CN120204242A 白桦脂酸28-O-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤炎症药物中的应用

(72)发明人许琼明刘艳丽廖敏张俊磊限公司32103A61K31/7024(2006.01)A61P29/00(2006.01)A61P25/00(2006.01)”9y本发明公开了白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷(简称BA-6)在制备防治皮肤炎症药物中的应用。针对现有治疗皮炎的药物存在疗效有限、起效缓慢、副作用多、长期使用风险高以及个体差异大、治疗费用昂贵、可能引起免疫反应等问题，本发明首次公开了BA-6在防治特应性皮炎、接触y皮肤瘙痒以及斑秃中的应用，具有明显改善皮肤红斑、丘疹、水肿、鳞屑、苔藓化、溃烂症状的技术进步。21.白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤炎症药物中的应用。2.白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤红斑和丘疹药物的应用。3.白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤瘙痒药物中的应用。4.白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备减少皮损、皮肤溃烂药物中的应用。5.白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备减少皮肤鳞屑及皮肤增厚药物中的应用。6.白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备降低皮肤苔藓化药物中的应用。7.根据权利要求1至6任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型包括丸剂、8.根据权利要求1至7任意一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括外用、口服、直肠或者肠胃外药物。9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，皮肤炎症包括特应性皮炎、接触性皮炎、湿平苔藓、毛发红糠疹、白癜风、结节性痒疹、系统性硬化症、褥疮、肉芽肿性皮肤病、皮肌炎、荨麻疹、慢性皮肤瘙痒或者斑秃。10.一种治疗皮肤炎症的药物组合物，其特征在于，以白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷为活性成分。3白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤炎症药物中的应用技术领域[0001]本发明属于天然产物的药理学领域，具体涉及白桦脂酸衍生物-白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷(BA-6)在制备治疗或预防皮肤炎症药物中的应用。背景技术[0002]炎症性皮肤病是一组由多种因素引起的皮肤炎症反应性疾病，其发病机制复杂，式(包括饮食习惯、吸烟、饮酒和睡眠等)。此外，皮肤受到外界环境中的病原体等刺激后也可能引发炎症反应。从现代医学角度把炎症性皮肤病主要分为5类：感染性炎症性皮肤病、免疫相关性炎症性皮肤病、过敏性炎症性皮肤病、非感染性炎症性皮肤病和其他炎症性皮痤疮等。这些疾病的临床表现各异，发病机制尚未完全明确，但目前已认识到它们具有共同的特点：炎症和免疫因素参与致病，包括由T细胞和抗原-抗体介导的皮肤炎症反应。炎症性皮肤病的药物治疗方法主要包括局部外用药物和系统治疗药物。局部外用药物包括糖皮质着对炎症性皮肤病发病机制的深入研究，生物制剂和小分子靶向药物等新型治疗手段不断[0003]特应性皮炎(AD)是一种复发性、慢性、非感染性炎症性皮肤病，AD通常表现为瘙人人群中有所不同，它通常在儿童期发展，并可能持续到成年期，据全球疾病负担研究表明，儿童的患病率为15%至20%,成人的患病率高达10%,使特应性皮炎成为第15位最常见的非致命性疾病，也是疾病负担最高的皮肤病，造成巨大的身体、心理和社会经济负担。遗传和环境因素之间的相互作用、皮肤屏障功能障碍、微生物失衡、免疫失调和皮肤炎症的环境触发因素在特应性皮炎的发病机制中发挥作用，炎症被认为是由表皮屏障的破坏和表皮炎树突状和先天性淋巴细胞的激活引发的，这些细胞吸引入侵的Th2细胞并与之相互作用。