CN120210079A 一种缓解急性醉酒的益生菌组合物及其制备方法和应用

(19)国家知识产权局(10)申请公布号CN120210079A(21)申请号202510695974.4(22)申请日2025.05.28(83)生物保藏信息CCTCCNO:M2025682202CCTCCNO:M2022881202(71)申请人南京农业大学三亚研究院地址572025海南省三亚市崖州湾科技城振州路梧桐产业园区9栋(72)发明人李伟姜文铠肖路遥赵小淦(74)专利代理机构北京领果世纪知识产权代理有限公司16221专利代理师刘元仁A23L33/135(2016.01)(54)发明名称一种缓解急性醉酒的益生菌组合物及其制备方法和应用(57)摘要本发明公开了一种缓解急性醉酒的益生菌组合物及其制备方法和应用，属于益生菌应用技术领域，提供了一种缓解急性醉酒的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物包括副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB和罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360;所述副干酪乳杆菌STB保藏编号为CCTCCNO:M2022881;所述罗伊氏粘液乳杆菌组合组通过副干酪乳杆菌STB和罗伊氏粘液乳杆菌Care360总超21.一种缓解急性醉酒的益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物包括副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB和罗伊氏粘液乳杆菌Care360Limosilactobacillus所述副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB于2022年6月14日保藏于中国所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360于2025年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为2.根据权利要求1所述益生菌组合物，其特征在于，所述益生菌组合物中所述副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB和所述罗伊氏粘液乳杆菌CareLimosilactobacillusreuteriCare360的质量比为1:1。3.根据权利要求1所述益生菌组合物，其特征在于，所述副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB的有效活菌数为2×10⁸~4.5×10⁸CFU/mL,所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的有效活菌数为3×10⁸~4.1×4.如权利要求1~3任一项所述益生菌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB接种于MRS液体培养基中，发酵，得副干酪乳杆菌发酵液；(2)罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360接种于MRS液(3)步骤(1)所得副干酪乳杆菌发酵液，离心，得副干酪乳杆菌菌泥，副干酪乳杆菌菌泥采用生理盐水重悬，得副干酪乳杆菌菌悬液；(4)步骤(2)所得罗伊氏粘液乳杆菌发酵液，离心，得罗伊氏粘液乳杆菌菌泥，罗伊氏粘液乳杆菌菌泥采用生理盐水重悬，得罗伊氏粘液乳杆菌菌悬液；(5)步骤(3)所得副干酪乳杆菌菌悬液与步骤(4)所得罗伊氏粘液乳杆菌菌悬液按照质5.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB的接种量按照MRS液体培养基的体积的2~6%计算；步骤(1)中所述发酵的温度为37℃,发酵的时间为8~16h。6.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的接种量按照MRS液体培养基的体积的2~6%计算；步骤(2)中所述发酵的温度为37℃,发酵的时间为8~16h。7.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心的温度为0~4℃,离心的转速为5000~7000rpm,离心的时间为4~6min;步骤(3)中所述副干酪乳杆菌菌悬液中有效活菌数为2×10⁸~4.5×10CFU/mL。8.