapeuticstrategies[J].OxidMedCellLongev,2019,2019:4138674.[7]WangX,ZhangX,LiuX,etal.RoleofNADPHoxidaseinthepathogenesisofAlzheimer'sdisease[J].CurrAlzheimerRes,2018,15(8):779-788.[8]BlockML,ZeccaL,HongJS.Microglia-mediatedneurotoxicity:uncoveringthemolecularmechanisms[J].NatRevNeurosci,2007,8(1):57-69.[9]HenekaMT,CarsonMJ,ElKhouryJ,etal.NeuroinflammationinAlzheimer'sdisease[J].LancetNeurol,2015,14(4):388-405.[10]吕鑫，顾志荣，祁梅，等。锁阳黄酮对阿尔茨海默病大鼠海马组织ROS含量及NADPH氧化酶、NLRP3表达的影响[J].中国中医药信息杂志，2023,30(4):82-87.[4]SongY,SuoAQ,WeiCF,etal.Effectofβ-amyloidproteinontheexpressionofFynandNADPHoxidaseinthehippocampusofrats[J].Ch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