湿疹病变的直接机制是与Th2细胞失调相关的炎症，活化的T细胞将细胞因子释放到皮肤中，主要是白细胞介素4、白细胞介素13和白细胞介素31,它们激活下游Janus激酶(JAK)通路。细胞因子通过激活B细胞和浆细胞来促进炎症、瘙痒和抗原特异性IgE的产生。特应性皮炎中的瘙痒是基于角质形成细胞、肥大细胞和免疫细胞(T细胞和嗜酸性粒细胞)释放的瘙痒原与皮肤中小感觉神经纤维之间的信号传导。瘙痒原包括Th2细胞因子(尤其是白细胞介素4、-13和-31)、胸腺基质淋巴细胞生成素(一种上皮衍生的促炎细胞因子)、组胺、蛋白酶和神经肽。这些瘙痒原与表皮和真皮中感觉C神经纤维和Aδ神经纤维上的受体结合，这些受体感知瘙痒和疼痛。[0004]目前特应性皮炎的治疗方法是根据疾病的临床阶段(轻度、中度或重度)、受累体4表面积的范围、年龄、患者共存的疾病和服用的药物、瘙痒的严重程度、生活质量受损的程度以及患者的目标来选择。主要包括外用药物和内服药物。轻度特应性皮炎主要使用外用药物，包括糖皮质激素(TCS)、钙调磷酸酶抑制剂(TCI)、磷酸二酯酶4抑制剂(PDE-4抑制剂)、Janus激酶抑制剂(JAK抑制剂);糖皮质激素(TCS)作为一线治疗药物，可迅速控制病情，但不宜长期大面积使用，长期使用可能引起皮肤萎缩、屏障功能破坏等不良反应甚至出现激素依赖性皮炎；钙调磷酸酶抑制剂(TCI)以及磷酸二酯酶4抑制剂(PDE-4抑制剂)会使部分患者可能会出现局部灼痛、刺痛感或瘙痒加重等刺激反应，这些症状可能会影响患者的用药依从性。中、重度特应性皮炎需要联合使用药物，包括抗组胺药，免疫抑制剂如环孢素、硫唑嘌呤和甲氨蝶呤，系统应用糖皮质激素激素如泼尼松，生物制剂如度普利尤单抗、曲罗芦单抗。长期使用糖皮质激素会引起代谢紊乱并导致肥胖，部分患者会引起高血压，增加心血管疾病的风险等；第一代抗组胺药如苯海拉明、氯苯那敏等具有较强的中枢抑制作用，某些抗组胺药如阿司咪唑、特非那丁等可能引起心脏毒性；生物制剂通常价格较高，长期使用会给患者带来较大的经济负担，生物制剂通过调节免疫系统来控制炎症，但同时也可能增加感染的风险，部分患者可能出现过敏反应，如皮疹、瘙痒、呼吸困难等，严重时可危及生命；JAK抑制剂通过抑制JAK-STAT信号通路来调节免疫系统，但同时也可能增加感染的风险，尤其是上呼吸道感染、带状疱疹等，JAK抑制剂可能引起血常规异常。由于AD的发病机制尚未明确，目前药物治疗无法治愈，缺乏特效药，因此临床治疗更加注重控制病理病情发展和改善患者的生活质量，从综合应用效果看，目前临床上主要应用地塞米松治疗AD。发明内容[0005]针对现有治疗皮炎的药物存在疗效有限、起效缓慢、副作用多、长期使用风险高以及个体差异大、治疗费用昂贵、可能引起免疫反应等问题，本发明首次公开了白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷(又称白桦脂酸28-0-β-D-吡喃葡萄糖苷，简称BA-6)在防治皮炎中的应用，具有明显改善皮炎症状的技术进步。[0006]本发明采用如下技术方案。[0007]白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤炎症药物中的应用。[0008]白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤红斑和丘疹药物的应用。[0009]白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤瘙痒药物中的应用。[0010]白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备减少皮肤水肿、表皮增厚药物中的应用。[0011]白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备减少皮肤鳞屑药物中的应用。[0012]白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备降低皮肤苔藓化药物中的应用。[0013]白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷在制备防治皮肤溃烂药物中的应用。[0014]本发明中，皮肤炎症包括特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、甲沟炎、皮疹、银屑病、红SAPHO综合征、化脓性汗腺炎、神经性皮炎、药物引起的皮炎、扁平苔藓、毛发红糠疹、白癜风、结节性痒疹、系统性硬化症、褥疮、肉芽肿性皮肤病、皮肌炎、荨麻疹、慢性皮肤瘙痒或者斑秃；优选的，皮肤炎症包括特应性皮炎、接触性皮炎、湿疹、皮疹、银屑病、红斑狼疮、丘疹鳞屑性皮肤病、玫瑰糠疹、脂溢性皮炎、白癜风、痤疮和体藓等。