CN120209111A 生物学相关的正交细胞因子-受体对（小利兰·斯坦福大学托管委员会）

(10)申请公布号CN120209111A(21)申请号202510224041.7(22)申请日2019.03.08(30)优先权数据(62)分案原申请数据(71)申请人小利兰·斯坦福大学托管委员会地址美国加利福尼亚州(72)发明人凯南·克里斯多夫·加西亚乔纳森·绍克罗斯克(74)专利代理机构北京弘权知识产权代理有限公司11363专利代理师林潮唐秀玲A61K38/20(2006.01)A61K40/42(2025.01)A61K40/31(2025.01)A61K40/30(2025.01)A61P31/00(2006.01)A61P37/02(2006.01)(54)发明名称生物学相关的正交细胞因子/受体对(57)摘要21.一种工程化人IL-2多肽，其(i)与天然人CD122的结合显著降低；(ii)在残基T51、R81处包含至少一个氨基酸替代物，而不是天然蛋白质的氨基酸，或包含氨基酸替代物M23A;2.根据权利要求1所述的工程化人IL-2多肽，其中所述多肽包含一个或多个氨基酸替代物，氨基酸替代物选自：[E15D,E15T,E15A,E15S]、[H16N,H16Q]、[L19V,L19I,L19A]、3.根据权利要求1或2所述的工程化人IL-2多肽，其中所述多肽包含氨基酸替代物4.根据权利要求1-3中任一项所述的工程化人IL-2多肽，其进一步包含氨基酸替代物5.根据权利要求1-4中任一项所述的工程化人IL-2多肽，其包含氨基酸替代物T51I。6.根据权利要求1-5中任一项所述的工程化人IL-2多肽，其包含氨基酸替代物R81D或7.根据权利要求1所述的工程化人IL-2多肽，其包含一组氨基酸替代物[E15D,H16N,8.根据权利要求1所述的工程化人IL-2多肽，其包含一组氨基酸替代物[E15D,H16N,9.根据权利要求1所述的工程化人IL-2多肽，其包含一组氨基酸替代物[E15S,H16Q,L19V,D20L,M23Q,R81D10.根据权利要求1所述的工程化人IL-2多肽，其包含一组氨基酸替代物[E15S,H16Q,11.根据权利要求1-10中任一项所述的工程化人IL-2多肽，其中所述多肽结合并激活正交人CD122蛋白。12.根据权利要求11所述的工程化人IL-2多肽，其中所述正交人CD122蛋白在选自R41、13.根据权利要求12所述的工程化人IL-2多肽，其中所述正交人CD122蛋白在H133和Y134处被修饰。14.根据权利要求13所述的工程化人IL-2多肽，其中所述正交人CD122蛋白包含氨基酸替代物H133D和Y134F。15.一种用于选择性激活细胞中受体的系统，所述系统包含：(a)正交人CD122受体，其包含H133和Y134处的氨基酸替代物；以及(b)根据权利要求1-10中任一项所述的工程化人IL-2多肽。16.根据权利要求15所述的系统，其中所述正交受体由哺乳动物细胞表达。17.根据权利要求16所述的系统，其中所述细胞为免疫细胞或干细胞。18.根据权利要求17所述的系统，其中所述免疫细胞为T细胞。19.根据权利要求18所述的系统，其中所述T细胞为CAR-T细胞。20.一种包含根据权利书要求1-10中任一项所述的工程化人IL-2多肽的药物组合物；3以及一种药学上可接受的赋形剂。21.一种编码根据权利书要求1-10中任一项所述的工程化人IL-2多肽的核酸。22.一种包含根据权利要求21所述的核酸的表达载体。23.一种经过基因工程改造以包含根据权利要求22所述载体的细胞。24.一种治疗个体的方法，该方法包含引入表达在H133和Y134处包含氨基酸替代物的正交人CD122受体的免疫效应细胞，并通过与根据权利要求1-10中任一项所述的工程化人IL-2多肽接触以选择性激活细胞。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述免疫效应细胞是T细胞。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述T细胞是CAR-T细胞。27.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述个体正在接受癌症治疗。28.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述个体正在接受自身免疫性疾病的治疗。29.根据权利要求24-26中任一项所述的方法，其中所述个体正在接受感染治疗。30.一种试剂盒，其包含根据权利要求15所述的系统。4[0001]本申请是申请号为201980031023.X的发明专利申请的分案申请，原申请的申请日为2019年3月8日，发明名称为：生物学相关的正交细胞因子/受体对。[0002]交叉引用[0003]本专利申请案要求于2018年3月9日提交的编号为15/916,689的美国临时专利接续申请案的优先权，上述专利申请全文以引用方式并入本文中。[0004]联邦资助的研究与开发[0005]本发明专利获得了政府的支持，其中，美国国立卫生研究院的资助项目为AI513210。政府拥有本发明的某些权利。技术领域[0006]本发明涉及工程化的正交细胞因子受体/配体对及其使用方法。背景技术[0007]操纵细胞尤其是免疫细胞，以分化、开发特异性功能、扩大细胞数量，在临床上具有重要意义。本领域已知许多影响这些活性的蛋白质因子，特别是细胞因子和趋化因子。然而，这些信号分子对未靶向操纵的细胞也具有多效性，因此需要在靶细胞群中选择性激活信号传递的方法。尤其是工程化T细胞以进行受控行为是有意义的。例如，在过继性免疫疗例如识别和杀死癌细胞、细胞内病原体和参与自身免疫的细胞。[0008]基于细胞疗法中的一项关键挑战是在过继性转移的细胞中工程化期望的行为，例如激活，扩增等，其免受内源性信号传递途径的影响，不影响非靶向内源性细胞，且可受控曾给药的患者。这与T细胞工程化尤其相关，因为发育可塑性和环境因素在决定T细胞命运，功能和定位方面发挥巨大影响。[0009]操纵蛋白质以独立于或正交于天然蛋白质或配体的影响的方式结合和响应修饰的配体的能力构成蛋白质工程化的重大挑战。迄今为止，已经产生了许多与类似的自然交互正交的合成配体-直接同源物-受体对。用于此研究的蛋白质包括了核激素受体和G蛋白偶联受体。尽管为设计由合成小分子配体激活的受体进行了大量工作，但生物学相关蛋白对的工程化仍然是一项重大挑战。发明内容[0010]本发明提供了工程化正交细胞因子受体/配体对及其使用方法。工程化(正交)细胞因子特异性结合对应的工程化(正交)受体。结合后，正交受体激活通过天然细胞元件转导的信号传递，以提供模拟该天然应答但对表达正交受体的工程化细胞特异的生物活性。正交受体表现出与内源性对应细胞因子(包括正交细胞因子的天然配对物)的结合显著降低，而正交细胞因子表现出与任何内源性受体(包括正交受体的天然配对物)的结合显着降低。在一些实施例中，正交细胞因子对正交受体的亲和力与天然细胞因子对天然受体的亲5和力相当。[0011]设计正交细胞因子-受体对的方法可包括以下步骤：(a)将氨基酸改变工程化为天然受体以破坏与天然细胞因子的结合；(b)产生多种细胞因子类似物，其具有选择性氨基酸改变受体结合的接触残基处的天然细胞因子，(c)选择与直接同源受体结合的细胞因子直接同源物；(d)丢弃与天然受体显着结合的直接同源细胞因子，或者可选地丢弃步骤(c)和(d);(e)选择结合直接同源细胞因子的受体直接同源物；(f)丢弃与天然细胞因子结合的直接同源受体。