根据权利要求4所述制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述离心的温度为0~4℃,离心的转速为5000~7000rpm,离心的时间为4~6min;步骤(4)中所述罗伊氏粘液乳杆菌菌悬液中有效活菌数为3×10⁸~4.1×108CFU/mL。9.如权利要求1~3任一项所述益生菌组合物在制备快速解酒护肝产品中的应用。310.如权利要求4~8任一项所述制备方法制备所得益生菌组合物在制备快速解酒护肝产品中的应用。4一种缓解急性醉酒的益生菌组合物及其制备方法和应用技术领域[0001]本发明属于益生菌应用技术领域，尤其涉及一种缓解急性醉酒的益生菌组合物及其制备方法和应用。背景技术[0002]我国的酒类消费额一直处在前列，据目前领域内研究和调查报告显示，由于过度饮用乙醇而造成肝脏损害的人群量不可忽视。就现今而言，酒类在大多数人群的日常生活中扮演着不可或缺的角色，基于此催生出如何解决人短时间摄入醉酒量酒类紧急缓解醉酒的问题。另外，大多数人对乙醇的分解代谢速率较低，从而加重了乙醇对机体健康损害的发生概率。研究表明，短期内饮用酒类醉酒后不仅会造成机体产生多种不适的症状，同时也会增加诱发潜在的患炎等病症风险。近年来，市面上出现大量产品多集中于治疗或缓解急性或慢性酒精性肝损伤，主要包括抗氧化剂、抗炎药物、保肝药物以及益生菌等，但这些药物存在副作用大、疗效有限和效果有限等问题。[0003]近几年领域内有数量不少的专利中提到使用益生菌来缓解酒精性肝损伤和酒后不适症状。例如，公开号为CN117987307A,名称为《一株能缓解急性酒精性肝损伤的酸鱼乳acidipiscis)具有显著的乙醇耐受性，能够缓解酒精性肝损伤；公开号为CN117801991A,名称为《用于缓解酒后不适症状的益生菌后生元组合物及用途》则提到使用动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacteriumanimalissubsp.lactis)ProSci-246的益生菌后生元组合物来缓解酒后不适症状；公开号为CN114426942A,名称为《一种重组乳酸乳球菌、微胶囊及其应用》提到通过基因工程技术构建重组乳酸乳球菌，表达乙醇脱氢酶(ADH)和乙醛脱氢酶(ALDH),以分解酒精，减少酒精对肝脏和肠道的损伤；公开号为CN116622559A,名称为《一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌、解酒益生菌组合物及其制备方法》提到使用产乙醛脱氢酶的干酪乳备解酒益生菌组合物，具有解酒和保肝护肝的作用；公开号为CN117801991A,名称为《用于缓解酒后不适症状的益生菌后生元组合物及用途》提到使用益生菌的灭活菌体、菌体成分及其代谢产物(后生元)来缓解酒后不适症状，如延长酒精耐受时间、缩短醉酒时间等。[0004]尽管益生菌在解酒领域显示出一定的效果，但现有技术中单一菌株的效果有限。例如，公开号为CN116622559A,名称为《一种产乙醛脱氢酶的干酪乳杆菌、解酒益生菌组合物及其制备方法》提到现有技术中通常需要多种益生菌或与中药成分配合才能达到较好的解酒效果，而单一菌株的效果尚未得到充分验证，现有的解酒产品虽然能够缓解部分酒后不适症状，但解酒效果仍然不够显著,尤其是在急性酒精性肝损伤的情况下，现有的益生菌组合物可能无法完全缓解酒精对肝脏的损伤，酗酒者肠道菌群严重紊乱，现有的益生菌产品虽然能够调节肠道菌群，但效果有限，无法完全恢复肠道菌群的平衡，尤其是在长期酗酒的情况下；公开号为CN117987307A,名称为《一株能缓解急性酒精性肝损伤的酸鱼乳杆菌及应用》提到现有的药物治疗虽然具有一定的抗炎抗氧化作用，但药物的摄入可能带来副作5用，甚至加重肝脏负担，因此，开发安全有效的解酒方法仍然是一个挑战；公开号为CN114426942A,名称为《一种重组乳酸乳球菌、微胶囊及其应用》提到现有的解酒产品虽然能够缩短饮酒后的恢复时间，但解酒速度仍然较慢，尤其是在大量饮酒后，现有的益生菌产品无法迅速分解酒精，导致醉酒时间较长。现有的益生菌解酒产品在缓解急性醉酒方面并未存在较为细致的相关研究，亟需开发一种更有效、实用的益生菌组合物。