本发明公开的白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷不仅可以治疗或预防皮炎及其引起的症状，而且具有低细胞毒性、安全可5靠的优点。[0015]本发明公开了一种治疗皮肤炎症的药物组合物，以白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷的一种或几种。[0016]具体的，常规药物辅料指一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，能够药用，有足够的纯度和低的毒性，而且药物组合物中各组份之间以及与本发明的活性成分之间相互掺和且不降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体，部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶[0018]本发明中，所述药物或者药物组合物包括外用、口服、直肠或者肠胃外药物。优选[0019]白桦脂酸(BA)是一种天然存在的五环三萜类化合物，存在于多种植物物种中，如毛莨科植物白头翁、桃金娘科赤楠、夹竹桃等，也可以选择其代谢前体白桦脂醇制备。BA及其衍生物(通过在C-3、C-20和C-28位点修饰合成)具有多种生物活性，包括抗癌、抗HIV、抗寄生虫和抗血管生成活性。特别是，据报道，BA对几种不同来源的肿瘤细胞系以及癌症动物模型具有细胞毒作用。虽然BA具有强大的抗HIV和抗肿瘤活性，但它被认为具有较弱的抗炎活性。据相关研究报道，在脂多糖(LPS)诱导的内毒素休克中，BA预处理后通过IL-10的机制表现出抗炎活性，但抗炎活性及保护作用均弱于地塞米松；BA衍生物BA5(化学结构名称为：3β-羟基-羽扇豆烷-20(29)-烯-28-酰基-吗啉)保护小鼠免受致命的LPS攻击并减少迟发型超敏反应中的水肿，但效果也弱于地塞米松。本发明设计并合成的白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷(BA-6)是BA的一种糖苷衍生物，其水溶性和生物利用度较BA显著提高，尤其是BA-6具有明显改善皮炎的作用，疗效显著优于地塞米松，出乎本领域技术人员预料。附图说明<0.01,###P<0.001;与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;与地塞米松组[0022]图3为白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷对DNCB诱导的皮炎小鼠背部皮肤的影响以及P<0.001;与模型组比较，*P<0.05,***P<0.001;与地塞米松组(DEX,3mg/kg)比较，P<[0023]图4为BA-6对DNCB诱导特应性皮炎小鼠耳朵皮肤的影响以及耳厚差、耳重差的统与正常对照组比较，###P<0.001;与模型组比较，***P<0.001;与地塞米松组(DEX,3mg/6[0024]图5为BA-6对DNCB诱导特应性皮炎小鼠脾脏指数影响的统计图；与正常对照组比[0025]图6为BA-6对DNCB诱导特应性皮炎小鼠血清中炎症因子IFN-γ、IL-6和IL-1β的影P<0.05,**P<0.01,***P<0.001;BA-6组与地塞米松组(DEX,3[0026]图7为BA-6对DNCB诱导特应性皮炎小鼠存活率的统计[0027]图8为BA-6及白桦脂酸(BA)对LPS引起炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α释放的ELISA实<0.001,***P<0.001;BA-6(10μM)组与白桦脂酸(BA,10μM)组比较，P<0.01,SP<[0028]图9为CCK-8细胞毒性实验；细胞存活率大于90%通常可以视为无毒或低毒性；A为白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷(BA-6)及白桦脂酸(BA)在50μM浓度对THP-1细胞诱导分化成M1型巨噬细胞的细胞毒性；B为白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷(BA-6)及白桦脂酸(BA)在50μ250、300μM浓度下对THP-1细胞诱导分化成M1型巨噬细胞的细胞毒性；D为白桦脂酸28-0-具体实施方式[0029]本发明公开的白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷(BA-6)不仅可以治疗或预防皮炎及其[0030]为了使本发明目的、技术方案更加清楚明白，下面结合附图，对本发明作进一步详细说明。