在优选的实施例中，使用细胞因子/受体复合物结构的知识来选择用于定点或易错突变的氨基酸位置。酵母展示系统可以方便地用于选择过程，尽管其他显示和选择方法也是有用的。[0012]在一些实施例中，提供了一种工程化细胞，其中通过引入本发明的正交受体来修饰细胞。任何细胞都可以用于此目的。在一些实施例中，细胞是T细胞，包括但不限于初始一些实施例中，所述细胞在转移到受试者中之前，在离体处理中被遗传修饰。所述工程化细胞可以以单位剂量提供用于治疗，可以是相对于预期接收者的同种异体，自体等。[0013]在一些实施例中，提供了包含编码正交受体的多核苷酸编码序列的载体，其中所述编码序列可操作地连接至在所需细胞中有活性的启动子。本领域已知各种载体并且可以者可以维持附加体。所述受体编码载体可以在试剂盒中提供，与编码结合并激活受体的正交细胞因子的载体组合。在一些实施例中，所述正交细胞因子的编码序列可操作地与高表达启动子连接，并且可以针对生产进行优化。在其他实施例中，提供了一种试剂盒，其中编码正交受体的载体提供正交细胞因子的纯化组合物，例如以单位剂量包装用于患者给药(例如预填充注射器)。在一些其他实施例中，提供了一种试剂盒，其中向编码正交受体的载体提供编码正交细胞因子的载体，以使正交受体能够在细胞中表达，并且还表达旨在由同一细胞分泌的正交细胞因子以实现自分泌正交细胞因子受体信号传递。[0014]在一些实施例中，提供了一种治疗方法，该方法包括向需要其的受体中引入工程细胞群，其中通过引入编码本发明正交受体的序列来修饰细胞群。所述细胞群可以离体工程化，并且通常相对于受体是自体的或同种异体的。在一些实施例中，在施用工程细胞后，引入的细胞群在体内与同源正交细胞因子接触。本发明的优点是正交细胞因子和天然受体之间缺乏交叉反应性。附图说明[0015]结合附图阅读以下详细说明，可获得对本发明最全面的理解。需要强调的是，根据惯例，附图的各种特征并非是按比例绘制的。相反，为了清楚起见，可任意扩大或缩小各个特征的尺寸。附图中包括以下图示：[0016]图1-1(ii).正交IL-2/IL-2受体控制T细胞扩增。[0017]图2.工程化正交IL-2/IL-2Rβ对的工作流程。6[0018]图3.正交小鼠IL-2Rβ变体的序列。[0019]图4.mIL-2RβH134DY135F突变消除了野[0020]图5.工程化正交IL-2/IL-2Rβ对的工作流程。[0021]图6.表征的正交小鼠I1-2变体的序列。[0022]图7.正交IL-2变体以与野生型IL-2和IL-2Rβ交互相似或更大的亲和力结合正交[0023]图8.正交IL-2变体对野生型CD25阳性和CD25阴性脾细胞表现出钝化活性(磷酸化[0024]图9.表达正交IL-2R的小鼠CTLL-2T细胞的产生。[0025]图10.第一组正交IL-2变体对正交T细胞具有选择性。[0026]图11.正交IL-2变体在表达正交IL-2Rβ的CTLL-2细胞上诱导选择性STAT5磷酸化[0027]图12.原发性淋巴结来源的T细胞经过工程化以表达正交IL-2Rβ(H134DY135F)。[0028]图13.正交IL-2变体在表达原代小鼠T细胞的正交IL-2R上诱导选择性STAT5磷酸[0029]图14.与野生型T细胞相比，正交IL-2变体诱导表达正交IL-2Rβ的CTLL-2细胞的选择性细胞生长。[0030]图15.小鼠和人参考IL-2Rβ/IL-2序列的比对。人IL-2Rβ的部分序列作为SEQIDNO:1,残基1-235提供；小鼠IL-2Rβ的部分序列作为SEQIDNO:2,残基1-238提供。小鼠IL-2[0031]图16A-16D.正交人IL-2对的酵母进化。(图16A)酵母的FACS分析显示野生型人IL-2与野生型(蓝色直方图)结合，但不与正交(红色直方图)人IL-2RβH133DY134F突变体四聚体结合。(图16B)将预测接近或接触人IL-2RβHY突变体的IL-2残基随机化的人IL-2突变体库(~18个突变体)显示在酵母表面上。在连续几轮阳性(针对正交hIL-2Rβ)和阴性(针对野生型hIL-2Rβ)选择后，我们获得酵母显示的人IL-2突变体结合正交(红色直方图)但不结合野生型(蓝色直方图)人IL-2Rβ四聚体。(图16C、16D)随后分离正交hIL-2突变体，并在酵母库中测序。鉴定了一组共有的突变，表明正交hIL-2序列集合能够结合正交hIL-2Rβ。[0032]图17.体内小鼠模型，用于证明小鼠中表达正交IL-2Rb的T细胞的选择性扩增或增加的生存。从表达CD45.2的野生型C57BL/6J小鼠的脾脏中分离供体细胞，用CD3/CD28离体活化，用编码正交IL-2Rb-IRES-YFP的逆转录病毒转导用小鼠CD8T细胞分离试剂盒(Miltenyi)纯化。通过眼眶后注射，将野生型(CD45.2阳性，YFP阴性)和表达T细胞的正交IL-2Rb(CD45.2阳性，YFP阳性)的～1:1混合物过继转移到受体BL6.Rag2⁻¹xIL2rg⁻/CD45.1小鼠。在T细胞转移(d0)后立即开始每天腹腔注射PBS,野生型mIL-2(150000Iu/小鼠)或正交IL-2克隆1G12/149(1000000Iu/小鼠),并以24小时间隔注射连续5天(最多d4)。在d5和d7处死小鼠，通过流式细胞术定量小鼠血液和脾脏中的总供体[0033]图18A-18B.用于量化受体小鼠中供体T细胞扩增的门控策略。制备来自小鼠血液和脾脏的单细胞悬浮液，并在4℃下用Cd45.2-太平洋蓝染色1小时以鉴定供体T细胞。在流式细胞术之前，立即将细胞与1:2000稀释的碘化丙啶(PI)一起温育以进行活/死排除。基于前向和侧向散射(SSC-AvFSC-A),单峰(FSC-AvFSC-H),活细胞(PI阴性),以及野生型T7过流式细胞术定量血液(10³个细胞/uL)和脾脏(每个脾脏的细胞总数)中野生型和正交T细IRES-YFP报告和IL-2Rβ的表面染色测定。T细胞还保留野生型IL-2Rβ的表达(图20B)正交染的和未转染的T细胞的混合物在各种浓度的野生型，正交IL-2克隆1G12或3A10中培养521B)在增加浓度的细胞因子中培养5天后，对野生型和正交IL-2克隆1G12和3A10的野生型[0037]图22A-22E.正交人血清白蛋白(MSA)融合物(图22B)1A1,(图22C)1C7,(图22D)SQVLKA或(图22E)SQVKqA在RPMI均荧光强度(MFI)相对于细胞因子的浓度作图，并使用Prism5(GraphPad)拟合对数(激动绘制平均值(n=4)±SD对浓度(左)。(图23B)绘制了总活细胞计数(平均值(n=4)±标准8具体实施方式[0039]为了更容易理解本公开内容，下面以及整个说明书中定义了某些术语和短语。本文提供的定义是非限制性的，并且应该考虑到本领域技术人员在发明时的所知。[0041]在进一步描述本方法和章节之前，应当理解，本发明不限于所描述的特定方法或章节，因为在实际实施中一定会存在差异。还应当理解，本专利中使用的术语仅用于描述特定实施例，而无意限制本发明构思，本发明的范围将仅由所附权利要求书限定。[0042]在提供数值范围的情况下，应当理解，该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在该范围内的中间值都包含在本发明的范围内。除非上下文另有明确规定，否则每个中间值应低至下限单位的十分之一。