发明内容[0005]为解决上述技术问题，本发明提出了一种缓解急性醉酒的益生菌组合物及其制备方法和应用，益生菌组合组通过副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB和罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360组合，能够有效缓解急性[0006]为实现上述目的，本发明提供了一种缓解急性醉酒的益生菌组合物，所述益生菌组合物包括副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB和罗伊氏粘液乳杆菌所述副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB于2022年6月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360于2025年4月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为[0007]优选的，所述益生菌组合物中所述副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB和所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的质量比为1:1。[0008]优选的，所述副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacas×10⁸~4.5×10⁸CFU/mL,所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的有效活菌数为3×10⁸~4.1×10⁸CFU/mL。[0009]本发明还提供了所述益生菌组合物的制备方法，包括以下步骤：(1)副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB接种于MRS液体培养基中，(2)罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360接种于(3)步骤(1)所得副干酪乳杆菌发酵液，离心，得副干酪乳杆菌菌泥，副干酪乳杆菌菌泥采用生理盐水重悬，得副干酪乳杆菌菌悬液；(4)步骤(2)所得罗伊氏粘液乳杆菌发酵液，离心，得罗伊氏粘液乳杆菌菌泥，罗伊氏粘液乳杆菌菌泥采用生理盐水重悬，得罗伊氏粘液乳杆菌菌悬液；(5)步骤(3)所得副干酪乳杆菌菌悬液与步骤(4)所得罗伊氏粘液乳杆菌菌悬液按照质量比1:1混合，即得益生菌组合物。[0010]优选的，步骤(1)中所述副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB的接种量按照MRS液体培养基的体积的2~6%计算；步骤(1)中所述发酵的温度为37℃,发酵的时间6为8~16h。[0011]优选的，步骤(2)中所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360的接种量按照MRS液体培养基的体积的2~6%计算；步骤(2)中所述发酵的温度为37℃,发酵的时间为8~16h。[0012]优选的，步骤(3)中所述离心的温度为0~4℃,离心的转速为5000~7000rpm,离心的时间为4~6min;步骤(3)中所述副干酪乳杆菌菌悬液中有效活菌数为2×10⁸~4.5×10⁸CFU/[0013]优选的，步骤(4)中所述离心的温度为0~4℃,离心的转速为5000~7000rpm,离心的时间为4~6min;步骤(4)中所述罗伊氏粘液乳杆菌菌悬液中有效活菌数为3×10⁸~4.1×[0014]本发明还提供了所述益生菌组合物在制备快速解酒护肝产品中的应用。[0015]本发明还提供了所述制备方法制备所得益生菌组合物在制备快速解酒护肝产品中的应用。本发明首次使用罗伊氏粘液乳杆菌Care360Limosilactobacillusreuteri均具有高耐胃酸、耐胆盐的特性，能够在肠道中存活并产生大量乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶，从而有效分解酒精及其代谢产物乙醛，进而缓解急性醉酒带来的不适症状以及减少由此诱发的炎症的可能性。通过将高产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360和高耐胃酸、耐胆盐的副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB组合搭配，这一搭配具有缓解急性醉酒的作用，能够协同缓解急性醉酒和预防过度饮酒的带来的机体炎症等损伤。该菌搭配缓解急性醉酒更加贴合实际使用的场景，能够更加真实的反映其解酒的作用，进一步提高乳杆菌组合对急性醉酒的保护效果。