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，数据分析为常规统计学分析方法；实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得，动物实验符合苏州大学相关要求。[0031]本发明中，白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖学结构分别如下：700OO…于CH₂Cl₂/H₂0(76ml/76ml)的混合溶液中，依次向其中加入n-Bu₄NBr(847mg,2.628mmol)、K₂CO₃(2.2g,16.421mmol),于室温条件下搅拌反应6h,再加入100ml二氯甲烷稀(4g,5.083mmol)溶0-β-D-葡萄糖苷(BA-6)2.5g,为白色固体，产率79%。NMR和MS数据如下：HNMR(400MHz,CD₃OD)δ5.49(1H,d,J=8.2HzH₁-29),4.60(brs,H₂-29),3.84(1H,dd,J=12.0,1.6Hz),3.7m),3.45-3.39(1H,m),3.39-3.36(2H,m),3.35(2H,m),3.12(1H,dd,J=811.1,5.0Hz),3.01(1H,m),2.33(2H,m),2.02-1.88(1H,m),1.70(3H,s),1.69-1.19(17H,m),1.16(1H,m),1.05(1H,m(3H,s),0.96(3H,s),0.94(3H,s),0.86(3H,s),0.75(3H,m).³cNMR(101MHz,(CD₃OD)δ176.1(C-28),151.8(C-20),110.3(C-29)1’),79.7(C-3),78.8(C-5’),7857.9,56.9,52.0,50.6,49.9,43.5,42.0,40.1,39.9,39.4,32.8,31.4,30.8,28.6,28.0,26.8,22.1,19.5,19.4,16.7,16.6,16.1,15.1.水：甘油=(70:28:2,体积比)的混合溶剂配制，浓度为1mg/mL,其它给药剂量则按比例配实验前2天，用剃毛机给小鼠背部剃毛，剃毛面积为3cm×3cm左右，再用脱毛膏去除背部表面绒毛。第1天，致敏阶段，除正常对照组外，下午2点其余各组小鼠背部均给予炎小鼠模型。模型成功建立的表现为在DNCB溶液的反复刺激下，小鼠背部皮肤出现红肿溃给药方式：给予地塞米松(DEX,3mg/kg)组的小鼠在每天(1-7天)下午4点给予小鼠背部和右耳内、外侧涂抹地塞米松乳膏；给予BA-6(2.5mg/kg)、BA-6(5mg/kg)、BA-6(10mg/kg)的小鼠在每天(1-7天)上午10点以及下午4点给予小鼠背部、右耳内、外侧涂抹含药[0035]正常对照组和模型组在上述给药组的同样时间内给予每只小鼠背部和右耳内、外侧分别涂抹等量的乙醇：水：甘油=(70:28:2)的混合溶剂，保持与给药组天测量每只小鼠左右耳厚度后处死小鼠，取脾脏和小鼠耳朵，计算脾脏指数和耳重、耳厚差(选用直径6mm打孔器打同一部位得耳圆片，称重);实验流程如图1所示。[0036]实施例2白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷对DNCB诱导特应性皮炎小鼠体重的影响每天对每组小鼠的体重变化进行统计分析并用graphprism8.3.0作图，如图2所示，正常对照组小鼠的体重稳定，而DNCB造模组小鼠从造模第3天开始体重急剧下降，造模第3-6天与正常对照组有显著性差异(P<0.01),符合DNCB诱导特应性皮炎小鼠症状。与模型组相比，BA-6(2.5mg/kg)给药组在第5天有显著性差异(P<0.05),地塞米松组均则没有显著性差异；与地塞米松组相比，BA-6(2.5mg/kg)给药组在第5天以及第8天有显著性差异(P9<0.05),BA-6(5mg/kg)、BA-6(10mg/kg)给药组在第8天有显著性差异(P<0.05)。因此，BA-[0037]实施例3:白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷对DNCB诱导特应性皮炎小鼠背部皮肤的病变面积大小和皮损严重程度及综合评分(EASI)的影响评分具体如下：以红斑、丘疹/水肿、鳞屑、苔藓化/结痂4项症状指标组项指标按其严重程度分为0~3分，其中无症状设为0分，轻度症状设为1分，中度症状设为2分，重度症状设为3分，对各指标进行评分后将所有分数加和视为总分，总分最高为12分。