本发明涵盖了在所述范围内的任何所述值或介入值与在该所述范围内的任何其他所述或介入值之间的每个较小范围。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在该范围内或排除在该范围内，并且也包括在本发明内，需遵守所述范围内任何特别排除的限值的要求。在所述范围包括一个或两个限值的条件下，排除了那些所包括限值中的任一个或两个的范围也包括在本发明内。[0043]除非另有定义，否则本专利所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管与本专利所描述的方法和材料类似或等同的方法和材料也可用于本发明的实施或测试中，但下文描述了一些潜在和首选的方法和材料。本专利提及的所有出版物均以引用方式并入本文，以公开和描述与所引用出版物有关的方法和/或材料。应当理解，当存在矛盾时，本发明内容应取代所引用出版物中的任何公开内指代对象包括多个此类细胞，而“所述肽”指的是一种或多种药剂及所属领域技术人员已知[0045]本专利所讨论的出版物仅供在本专利的申请日之前披露。本文中没有任何内容可以解释为承认本发明凭借先前的发明没有权早于此类公开。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，可能需要单独确认。[0046]细胞因子受体和配体对包括但不限于以下受体：9蛋白质对(a)对天然细胞因子或同源受体表现出显着降低的亲和力；和(b)特异性结合对应的工程化(正交)配体或受体。在正交配体结合后，正交受体激活通过天然细胞元件转导的信号传导，以提供模拟天然应答但对表达正交受体的工程细胞特异的生物活性。[0050]正交受体表现出与其同源天然细胞因子配体的结合显着降低，而正交细胞因子表现出与其同源天然受体的结合显着降低。在一些实施例中，正交细胞因子对同源正交受体的亲和力与天然细胞因子对天然受体的亲和力相当，例如具有至少约1%天然细胞因子-受体对亲和力的亲和力，至少约5%、至少约10%、至少约25%、至少约50%、至少约75%、至少或更多。具有远低于天然配体的结合亲和力。可以用竞争性结合实验确定亲和力，所述竞争性结合实验在各种浓度的未标记配体存在下测量受体与单一浓度的标记配体的结合。通常，未标记配体的浓度在至少六个数量级上变化。通过竞争性结合实验，可以确定IC₅0。如本文所用，11“IC₅。”是指50%抑制受体与标记配体之间的缔合所需的未标记配体的浓度。IC₅₀是配体-受[0052]如本文所用，术语“特异性结合”是指一个分子与另一个分子结合的选择性或亲和对的第一分子不与样品中存在的其他组分显着量结合时，结合对的第一分子会特异性结合结合对的第二分子。当第一分子对第二分子的亲和力至少大两倍时，结合对的第一分子被称为特异性结合结合对的第二分子，至少十倍大，至少20倍大，或比第一分子对样品中存在的其他组分的亲和力大至少100倍。在一个具体实施例中，结合对的第一分子是抗体，如果该抗体对结合对的第二分子的亲和力大于约10⁹升/摩尔，或者大于约10¹⁰升/摩尔，大于约10¹¹升/摩尔，大于约10¹²升/摩尔，则抗体特异性结合结合对的第二分子(例如蛋白质，抗原，配体或受体),正如Scatchard分析所确定(Munsen等人1980Analyt.Biochem.107:220-239)。可以使用本领域已知的技术评估特异性结合，包括但不限于竞争ELISA,BIACORE®测定和/或KINEXA®测定。[0053]如本文所用，相对于正交配体与其同源受体的天然存在形式的结合，正交配体与出显着降低的结合”用于描述正交配体相对于天然存在的配体相对于天然存在的受体的比较结合和活性。如果正交配体与受体的天然形式结合少于20%,或者小于约10%,或者小于约8%,或者小于约6%,或者小于约4%,或者小于约2%,或者小于约1%,或者小于天然存在的配体的约0.5%,则正交配体相对于配体的天然形式表现出显著降低的结合。类似地，如果配体的天然形式以小于20%,或者小于约10%,或者小于约8%,或者小于约6%,或者小于约4%,或者小于约2%,或者小于约1%,或者小于天然存在的受体的约0.5%,与受体的正交形式结合，则正交受体相对于配体的天然形式表现出显着降低的结合。[0054]正交IL-2多肽通过天然IL-2Rβ表现出显著降低的活化。可以在增殖测定中测量活(1987)inLymphokinesandI辑):IRLPress.295.重组人IL-2的比活性约为2.1x10⁴Iu/μg,其针对重组人，其针对重组人IL-2WHO国际标准进行校准(NIBSC代码：86/500)。正交人IL-2在可比较的测定中可具有小于20%,或者小于约10%,或者小于约8%,或者小于约6%,或者小于约4%,或者小于约2%,或者小于约1%,或者小于约0.5%的WHO国际标准(NIBSCcode:86/500)中人IL-2多肽两个氨基酸或两个核苷酸序列之间的相似性是相同位置数目的直接函数。通常，比对序列以获得最高阶匹配。如有必要，可以使用公开的技术和广泛可用的计算机程序来计算同一性，例如GCS程序包(Devereuxetal.,NucleicAcidsRes.12:387,1984),BLASTP,BLASTN,FASTA(Atschuletal.,J.MolecularBiol.215:403,1990)。可以使用序列分析软件以及其默认参数，例如威斯康星大学生物技术中心(1710UniversityAvenue,Madison,威斯康星州，53705)的遗传学计算机组的序列分析软件包，来测量序列同一性。(例如糖基化或磷酸化)。修饰而与野生型蛋白质不同的蛋白质。亲本多肽可以是天然存在的或野生型(WT)多肽，或者可以是WT多肽的修饰形式。术语变体多肽可以指多肽本身，包含多肽的组合物或编码它的核酸序列。与亲本多肽相比，变体多肽理想情况下包含至少一个氨基酸修饰，例如与母体相比，约1至约10个氨基酸修饰，并且优选与亲本相比约1至约5个氨基酸修饰。变体可以与野生型蛋白质至少约99%相同，至少约98%相同，至少约97%相同，至少约95%相同，至少约90%相同。肽，其随后被修饰以产生变体多肽。亲本多肽可以是野生型(或天然)多肽。亲本多肽可以指多肽本身，包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。[0059]本文中的“野生型”或“WT”或“天然”是指自然界中发现的氨基酸序列或核苷酸序序列或核苷酸序列。[0061]如本文所用，“治疗有效量”是指足以预防，治疗或控制疾病或病症的治疗剂例如过继性T细胞或正交细胞因子的量。治疗有效量可指足以延迟或最小化疾病发作的治疗剂的量，例如延迟或最小化癌症的扩散，或减少或增加来自感兴趣受体的信号传导的量效应。治疗有效量也可以指在疾病的治疗或管理中提供治疗益处的治疗剂的量。此外，关于本发明治疗剂的治疗有效量是指单独或与其他疗法组合的治疗剂的量，其在疾病的治疗或管理中提供治疗益处。中一种或多种病症的复发或发作或治疗剂。使用不限制患有病症的受试者施用预防剂和/或治疗剂的顺序。可以在(例如，5分钟、15分防剂或治疗剂。[0064]白细胞介素2(IL-2)是主要由活化的CD4+T细胞产生的多能细胞因子，并且在产生正常的免疫应答中起关键作用。IL-2促进活化的T淋巴细胞的增殖和扩增，增强B细胞生长，并激活单核细胞和自然杀伤细胞。正是由于这些活性，IL-2被测试并被用作批准的癌症治疗(aldesleukin,Proleukin®)。