附图说明[0017]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图2为罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360进化图3为不同菌株乙醇脱氢酶活力热图；图4为不同菌株乙醛脱氢酶活力热图；图5为不同菌株耐受乙醇的活菌数图；图6为不同菌株耐受乙醛的活菌数图；图7为不同处理组小鼠耐受乙醇时间图；图8为不同处理组小鼠血乙醇水平图；7图9为不同处理组小鼠血乙醛水平图；图10为不同处理组小鼠谷草转氨酶活力图；图11为不同处理组小鼠谷丙转氨酶活力图；图12为不同处理组小鼠肝脏乙醇脱氢酶活力图；图13为不同处理组小鼠肝脏乙醛脱氢酶活力图；图14为不同处理组小鼠肝脏还原型谷胱甘肽含量图；图15为不同处理组小鼠肝脏谷胱甘肽过氧化物酶活力图；图16为不同处理组小鼠肝脏丙二醛含量图；图17为不同处理组小鼠肝脏过氧化氢酶活力图；图18为不同处理组小鼠肝脏总抗氧化能力图；图19为不同处理组小鼠肝脏总超氧化物歧化酶活力图。具体实施方式[0019]现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。[0020]应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。[0021]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。[0022]在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。意指包含但不限于。副干酪乳杆菌STBLactobacillusparacaseiSTB(副干酪乳杆菌STB)和罗伊氏粘液乳杆菌Care360LimosilactobacillusreuteriCare360(罗伊氏粘液乳杆菌Care360)分类和种类鉴定。在分支结点为99%,说明STB与Lactobacillusparacasei亲缘关系很近。因此最终确定菌株STB为副干酪乳杆菌STB。TACGCCACCGGCTTCGGGTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCC8CGCGGCGTGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCAGCCTAATGGCTTTAAGAGATTAGCTTGACCTCGCGGTCTCGCAACTCGTTGTACCATCCATTGTAGCACGTGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGCAACTAAATGCTGGCAACTAGTCATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCACGACAACCATGCACCACCTGTCATTTTGCCCCCGAAGGGGAAACCTGATCTCTCAGGTGATCAAAACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAATGCTTAATGCGTTAGCTGCGGCACTCTCCAACACCTAGCATTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGGCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTTTCCCAGTTTCCGATGCGCTTCCTCGGTCTTTCACATCAGACTTAAAAAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTGGATACCGTCACGCCGACAACACGACCATTCTTCTCCAACAACAGAGTTTTACGACCCGAAAGCCTTCTTCACTCACGCGGCTGCGTCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTTTGGGCCGTGTCTCAGTTCAACCTCTCAGTTCGGCTACGTATCATCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTCATCCAAAAGCGATAGCTTACGCCATCTTTCAGCCAAGAACCATGCGGTTCTTGGATCTATGTTTCCAAATGTTATCCCCCACTTAAGGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCAATCTCGGTGCAAGCACCGATCATCAACGAGAACTCGTTCGAC20016处于同一进化分支，所在分支结点为100%,说明Care360与Limosilactobacillusreuterisubsp.reuteri亲缘关系很近。