发现从造模第2天开始，DNCB小鼠背部皮肤开始出现红斑和丘疹，并伴有溃烂迹象，随着后续重复致敏以及耳朵激发，模型组小鼠背部皮肤出现明显红肿、结痂硬化及苔藓化病变，正常组小鼠背部皮肤始终处于光滑完整状态；与模型组相比，BA-6给药组小鼠背部皮肤在同一时期的皮肤损伤症状均减轻，皮肤未出现明显红肿和渗出，未见鳞屑，红斑、丘疹和皮肤硬化显著减少，第5天开始出现受损皮肤结痂脱落，生成新皮迹象，地塞米松给药组小鼠背部皮肤在第3天红肿症状有所减轻，但后期与模型组出现相似溃烂，硬化加剧、红肿增加等情况。与正常对照组相比，模型组小鼠背部EASI评分结学意义；与模型组相比，BA-6给药组小鼠背部EASI评分从第3天开始增长速度缓慢，均具有统计学意义(P<0.001),地塞米松组的小鼠背部EASI评分在第3天比模型组评分低(P<0.05),但在之后第5、7天与模型组无差异；与地塞米松组(DEX)相比，BA-6给药组小鼠背部鼠背部皮肤具有优于地塞米松的治疗作用。丘疹/水肿鳞屑无无无无0轻度轻度轻度轻度1中度中度中度中度2重度重度重度重度3[0040]实施例4:BA-6对DNCB诱导特应性皮炎小鼠耳朵皮肤的病变面积大小和皮损严重第8天对各组小鼠的左、右耳拍照，用游标卡尺分别测量各组小鼠左右耳厚度(测量时遵循在各耳的同一位置进行读数原则，尽可能减小误差),耳厚度差计算公式：耳厚差=右耳厚度—左耳厚度。第8天处死小鼠后取小鼠耳朵，将小鼠两只耳朵重叠，选用直径6mm打孔器打同一部位得耳圆片，分别对左右耳圆片进行称重。耳重差的计算公式：耳重量差=右耳重量—左耳重量。如图4所示，正常组小鼠右耳光滑，血管脉络清晰，无红肿结痂现象。与正常对照组相比，模型组小鼠右耳红肿结痂，模型组小鼠的耳厚、耳重差数值较大，与正常对照组的耳厚、耳重差结果存在统计学意义(P<0.001),表明模型组小鼠耳部水肿、增厚严重；与模型组相比，所有给药组小鼠的耳厚、耳重差均减小，具有统计学意义(P<0.001);其中与地塞米松组的耳厚相比，BA-6减轻小鼠耳重、降低耳厚差效果更为明显，并具有统计效优于地塞米松。[0041]实施例5:BA-6对DNCB诱导特应性皮炎小鼠脾指数DNCB诱导的皮肤炎症主要激活Th2细胞，还可能会激活全身免疫系统，导致脾脏内免疫细胞的增殖和活化，导致脾脏体积增大。如图5所示指数明显升高，具有统计学意义(P<0.001);与模型组相比，BA-6给药组脾脏指数有所降低，其中BA-6(5mg/kg)给药组与模型组脾脏指数相比存在统计学意义(P<0.01),地塞米松组脾脏指数其数值极低，甚至明显低于正常对照组且存在统计学意义(P<0.001);与地塞米松组脾脏指数相比，BA-6给药组脾脏指数也存在统计学意义(P<0.001)。这说明地塞米松对小鼠产生了免疫抑制，而BA-6对小鼠有免疫调节作用，无免疫抑制作用，提示药物对脾脏的病理状态或免疫功能产生了积极的调节作用，提高小鼠在受到应激、炎症等刺激时的免疫力。[0042]实施例6:BA-6对皮炎小鼠血清中炎症因子的影响第8天将全部小鼠眼球取血后颈椎脱臼法处死。全血于4℃自然沉降2h,4000rpm、4℃离心15min取上层血清，采用ELISA法按照试剂盒说明书的操作流程来检测血清中炎小鼠的血清中IFN-γ、IL-6和IL-1β显著增加；与模型组相比，给药组小鼠的血清中的炎症因子都降低；其中与地塞米松相比，BA-6(5mg/kg)给药组降低IL-6更为明显，并具有显皮炎小鼠。[0043]实施例7:BA-6对DNCB诱导特应性皮炎小鼠存活率和行每天对每组BABL/c小鼠的存活只数进行统计分析并用graphprism8.3.0作图。表明：地塞米松组出现过度免疫抑制作用加剧特应性皮炎小鼠死亡，而BA-6具有保护作用，抑制DNCB诱导急性特应性皮炎小鼠的死亡。模型组小鼠抓挠行为明显增多，而BA-6组和地塞米松组小鼠抓挠行为明显降低，尤其是BA-6各剂量组小鼠抓挠行为少于地塞米松组。[0044]实施例8:BA-6及白桦脂酸体外抗炎实验将THP-1细胞以5×10⁵个/孔的密度种于24孔板中，加入100ng/mL的佛波酯(phorbol-12-Myristate-13-Acetate,PMA)诱导THP-1细胞12h,多糖)造模前各组分别加入含有不同药物的溶液预处理细胞1h,1μg/mLLPS造模24h,取细胞上清液。采用ELISA法按照试剂盒说明书的操作流程来检测细胞上清中IL-1β、IL-6、细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α炎症因子的含量，效果明显优于白桦脂酸，提示该化合物具有抗炎活性。[0045]实施例9:白桦脂酸28-0-β-D-葡萄糖苷(BA-6)及白桦脂酸(BA)在THP-1细胞和RAW264.7细胞上的毒性实验11