合成人IL-2作为153个氨基酸的前体多肽，从中除去20个133个氨基酸序列(较少的信号肽，由另外20个N-末端氨基酸组成)存在，如Fujita等，PNASUSA,80,7437-7441(1983)所述。人IL-2的氨基酸序列在Genbank中以登录定位号NPU000577.2检索到。人IL-2(SEQIDNO:4)和小鼠IL-2(SEQIDNO:3),人IL-2Rβ(SEQIDNO:1)和小鼠IL-2Rβ(SEQIDNO:2)的参考序列在图15中提供。[0065]IL-2通过在与IL-2受体(IL-2R)相互作用时启动细胞信号传导途径来支持T淋巴细胞的存活和分化。I1-2在临床上用于治疗许多人类疾病，包括癌症和自身免疫，并且作为过继性T细胞疗法的佐剂以促进移植的T细胞的存活。然而，IL-2也可以通过激活脱靶细胞类型而具有相应的作用。[0066]为了将IL-2的活性指向特定的T细胞亚群，本发明提供了工程化的正交IL-2和IL-2受体对。当与细胞表达的正交IL-2受体结合时，正交IL-2通过诱导有效的STAT5磷酸化和工程化表达正交IL-2Rbeta的T细胞的体外增殖来概括野生型IL-2的活性。正交IL-2相对于离体培养的野生型CD25阳性或阴性小鼠T细胞具有显著降低的结合。本公开的研究表明，重塑细胞因子受体界面以产生自然界中不存在的相互作用是将混杂细胞因子的活性引导至感兴趣的T细胞亚群的可行策略，从而能够通过基因工程精确控制T细胞功能。IL-2和IL-15共享相同的IL-2R-beta链。可以针对用于使IL-2正交的相同正交IL-2R-beta选择正交IL-15.IL-7利用独特的IL-7R-alpha链，其是正交化的靶标。[0068]在一些实施例中，正交细胞因子，例如正交IL2,可以与另外的分子缀合以提供期望的药理学性质，例如延长半衰期。在一个实施例中，正交IL-2可以与IgG,白蛋白或其他分子的Fc结构域融合以延长其半衰期，例如通过本领域已知的PEG化，糖基化等。在一些实施的分子量包括但不限于分子量在5kDa和80kDa之间的PEG,在一些实施例中，PEG具有约5kDa至约80kDa,约5kDa至约60kDa,约5kDa至约40kDa,约5kDa至约20kDa。在优选的实施例中，20kDa,或者30kDa,或者40kDa,或者40kDa,或者50kDa,或者30kDa。与多肽序列缀合的PEG可以是线性的或分支的。PEG可以直接连接到正交多肽上或通过接头分子连接。实现生物化合物的PEG化所必需的方法和化学反应在本领域中是众所周知的。[0069]可以使用本领域已知的方法，例如通过与N-末端乙酰转移酶和例如乙酰-CoA的酶促反应，在N-末端乙酰化正交IL-2。正交IL-2可以在一个或多个赖氨酸残基处乙酰化，例如通过与赖氨酸乙酰转移酶的酶促反应。参见，如Choudhary等(2009).Science.325(5942):[0070]Fc融合还可以赋予体内替代的Fc受体介导的性质。“Fc区”可以是天然存在的或合成的多肽，其与通过用木瓜蛋白酶消化IgG产生的IgGC-末端结构域同源。IgGFc具有约50kDa的分子量。直接同源物IL-2多肽可以包括整个Fc区或保留延长其所属嵌合多肽的循环半衰期的能力的较小部分。另外，全长或片段化的Fc区可以是野生型分子的变体。也就是说，它们可以含有可能影响或可能不影响多肽功能的突变；如下所述的情况下都不需要天然活性。[0071]在其他实施例中，正交多肽可以包含用作抗原标签的多肽，例如FLAG序列。FLAG序[0072]如上所述，本发明的正交蛋白质可以作为嵌合多肽的一部分存在。除了或代替上因的实例包括β-内酰胺酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、腺苷脱氨酶(编码β-半乳糖苷酶)和黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT)。与许多与本发明实践相关的标准程序一样，熟悉本领域的技术人员将知道其他有用的试剂，例如，可以服务于标记或报道分子功能的其他序列。[0073]正交细胞因子和受体还可以包括在细胞因子其他位置(例如，正交工程化中涉及ProteinSequenceandStructure5(1978)和Argos在EMBOJ.,8:779-785(1989)中描述的那些。例如，属于以下组之一的氨基酸代表保守变化：组I:ala,pro,gly,gin,asn,ser,phe,tyr,trp,his;和组VI:asp,glu。在每种情况下，可以评估附加修饰的引入，以最小化修饰多肽在待施用修饰多肽的生物体中的抗原性的任何增加。[0074]术语“T细胞”是指可以通过表达CD3和/或T细胞抗原受体来表征的哺乳动物免疫效应细胞，可以将其工程化以表达正交细胞因子受体。在一些实施例中，T细胞选自初始CD8[0075]在本发明的一个实施例中，表达正交受体的T细胞是已被修饰以表面表达嵌合抗互换使用，是指已被重组修饰以表达嵌合抗原受体的T细胞。如本文所用，可以改造CAR-T细在序列中从氨基到羧基末端排列的多个功能结构域的多肽：(a)抗原结合结构域(ABD),(b)跨膜结构域(TD);(c)一个或多个细胞质信号传导结构域(CSD),其中前述结构域可以任选地通过一个或多个间隔结构域连接。CAR还可以进一步包含在翻译后加工和CAR在细胞表面上呈递期间常规去除的信号肽序列。本发明的实践中有用的CAR根据本领域公知的原理制备。可参阅以下文献：Eshhaar等，2010年6月22日发布的美国专利号7,741,465B1;Sadelain等(2013)CancerDiscovery3(4):388-398;JensenandRiOpinionsinImmunology33:9-15;Gross等(1989)PNAS(USA)86(24):10024-10028;Curran等(2012)JGeneMed14(6):405-15.可以修饰以掺入本发明的正交受体的市售CAR-T细胞产物的实例包括axicabtageneciloleucel(市售自GileadPharmaceuticYescarta)和tisagenlecleucel(市售自Novartis的Kymriah)。[0076]如本文所用，术语抗原结合结构域(ABD)是指特异性结合靶细胞表面上表达的抗疫球蛋白重链和轻链的可变区组成的多肽(Bird等(1988)Science242:423-426;Huston于单克隆抗体序列的ScFvs的产生在本领域中是众所周知的。参见例如TheProteinExpression,PurificationandCharacterizationofSingle-ChainAntibodies”过产生肽文库并基本上根据教导或Wigler等人分离具有所需靶细胞抗原结合特性的化合合双特异性结合成员的非限制性实例包括双特异性抗体，双特异性缀合的单克隆抗体(mab)₂,双特异性抗体片段(例如F(ab)₂,双特异性scFv,双特异性双抗体，单链双特异性双抗体等),双特异性T细胞衔接子(BiTE),双特异性缀合的单结构域抗体，小鼠及其突变体等。嵌合双特异性结合成员的非限制性实例还包括Kontermann(2等(2016)LeukRes.49:13-5(6):507-511;DeKruifandLo合成员可以是双特异性T细胞接合者(BiTE)。等所描述的那些。(2015)JAmChemSoc.137(8):2832-5;Ma等。