因此最终确定菌株Care360为罗伊氏粘液乳杆菌CCATAATGGTTAGGCCACCGACTTTGGGCGTTACAAACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCGTGTAGGCGAGTTGCACGAACTGAGAACGGCTTTAAGAGATTAGCTTACTCTCGCGAGCTTGCGACTCGTTGTACCGGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGCTAGAGTGCCCAACTTAATGCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTCCCCGAAGGGAACGCCTTATCTCTAAAGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGGGCGGAAACCCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATCTAAATGCTTTCGAGCCTCAGCGTCAGTTGCAGACCAGACAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATTTCCACCGCTACACATGGAGTTCCACTGTCCTCTTCTGCACTCAAGTCGCCCGGTTTCCGAAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACCTAAGCAACCGCCTGCGCTCGCTTTACGCCCAATAAATCCGGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTGGTTGGATACCGTTACTCTCACGCACGTTCTTCTCCAACAACAGAGCTTTACGAGCCGAAACCCTTCTTCACCATCAGGCTTGCGCCCATTGTGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTATGGACTTGTGGCCGATCAGTCTCTCAACTCGGCTATGCATCATCGCCTTGGTAAGCCGTTACCTTAC9[0029]实施例2一、高活力胞内乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的乳杆菌筛选。[0030]1、菌株来源。[0031]所使用的菌株均来自南京农业大学食品科技学院微生物实验室储备的菌种库。[0032]2、培养基的配制。[0033]所用的培养基为MRS液体培养基，成分如下：蛋白胨10.0g,葡萄糖20.0g,牛肉膏10.0g,酵母浸膏5.0g,无水醋酸钠5.0g,柠檬酸三铵2.0g,K₂HPO₄2.0g,MgSO₄·7H₂00.58g,MnSO₄·4H₂00.25g,吐温-801.0mL,蒸馏水1000.0mL,调节pH至6.8,121℃灭菌20min。次离心，弃上清收集菌体，称取菌体鲜重，加入生理盐水(质量浓度为0.85%的氯化钠水溶液)重悬菌体，冰浴中400W功率超声破碎30min,工作1s停止2s后镜检是否细胞破碎完全。8000rpm、4℃离心10min,收集上清液，即为粗酶液。放入4℃冰盒中暂存，尽快进行活性测定。按照乙醇脱氢酶(ADH)测试盒(品目号：A083-2-1,南京建成生物工程研究所)使用说明L混合液至96孔板，340nm处读吸光度A1,迅速将反应液置于37℃水浴锅中水浴10min后取出，340nm处读吸光度A2,计算△A=A2-A1,每组试验平行三次。其中A3为空白样品反应前的1,南京建成生物工程研究所)中提取液，冰浴中400W功率超声破碎30min,工作1s停止2s后冰盒中暂存，尽快进行活性测定。按照试剂盒使用说明配制工作液，并按要求加入待测样品。样品与工作液混合均匀后，取200μL至96孔板，340nm处读吸光度A1,37℃温浴5min,340nm处读吸光度A2,计算△A=A2-A1,每组三个平行。[0038]ALDH(U/g鲜重)=(322×△A)/W;[0039]二、体外耐乙醇和乙醛能力测试。[0040]将“一、高活力胞内乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的乳杆菌筛选”中筛选出的8株乳酸菌分别接入MRS液体培养基中，在37℃下培养，活化传代两次(将冷冻保存的乳杆菌按照体积比计算接种量为4%,接入MRS液体培养基中，37℃培养24h,取活化后的菌液按照积比计算接种量为4%,再次接入新的活化培养基中，37℃培养12h,得乳杆菌的二次活化发酵液),再以4%的接种量分别接入15%、10%、5%、0%乙醇浓度和100×(100mL中加入42μL0.4%乙醛溶液)、50×、10×、0×乙醛浓度的MRS液体培养基中，培养3h后，在无菌条件下取1mL活化后的样品加入到9mL0.85%无菌生理盐水中，稀释成10⁻¹浓度的稀释液，从稀释液中吸取1mL加入装有9mL0.85%无菌生理盐水的试管中稀释为10⁻²浓度的稀释液。