(2016)ProcNatlAcadSciUSA.113(4):E450-8和Cao等(201[0079]在一些实施例中，任选地将接头多肽分子掺入抗原结合结构域和跨膜结构域之间何一个的铰链，特别是人蛋白质序列。替代方案包括免疫球蛋白的CH2CH3区域和部分CD3。在ABD是scFv的情况下，可以使用IgG铰链。在一些实施例中，接头包含氨基酸序列(G₄S)[0080]在本发明的实践中有用的CAR还包括将ABD(或接头，如果使用的话)连接到CAR的细胞内胞质结构域的跨膜结构域。跨膜结构域由在真核细胞膜中热力学稳定的任何多肽序列组成。跨膜结构域可以源自天然存在的跨膜蛋白的跨膜结构域，也可以是合成的。在设计合成跨膜结构域时，优选有利于alpha-螺旋结构的氨基酸。用于构建CARs的跨膜结构域由有alpha-螺旋二级结构。有利于alpha-螺旋构象的氨基酸在本领域中是众所周知的。参见[0081]CAR多肽的细胞质结构域包含一个或多个细胞内信号结构域。在一个实施例中，细胞内信号结构域包含T细胞受体(TCR)的细胞质序列和在抗原受体接合后启动信号转导的共受体及其功能性衍生物及其亚片段。衍生自T细胞受体ζ-链的细胞质信号传导结构域，用作CAR的一部分，以便在嵌合受体与靶抗原结合后产生T淋巴细胞增殖和效应子功能的刺激信号。细胞质信号传导结构域的实例包括但不限于CD27的细胞质结构域，CD28的细胞质结构域，CD137的细胞质结构域(也称为4-1BB和TNFRSF9),CD278的细胞质结构域(也称为ICOS),PI3激酶的p110α,β或δ催化亚基，人Cd3ζ-链，CD134胞浆区(也称为0X40和TNFζ酶(Syk,ZAP70等),src家族酪氨酸激酶(Lck,Fyn,Lyn等)和其他参与T细胞转导的分子，如刺激结构域，通常是内结构域，其提供次级非特异性激活机制，通过该机制传播初级特异性刺激。共刺激结构域是指增强记忆细胞增殖，存活或发育的CAR部分。共刺激的实例包括通过T细胞受体的抗原特异性信号传导后的抗原非特异性T细胞共刺激和通过B细胞受体的信号传导后的抗原非特异性B细胞共刺激。共刺激，例如T细胞共刺激，以及涉及的因素已进行细胞质结构域仅通过单个信号传导结构域传递来自抗原结合的信号，例如衍生自IgEFcεRIγ或Cd3ζ链的高亲和力受体的信号传导结构域。该结构域含有一个或三个用于抗原依赖性T细胞活化的基于免疫受体酪氨酸的活化基序[ITAM]。基于ITAM的激活信号赋予T细胞裂解靶肿瘤细胞和分泌细胞因子以响应抗原结合的能力。第二代CAR还包括共刺激信号，除了CD3ζ信号之外。巧合传递递送共刺激信号，增强了由CART转导的T细胞诱导的细胞因子分泌和抗肿瘤活性。共刺激结构域通常相对于CD3(结构域是膜近端的。第三代CARs包括三方信号传导结构域，其包含例如CD28,CD3ζ,0X40或4-1BB信号传导区域。在第四代中，或“装甲车”CART细胞被进一步基因修饰以表达或阻断分子和/或受体以增强免疫活性。[0084]本发明的CAR中包含的细胞内信号传导结构域的实例包括(氨基到羧基):CD3ζ;性CAR(iCARs)和诱导多能干(iPS)CAR-T细胞。单独的分子上。CAR变体还包括开关CAR,其是条件可活化的CAR,例如包含分裂CAR,其中分98;Cartellieri等，JBiomedBiotechnol(2010)956304;其公开内容全部通过引用并入本[0088]术语“抑制性嵌合抗原受体”或“iCARs”在本文中可互换使用，指的是一种CAR,其中结合iCARs使用双重抗原靶向，通过与第二抑制性受体结合而关闭活性CAR的激活，该第二抑制性受体配备有二级CAR结合的抑制性信号传导结构域导致抑制初级CAR活化。抑制性CAR(iCAR)被设计为通过抑制性受体信号传导模块激活来调节CAR-T细胞活性。该方法结合与仅由正常组织表达的特异性抗原结合时，iCAR可以关闭抵消激活剂CAR的反应。这样，iCARs-T细胞可以将癌细胞与健康细胞区分开，并以抗原选择性方式可逆地阻断转导的T细胞的功能。iCARs中的CTLA-4或PD-1细胞内结构域触发T淋巴细胞上的抑制信号，导致较少的细胞因子产生，较低效的靶细胞裂解和淋巴细胞运动性改变。[0089]术语“串联CAR”或“TanCAR”是指通过两种嵌合受体的接合介导T细胞的双特异性活化的CAR,所述嵌合受体被设计为响应于两种不同肿瘤相关抗原的独立接合而递送刺激或共刺激信号。[0090]通常，嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是T细胞，其已经通过基本上按照上述教导[0091]可以使用患者自身的T细胞制备细胞用于工程。因此，待施用的细胞群对受试者必所述治疗相关毒性在施用CAR-T细胞治疗前用药理学免疫抑制或B细胞耗竭过程的持续监耗竭的疗法包括通过既定的临床剂量指南静脉注射免疫球蛋白(IVIG),以恢复血清免疫球平衡盐溶液等，其中适当地补充胎牛血清或其他天然存在的因子，以及低浓度(例如，5- 279-94,“AdoptiveTC626-39“AdoptiveCellTherapy-Tumor-InfiltratingLymphocytes,T-CellReceptandChimericAntigenReceptors”;ClinicalTrialNCT01174121,"ImmunotherapyUsingTumorInfiltratingLymphocyTran等。(2014)Science344(6184)641-645,"Cancerimmunotherapybasedonmutation-specificCD4+试验NCT03121625;NCT03016377;NCT02476734;NCT02746952;NCT02808442。参见综述[0096]如上所述从受试者或捐赠者收集的用于工程的T细胞可以通过富集所需细胞的技地补充胎牛血清或其他天然存在的因子，以及低浓度(例如，5的缓冲液包括HEPES,磷酸盐缓冲液，乳酸缓冲液等。亲和分离技术可能包括磁分离，使用抗体包被的磁珠，亲和层析，与单克隆抗体连接或与单克隆抗体结合使用的细胞毒性剂，例如补体和细胞毒素，并用附着于固体基质(例如板)或其他方便技术的抗体“淘选”。提供准确分离的技术包括荧光激活细胞分选仪，其可以具有不同程度的复杂性，例如多色通道，低角度和钝光散射检测通道，阻抗通道等。可以通过使用与死亡细胞相关的染料(例如碘化丙啶)。可以采用不会对所选细胞的活力造成不适当的损害的任何技术。亲和试剂可以是上述细胞表面分子的特异性受体或配体。除抗体试剂外，还可使用肽-MHC抗原和T细胞受体对；肽配体和受体；效应物和受体分子等。可以将分离的细胞收集在维持细胞活力的任何合适的培养基中，通常在收集管底部具有血清缓冲。可以购买各种培养基，并可根据细胞的性质使用，包括经常补充胎牛血清(FCS)的dMEM,任选富集的细胞群可以立即用于遗传修饰，或者可以在液氮温度下冷冻并储存，解冻并能够重复使用。细胞通常储存在10%DMSO,50%FCS,40%RPMI1640培养基中。工程细胞可以通过任何方便的给药途径(通常在血管内)在任何生理学上可接受的培养基中输注给受试者，尽管它们也可以通过其他途径引入，其中细胞可以找到合适的生长位点。通常，将施用至少1×10⁶个细胞/kg,至少1×10⁷个细胞/kg,至少1×108个细胞/kg,至少1×10⁹个细胞/kg,至少1×10¹⁰个细胞/kg或更多，收集期间获得的T细胞通常受数量的限制。[0097]本发明实践中使用的同种异体T细胞可以进行遗传修饰以减少移植物抗宿主病。例如，本发明的工程细胞可以是通过基因编辑技术实现的TCRaβ受体敲除。TCRaβ是异二聚基因位点K0已被删除用于此目的。已经使用许多不同的方法来实现这种删除，例如CRISPR/Cas9;大范围核酸酶；工程化的I-CreI归巢核酸内切酶等。参见例如Eyquem等(2017)Nature543:113-117,其中TRAC编码序列被CAR编码序列取代；Georgiadis等(2018)Mol.Ther.26:1215-1227,它通过规则间隔的短回文重复序列(CRISPR)/Cas9将CAR表达与细胞以表达TCRaβ信号传导的抑制剂，例如使用截短形式的Cd3ζ作为TCR抑制分子。[0098]本发明的实践中有用的T细胞的制备通过用包含编码正交受体的核酸序列的表达载体转化分离的T细胞；任选与上述所述编码CAR的核酸序列组合来实现。编码CAR和正交受体的核酸序列可以各自提供在单独的表达载体上，每个核酸序列可操作地连接到一个或多个表达控制元件以实现CAR和正交受体在靶细胞中的表达，载体被共转染到靶细胞中。或者，编码CAR和正交受体的核酸序列可以各自在一个或多个表达控制元件控制下的每个核酸序列的单个载体上提供，以实现相关核酸序列的表达。或者，两种核酸序列都可以在单个启动子的控制下，其中插入或下游控制元件促进两种序列与载体的共表达。[0099]离体T细胞活化可以通过本领域公认的程序实现，包括基于细胞的T细胞活化，基于抗体的活化或使用各种基于珠子的活化试剂的活化。基于细胞的T细胞活化可以通过将T细胞暴露于抗原呈递细胞如树突细胞或人造抗原呈递细胞如经照射的K562细胞来实现。用可溶性抗CD3单克隆抗体基于抗体的T细胞表面CD3分子活化也支持在IL-2存在下的T细胞[0100]通常，通过培养与表面接触的细胞来扩增本发明的T细胞，所述表面提供刺激CD3TCR复合物相关信号的试剂(例如抗CD3抗体)和刺激T细胞表面上的共刺激分子的试剂(例如抗CD28抗体)。基于磁珠的T细胞活化已经在本领域中被接受用于制备用于临床的CAR-T细胞。可以使用市售的T细胞活化试剂实现基于磁珠的T细胞活化，所述T细胞活化试剂包括但不限于Invitrogen®CTSDynabeads®CD3/28(LifeTechnologies,Inc.CarlsbadCA)或MiltenyiMACS⑧GMPExpActTreg磁珠或MiltenyiMACSGMPTransActTMCD3/28磁珠(MiltenyiBiotec,Inc)。适合于T细胞培养的条件在本领域中是众所周知的。Lin等2009)e312015年1月16日线上发布。将靶细胞维持在支持生长所必需的条件下，例如适当的温度(37℃)和环境(例如空气和5%CO₂)。[0101]当正交受体或表达正交受体的CAR-T细胞是生长因子受体时，表达正交受体的CAR-T细胞也可以通过使用正交受体的配体从背景或转导和未转导细胞的混合群体中选择性扩增。在一个实施例中，正交受体是正交IL-2受体，用于扩增此类细胞的正交IL-2化合物是选自表1中组的正交IL-2。[0102]在本方法中，可以通过重组方法产生正交蛋白，特别是正交细胞因子。可以将正交受体在表达载体上引入待工程化的细胞中。编码正交蛋白质的DNA可以从工程过程中设计的各种来源获得。[0103]如本文所述，通过在编码序列中引入适当的核苷酸变化来制备氨基酸序列变体。此类变体代表所述残基的插入，取代和/或指定的删除。只要最终构建体具有如本文所定义的所需生物活性，就进行插入，取代和/或指定删除的任何组合以得到最终构建体。[0104]为了实现重组蛋白的表达，将编码正交蛋白(和/或CAR)的核酸插入可复制载体中进行表达。许多这样的载体是可用的。载体组分通常包括但不限于以下一种或多种：复制起[0105]用于在T细胞中表达正交受体和任选CAR的表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。质粒是非病毒载体的实例。为了促进靶细胞的转染，可以在促进非病毒载体摄取的条件下用非病毒载体直接暴露靶细胞。促进哺乳动物细胞摄取外源核酸的条件的实例在本领域中是众所周知的，并且包括但不限于化学手段(例如Lipofectamine®,ThermoFisherScientific),高盐和磁场(电穿孔)。[0106]在一个实施例中，可以在非病毒传递系统中提供非病毒载体。非病毒传递系统通常是促进用核酸货物转导靶细胞的复合物，其中核酸与诸如阳离子脂质(DOTAP,DOTMA),表面活性剂，生物制剂(明胶，壳聚糖),金属(金，磁性铁)和合成聚合物(PLG,PEI,PAMAM)。非病毒递送系统的许多实施例在本领域中是众所周知的，包括脂质载体系统(Lee等(1997)CritRevTherDrugCarrierSyst.14:173-206);p的第5013556号);阳离子脂质体(Epand等，美国专利。1994年2月1日发布的第5283185号；Jessee,J.A.,美国专利。1996年11月26日发布[0107]在另一个实施例中，表达载体可以是病毒载体。当病毒载体系统用于CAR并表达正交受体时，逆转录病毒或慢病毒表达载体是优选的。尤其是，病毒载体是gamma逆转录病毒(Pule,等(2008)NatureMedicine14(11):1264-1270),self-inactivatinglentiviralvectors(June,等(2009)NatRevImmunol9(10):704-716)和逆转录病毒载体，正如之前所述，Naldini,等(1996)Science272:263-267;Naldini,等(1996)Proc.Nat1.Acad.Sci.USAVol.93,pp.11382-11388;Dull,等(1998)J.Virology72(11):8463-8471;Milone,等(2009)17(8):1453-1464;Kingsman,等2000年8月1日发布的美国专利号6096538和Kingsman等2005年8月2日发布的美国专利号6924123。在本发明的一个实施[0108]用表达载体转导T细胞可以使用本领域公知的技术完成，包括但不限于与宿主T细胞与病毒载体共孵育，电穿孔和/或化学增强传递。[0109]正交蛋白质不仅可以直接重组产生，而且可以作为具有异源多肽的融合多肽，例如在成熟蛋白质或多肽的N-末端具有特异性切割位点的信号序列或其他多肽重组产生。通常，信号序列可以是载体的组件，或者它可以是插入载体的编码序列的一部分。优选选择的异源信号序列是宿主细胞识别和处理(即，被信号肽酶切割)的信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可以使用天然信号序列，或者其他哺乳动物信号序列，例如来自相同或相关物种的分泌多肽的信号序列，以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。[0110]表达载体通常含有选择基因，也称为选择标记。该基因编码在选择性培养基中生长的转化宿主细胞的存活或生长所必需的蛋白质。未用含有选择基因的载体转化的宿主细胞将不能在培养基中存活。典型的选择基因编码的蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素，新霉素，甲氨蝶呤或四环素)的抗性，(b)补养基无法获得的关键营养素。