如此依次稀释，得到10⁻³、10⁻⁴、10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷、10⁻8倍数的稀释液。选取10⁻⁵、10⁻⁶、10⁻⁷、10⁻⁸浓度的稀释液，各吸取0.2mL分别均匀涂布于MRS固体培养基平板中，于37℃培养箱中倒置培养48h,对各菌株的耐[0042]益生菌发酵：将二次活化(将冷冻保存的乳杆菌按照体积比计算接种量为4%,接入MRS液体培养基中，37℃培养24h,取活化后的菌液按照体积比计算接种量为4%,再次接入新的活化培养基中，37℃培养12h,得乳杆菌的二次活化发酵液)的副干酪乳杆菌STB和罗伊氏粘液乳杆菌Care360的活化液按照MRS液体培养基总体积的4%接种量，分别均接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下发酵12h,得到发酵液。[0044]组合物制备：将两种益生菌发酵液分别，4℃,6000rpm条件下离心5min,倒去上清，再用生理盐水混匀重悬菌泥在4℃,6000rpm条件下离心5min,重复2次，继而再用生理盐水混匀制备菌悬液，最后按体积1:1比例将两种益生菌混合(副干酪乳杆菌STB的有效活菌数为3.25×10CFU/mL,所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360的有效活菌数为3.55×10⁸CFU/mL)。[0045]四、乳杆菌搭配组合物动物体内的缓解急性醉酒效果验证。[0046]1)醉酒方案的确定：从超市购买的红星二锅头(清香型酒，56%vol)被选择用于小鼠醉酒实验。[0047]为建立安全稳定的急性醉酒模型，9周龄雄性BALB/c小鼠体重25±2g,随机分为3组(每组n=8),分别给予4mg/g的标准。简单地说，老鼠的背部被放在地上，腹部和四肢朝上。如果小鼠在30s内不能翻身，则认为其失去了正常的翻正反射。将翻正反射消失的时间点定义为醉酒点，将第一次饮酒到醉酒之间的时间点定义为酒精耐受时间。三组小鼠的酒精耐受时间均小于20min,为了排除个体差异的影响，我们定义1h内没有丧失翻正反射的小鼠被认为没有急性醉酒。考虑到;[0048]表1建立急性醉酒模型;对应二锅头体积小鼠数目888[0049]2)动物实验：取9周龄雄性BALB/c,小鼠体重25±2g,随机分为8种处理组(每种处理组n=8)随机均分为空白对照组、植物乳植杆菌STB9b菌液组、副干酪乳杆菌STB菌液组、罗伊氏粘液乳杆菌Care360菌液组、植物乳植杆菌STB9b菌液+副干酪乳杆菌STB菌液组、植物乳植杆菌STB9b菌+罗伊氏粘液乳杆菌Care360菌液组、副干酪乳杆菌STB菌+罗伊氏粘液乳杆菌Care360菌液组和植物乳植杆菌STB9b菌液+副干酪乳杆菌STB菌液组+罗伊氏粘液[0050]实验前禁食不禁水3h,最后再禁食禁水1h,空白对照组小鼠服用等量体积(0.01mL/gBW)生理盐水后2h再灌白酒；植物乳植杆菌9b菌液组小鼠灌胃服用菌数1×10⁹cfu/mL(0D₆0=1.0)的(0.01mL/gBW)生理盐水菌悬液后2h再灌白酒；副干酪乳杆菌STB11菌液组小鼠每次灌胃服用菌数1×10⁹cfu/mL(OD₆0=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理盐水菌悬液后2h再灌白酒；罗伊氏粘液乳杆菌Care360菌液组小鼠每次灌胃服用菌数1×10⁹cfu/mL(0D₆0=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理盐水菌悬液后2h再灌白酒；植物乳植杆菌9b菌液+副干酪乳杆菌STB菌液组小鼠每次灌胃服用菌数1×10⁹cfu/mL(0D60=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理盐水菌悬液后2h再灌白酒；植物乳植杆菌9b菌+罗伊氏粘液乳杆菌Care360菌液组小鼠每次灌胃服用菌数1×10⁹cfu/mL(OD600=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理盐水菌悬液后2h再灌白酒；副干酪乳杆菌STB+罗伊氏粘液乳杆菌Care360菌液组小鼠每次灌胃服用菌数1×10⁹cfu/mL(0D₆0=1.0)的(0.01mL/gBW)的生理盐水菌悬液后2h再灌白酒；植物乳植杆菌9b菌液+副干酪乳杆菌STB菌液组+罗伊氏粘液乳杆菌Care360菌液组小鼠每次灌胃服用菌数1×10⁹cfu/mL(OD600=1.0)的(0.01mL/gBW的生理盐水菌悬液后2h再灌白酒。