[0111]表达载体将含有被宿主生物体识别并可操作地连接至正交蛋白质编码序列的启动子。启动子是位于结构基因起始密码子上游(5’)的非翻译序列(通常在约100至1000bp内),其控制与其可操作连接的特定核酸序列的转录和翻译。这样的启动子通常分为诱导型和组成型两类。诱导型启动子是响应于培养条件的一些变化(例如，营养物的存在或不存在或温度变化)从其控制下的DNA启动增加的转录水平的启动子。众所周知，多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。[0112]来自哺乳动物宿主细胞中载体的转录可以例如通过从病毒基因组获得的启动子来控制，所述病毒例如多瘤病毒，禽痘病毒，腺病毒(例如腺病毒2),牛乳头瘤病毒，禽肉瘤病毒，巨细胞病毒，逆转录病毒(如鼠干细胞病毒),乙型肝炎病毒和大多数优选地，来自异源哺乳动物启动子，例如肌动蛋白启动子，PGK(磷酸甘油酸激酶)或免疫球蛋白启动子的猿猴病毒40(SV40),条件是这些启动子与宿主细胞系统相容。SV40病毒的早期和晚期启动子可方便地作为SV40限制性片段获得，其也含有SV40病毒复制起点。[0113]高等真核生物的转录通常通过将增强子序列插入载体而增加。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp,其作用于启动子以增加其转录。增强子是相对方向和位置独立的，已经在转录单元的5'和3',内含子内以及编码序列本身内发现。现在从哺乳动物基来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点后期的SV40增强子，巨细胞病毒早期启动子增强子，复制起点后期的多瘤增强子和腺病毒增强子。增强子可以在编码序列的5'或3'[0114]用于真核宿主细胞的表达载体还将含有终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这些序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔3'非翻译区域获得。含有一种或多种上述组分的合适载体的构建采用标准技术。[0115]用于在本文载体中克隆或表达DNA的合适宿主细胞是上述原核生物，酵母或高等真核生物细胞。有用的哺乳动物宿主细胞系，例如小鼠L细胞(L-M[TK-],ATCCCRL-2648),由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCCCRL1651);人胚肾系(293或293细胞亚克隆用于悬支持细胞(TM4);猴肾细胞(CV1ATCCCCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCCCRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCCCCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCCCCL34);水牛大鼠肝细胞(BRL3A,ATCCCRL1442);人肺细胞(W138,ATCCCCL75);人肝细胞(HepG2,HB8[0116]可以用上述表达载体转染宿主细胞，包括工程化T细胞，用于正交IL-2或IL-2R表达。可以在适合于诱导启动子，选择转化体或扩增编码所需序列的基因的常规营养培养基中培养细胞。哺乳动物宿主细胞可以在各种培养基中培养。市售培养基如Ham'sF10ModifiedEagle'sMedium((DMEM),Sigma)适用于培养宿主细胞。这些培养基中的任何一种都可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素，转铁蛋白或表皮生长因子),盐(如氯化钠，钙，镁和磷酸盐),缓冲液(如HEPES),核苷(如腺苷和胸苷),抗生素，微量元素，和葡萄糖或等效能源。任何其他必需的补充剂也可以以本领域技术人员已知的适当浓度包括在内。培养条件，例如温度，pH等，是先前与选择用于表达的宿主细胞一起使用的培养条件，并且对于通常技术人员而言是显然的。列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则其可操作地与多肽的DNA连接；如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则其可操作地与编码序列连接；或者如果核糖体结合位点被定是连续的，并且在分泌前导序列的情况下是连续的并且处于阅读阶段。但是，增强器不必是连续的。[0118]重组产生的正交多肽可以作为分泌多肽从培养基中回收，尽管它也可以从宿主细胞裂解物中回收。蛋白酶抑制剂，例如苯基甲基磺酰氟(PMSF)也可用于抑制纯化过程中的蛋白水解降解，并且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。本领域已知各种纯化步骤并可用于，例如亲和层析。亲和层析利用通常存在于生物大分子中的高度特异性结合位点，分离分子结合特定配体的能力。共价键以明显地将配体呈递给蛋白质样品的方式将配体连接到不溶性多孔载体介质上，从而使用一种分子物质的天然生物特异性结合从混合物中分离和纯化第二种物质。抗体通常用于亲和层析。也可以使用尺寸选择步骤，例如使用凝胶过滤色谱法(也称为尺寸排阻色谱法或分子筛色谱法)根据其大小分离蛋白质。在凝胶过滤中，蛋白质溶液通过填充有半透性多孔树脂的柱。半透性树脂具有一系列孔径，可确定可与色谱柱分离的蛋白质大小。同样适用于阳离子交换色谱。[0119]可以使用本领域已知的方法浓缩，过滤，透析等正交细胞因子组合物。对于治疗应用，可以将细胞因子施用于包含适当工程化正交受体的哺乳动物。静脉内给药，作为推注或病灶周围途径或淋巴施用，以发挥局部和全身治疗效果。[0120]这种剂型包括生理上可接受的载体，其本质上是无毒的和非治疗性的。此类载体吡咯烷酮、纤维素基物质和PEG。用于局部或基于凝胶的多肽形式的载体包括多糖，例如羧甲基纤维素钠或甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酸酯、聚氧乙烯-聚氧乙烯嵌段聚合ml至100μg/ml.的浓度配制在此类载体中。[0121]如果本公开的直接同源物IL-2多肽是“实质上纯”,它们可以是目的多肽的重量至少约60%(干重),例如含有直接同源物IL-2氨基酸序列的多肽。例如，多肽可以是感兴趣的多肽重量的至少约75%,约80%,约85%,约90%,约95%或约99%。纯度可以通过任何合适[0122]在本发明的另一个实施例中，提供了含有用于处理上述条件的材料的制造物品。制造物品包括容器和标签。合适的容器包括例如瓶子，小瓶，注射器和试管。容器可以由各种材料形成，例如玻璃或塑料。该容器保持有效治疗病症的组合物并且可以具有无菌进入口(例如，该容器可以是静脉内溶液袋或具有可通过皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。组合物中的活性剂是正交细胞因子。容器上或与容器相关的标签表明该组合物用于处理所选条件。另外的容器可以随制造物品提供，所述制造物品可以容纳例如药学上可接受的缓冲液，例如磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液或葡萄糖溶液。制造物品可以进一步包括从商业和用户器和包装插页。生长能力的细胞(例如，以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症)。过度增殖和肿瘤疾病状态可以分类为病理性的(例如，表征或构成疾病状态),或者它们可以分类为非病理性的(例如，作为偏离正常但与疾病状态无关)。这些术语旨在包括所有类型的癌性生长或致癌过程，转移组织或恶性转化的细胞，组织或器官，而与组织病理学类型或侵袭阶段无关。“病理性过度增殖”细胞发生在以恶性肿瘤生长为特征的疾病状态。非病理性过度增殖性肿瘤，包括影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴腺和淋巴组织、胃肠器官和泌尿生殖道的恶性肿瘤，以及通常被认为包括恶性肿瘤的腺癌，例如大多数结肠癌、肾细胞是指源自腺体组织或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。乳腺癌、恶性间皮瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合症、骨髓增生性疾病、鼻腔和鼻旁鳞状细胞或表皮样癌、支气管腺瘤、绒毛膜癌、头颈癌、畸胎癌或Waldenstrom巨球蛋白血症。与非癌细胞相比，癌细胞表现出增加的CD47表达的任何癌症是通过受试者方法和组合物治疗的合适癌症。[0126]本发明的组合物和方法可以与另外的治疗剂组合。例如，当疾病，待治疗的病症或病症是肿瘤疾病(例如癌症)。本发明的方法可以与常规化学治疗剂或其他生物抗癌药物例如检查点抑制剂(例如PD1或PDL1抑制剂)或治疗性单克隆抗体(例如阿瓦斯汀，赫赛汀)组合。[0127]本领域中鉴定为可用于治疗肿瘤疾病的化学剂的例子包括但不限于阿比曲沙、阿[0128]可以联合给药的靶向治疗可能包括酪氨酸激酶抑制剂，如甲磺酸伊马替尼(Gleevec,也称为STI-571)、吉非替尼(Iressa,也称为Zd1839)、厄洛替尼(市售Tarceva)、索拉非尼(Nexavar)、舒尼替尼(Sutent)、达沙替尼(Sprycel)、拉帕替尼(Tykerb)、尼洛替尼(Tasigna)和硼替佐米(Velcade),鲁索替尼(ruxolitinib);Janus激酶抑制剂，如托法替滨；丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂，如替西罗莫司(Torisel)、依维莫司(Afinitor)、维罗非尼(Zelboraf)、曲美替尼(Mekinist)和达拉菲尼(Tafinlar)。[0129]本领域鉴定的用于治疗肿瘤疾病的生物制剂的实例包括但不限于细胞因子或细胞(例如树突细胞疗法),抗肿瘤疫苗、具有复制能力的病毒、信号转导抑制剂(例如，Gleevec⑧或HerceptinR)或免疫调节剂以实现对肿瘤生长的累加或协同抑制、环氧合酶2(COX-2)抑制剂、类固醇、TNF拮抗剂(例如Remicade⑧和Enbrel⑧)、干扰素-βlaKeytrudaRMK-3475,lambrolizumab,购于MerckandCompany,KenilworthNj),和阿特朱单抗(Tecentriq®Genentech/Roche子包括但不限于度伐单抗(MEDI4736,Medimmune/AstraZeneca)、pidilizumab(CT-011,CureTech)、PDRO01(Novartis)、2012年7月10日发布的美国专利号8217149(Genentech,Inc);2012年5月1日发布的美国专利号8168757(MerckSharp和DohmeCorp.),2011年8月30日发布的美国专利号8008449(Medarex),2011年5月17日发布的美国专利号7943743(MedaPD1与PDL1和/或PDL2抑制剂在本领域中是众所周知的。参见Sasikumar,etalasWO2016142833A1andSasikumar,等人WO2016142886A2,BMS-1166andBMS-1001(Skalniak,etal(2017)Onc体(即受试者)的至少一个细胞中的任何状态被感染因子感染(例如，受试者具有细胞内病氧西林、苯唑西林、羧苄青霉素、荼夫西林、氨苄青霉素等；青霉素与β-lactamase素γ,肿瘤坏死因子α,白细胞介素12等。抗病毒剂，例如阿昔洛韦，更昔洛韦等也可用于治[0134]在其他实施例中，调节性T细胞被设计用于治疗自身免疫疾病。炎症性疾病和与炎症相关的疾病的范围很广，包括类风湿性关节炎(Ra)、系统性红斑狼疮(SLE)、多发性硬化症(MS)和自身免疫性肝炎等自身免疫性疾病；胰岛素依赖性糖尿病、退行性疾病，如骨关节炎(Oa)、阿尔茨海默氏病(AD)和黄斑变性。[0135]许多(如果不是大多数的话)自身免疫和炎性疾病涉及多种类型的T细胞，例如TH1、TH2、TH17等。自身免疫性疾病的特征是T和B淋巴细胞异常靶向自身蛋白质，多肽，肽和/或其他自身分子，导致体内器官，组织或细胞类型的损伤和/或功脑、甲状腺或胃肠道)引起该疾病的临床表现。自身免疫疾病包括影响特定组织的疾病以及可影响多种组织的疾病，其可部分取决于反应是针对局限于特定组织的抗原还是针对广泛分布于体内的抗原。[0136]本发明提供了工程化正交细胞因子受体/配体对及其使用方法。工程化(正交)细胞因子特异性结合对应的工程化(正交)受体。结合后，正交受体激活通过天然细胞元件转导的信号传递，以提供模拟该天然应答但对表达正交受体的工程化细胞特异的生物活性。正交受体表现出与内源性对应细胞因子(包括正交细胞因子的天然配对物)的结合显著降低，而正交细胞因子表现出与任何内源性受体(包括正交受体的天然配对物)的结合显着降低。在一些实施例中，正交细胞因子对正交受体的亲和力与天然细胞因子对天然受体的亲和力相当。[0137]正交细胞因子和受体对可以选自任何目的细胞因子。设计正交细胞因子受体对的过程可能包括以下步骤：(a)将氨基酸变化工程化为天然受体以破坏与天然细胞因子的结合；(b)在受体结合的接触残基处将氨基酸工程化为天然细胞因子，(c)选择与正交受体结合的细胞因子直向同源物；(d)丢弃与天然受体结合的直向同源细胞因子，或(e)选择结合直向同源细胞因子的受体直向同源物；(f)丢弃与天然细胞因子结合的直向同源物受体。在优选的实施例中，使用细胞因子/受体复合物结构的知识来选择用于定点或易错突变的氨基酸位置。酵母展示系统可以方便地用于选择过程，尽管其他显示和选择方法也是有用的。[0138]在某些情况下，通过亲和力成熟获得氨基酸变化。“亲和力成熟”多肽是在一个或多个残基中具有一个或多个改变的多肽，与不具有这些改变的亲本多肽相比，其导致正交使结合亲和力增加至少约10%至50-100-150%或更多，或1至5倍。如上所述，本发明的工程化正交细胞因子激活正交受体，但具有显着降低的天然受体的结合和活化，例如正交细胞因子在与相应天然细胞因子的竞争性抑制中可表现出小于约5%的抑制当评估时在合适的测定条件下使用足够量的分子通过ELISA和/或FACS分析。[0139]在本发明的一些实施例中，正交受体是IL-2受体链，即选自白细胞介素2受体alpha(IL-2Ra;Cd25),白细胞介素2受体beta(IL-2Rβ;CD122)和白细胞介素2受体γ(IL-2Rα;CD132;普通γ