[0052]观察小鼠活动情况，以小鼠后腹拖地、爬行不稳、闭眼懒动等为睡眠(醉酒)指标，[0053]对急性醉酒小鼠血液中乙醇、乙醛等浓度的影响：灌胃处理后2h,摘眼球取血，收集血液，将血液在室温下3000×g,离心15min,得到血清，利用乙醇含量检测试剂盒(品目号：BC6030,北京索莱宝科技有限公司)、乙醛含量测定试剂盒(品目号：BL1839B,兰杰柯科技有限公司)测定小鼠血清中乙醇、乙醛含量，使用相应谷草转氨酶(AST/GOT)测试盒(品目1,南京建成生物工程研究所)检测血清中谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)水平。[0054]对急性醉酒小鼠肝脏中乙醇脱氢酶(ADH)、乙醛脱氢酶(ALDH)等活力的影响：各组摘除眼球采血完成后，颈椎脱臼处死后，立即解剖，快速取出肝脏，用预冷生理盐水漂洗并用滤纸吸干，剪取少量肝脏以生理盐水为匀浆介质制备10%肝匀浆，3000×g离心15min取上清，根据ADH检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)、ALDH检测试剂盒(南京建胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总抗氧化能力(T-AOC)(抗氧化指标)等含量。[0056]1)体外实验中，如图3、图4、图5和图6所示，对乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活力较高的菌株进行筛选，得到8株相关酶活力较优异的乳杆菌。进而，继续测定上述8株乳杆菌的体外耐受乙醇和乙醛的能力，最后得出两株产乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活力较高且耐受乙醇和乙醛能力较强的乳杆菌。[0057]2)结合大多数人群实际日常生活中的饮酒场景，使用上述得到的两株菌和一株自身拥有较强耐酸、胃肠消化的菌株进行搭配组合，进一步探究其在小鼠醉酒的缓解效果。就最直观的数据而言，如图7所示，基于小鼠灌酒后到彻底醉酒的耐受时间来看，单独使用3株菌灌胃于小鼠发现植物乳植杆菌9b处理组的耐受时间最长，但菌株组合搭配灌胃小鼠，罗伊氏粘液乳杆菌Care360和副干酪乳杆菌STB搭配组合处理小鼠的耐受时间最长。下一步，在对小鼠灌胃处理2h后，通过眼球取血和解剖，对小鼠血清和肝脏的相关指标进行测定，对比完全未经处理、未灌酒的小鼠组和灌胃生理盐水后再灌酒组，如图8和图9所示，发现小鼠血清中乙醇和乙醛含量，也是大致符合耐受时间结果的趋势，单一菌株处理中植物乳植杆菌9b的含量相对更低，罗伊氏粘液乳杆菌Care360和副干酪乳杆菌STB搭配组合处理的含量相对最低；如图10和图11所示，同时小鼠血清中AST、ALT活力是反映小鼠肝脏受损程度的指标，也得到了大致类似的结果。此外，本实验也更加的检测了小鼠肝脏中的部分指标，如图12和图13所示，就最相关的肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶活力的结果而言，也是，单一菌株处理中植物乳植杆菌9b的含量相对更低，罗伊氏粘液乳杆菌Care360和副干酪乳杆菌搭配组合处理的含量相对最低，这可能是灌胃的乳杆菌自身的乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶对小鼠摄入的乙醇和乙醛降解，发挥代偿作用。明发现一种对缓解急性醉酒有着较优秀效果的罗伊氏粘液乳杆菌Care360和副干酪乳杆菌STB搭配组合，对应对人群中更加普遍的饮酒需求给出更加具有应用场景的实例和参考。[0059]动物实验结果表明，罗伊氏粘液乳杆菌Care360和副干酪乳杆菌STB搭配组合物对小鼠清醒至醉酒的时间相比与未服用益生菌的小鼠有着显著的延长。本发明罗伊氏粘液乳杆菌Care360和副干酪乳杆菌STB搭配组合菌选取《可用于食品的菌种名单》,因而不存在与市面上已有的解酒药物般的副作用。本发明益生菌组合物通过特定的益生菌菌株及其代谢损伤。本发明益生菌组合物具有显著的抗氧化和抗炎作用，能够减少由过度饮酒而引起的氧化应激和炎症反应。[0060]该乳杆菌在体外和体内实验中均表现出显著的降解乙醇和乙醛的能力或效果，其活性优于现有大多数乳杆菌。[0061]本发明所述罗伊氏粘液乳杆菌Care360和副干酪乳杆菌STB搭配组合物通过抑制ROS(活性氧)和促进抗氧化物酶的活力