CN120204406A 抑制或检测外泌体miR3150a5p表达试剂的应用以及鼻咽癌转移治疗药物和预后制剂

(19)国家知识产权局地址410083湖南省长沙市岳麓区麓山南(72)发明人杨力芳周琴屈春辉通合伙)43114专利代理师袁靖A61K45/00(2006.01)A61K31/7088(2006.01)A61P35/00(2006.01)抑制或检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用以及鼻咽癌转移治疗药物和预后制剂了一种抑制或检测外泌体miR-3150a-5p表达试本发明发现miR-3150a-5p在鼻咽癌转移患者血AUC曲线下面积为0.84,诊断灵敏度可达78%,特异度可达83%。证实miR-3150a-5p在鼻咽癌患者预后中具备良好的应用前景。另外，发现敲低miR-3150a-5p会显著抑制鼻咽癌细胞及其分泌的外泌体中miR-3150a-5p的表达量且能有效抑inhibitor靶向敲低miR-3150a-迁移侵袭21.抑制外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用，其特征在于，用于制备鼻咽癌治疗药物。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的抑制外泌体miR-3150a-5p表达试剂3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，miR-3150a-5pinhibitior序列为4.一种鼻咽癌转移治疗药物，其特征在于，包括抑制外泌体miR-3150a-5p表达的试剂。5.根据权利要求4所述的鼻咽癌转移治疗药物，其特征在于，所述的抑制外泌体miR-3150a-5p表达试剂包括miR-3150a-5pinhibitior。7.检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用，其特征在于，用于制备鼻咽癌转移预后8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的检测外泌体miR-3150a-5p表达的试9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的PCR检测试剂中的扩增引物序列：上10.一种鼻咽癌转移预后制剂，其特征在于，包括检测外泌体miR-3150a-5p表达的试3抑制或检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用以及鼻咽癌转移治疗药物和预后制剂技术领域[0001]本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，具体涉及抑制或检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用以及鼻咽癌转移治疗药物和预后制剂。背景技术[0002]鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma,NPC)发生于鼻咽粘膜上皮，是头颈部最为常[0003]世界卫生组织将NPC定义为三种类型：角化性、非角化性鳞状细胞癌和未分化或低分化癌。其中，非角化亚型鼻咽癌占流行地区肿瘤的95%以上。由于病变早期症状不明显，且NPC具有高度侵袭性和高转移潜能，70%以上的患者初诊即发现淋巴结转移，约20-30%的死亡率以及提高5年总生存率，但发生远处转移患者的治疗效果仍然不理想，远处转移仍是目前临床治疗失败的主要原因。[0004]外泌体是几乎所有哺乳动物细胞都会分泌的杯状双层膜小囊泡，在血液等体液内传播，可以通过直接与细胞外基质相互作用，直接被释放到生物体液中，将内容物传递至受体细胞中影响其生物功能。肿瘤外泌体携带来源于肿瘤细胞的生物学信息(蛋白、DNA和microRNA等),其内容物的浓度与肿瘤细胞的侵袭能力及肿瘤微环境相关，通过分析外泌体的表面标记或内部成分可以直接获得细胞的基本信息。由于外泌体有脂质膜保护，其内容物不易被降解破坏，使得无论新鲜的还是长期保存的样本皆可用于分析。miRNA存在于外泌体内容物中，可以通过外泌体的包裹从肿瘤细胞释放到体液中，不会受到核糖体酶的降解。更重要的是，外泌体可以从众多体液中获得(血液、尿液等),这使得外泌体检测在肿瘤诊疗[0005]因此，迫切需要开发新的可靠的非侵入性早期转移诊断预后标记物，促进鼻咽癌的早期精准干预和治疗，延长鼻咽癌患者的生存期。专利申请CN118086492A公开了miR-376a-5p在鼻咽癌患者血液中的表达水平显著高于健康人群，可作为鼻咽癌诊断的miRNA标志物以及治疗靶标。本发明不仅仅是开发了一种新的鼻咽癌诊断预后标记物miR-3150a-5p,且来源为外泌体，不同于该专利申请的血液来源的标记物。发明内容[0006]针对现有技术所存在的问题，本发明提供了抑制或检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用以及鼻咽癌转移治疗药物和预后制剂。本发明是通过外泌体miR-3150a-5p作为预测鼻咽癌转移风险的标志物，通过分析其表达量即可快速实现鼻咽癌的辅助预后检测。且miR-3150a-5p可作为治疗靶点，靶向抑制其表达可实现鼻咽癌患者的治疗，具有较广的应用前景。4[0007]本发明所述miR-3150a-5p的核苷酸序列为[0008]本发明的目的之一是提供抑制外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用，用于制备鼻咽癌治疗药物。[0009]进一步地，[0010]所述的抑制外泌体miR-3150a-5p表达试剂包括miR-3150a-5pinhibitior。[0011]更进一步地，[0012]miR-3150a-5p[0013]本发明的目的之二是提供一种鼻咽癌转移治疗药物，包括抑制外泌体miR-3150a-5p表达的试剂。[0014]进一步地，[0015]所述的抑制外泌体miR-3150a-5p表达试剂包括miR-3150a-5pinhibitior。[0016]更进一步地，[0017]miR-3150a-5p[0018]本发明的目的之三是提供检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂的应用，用于制备鼻咽癌转移预后制剂。通过检测外泌体miR-3150a-5p在鼻咽癌患者中的表达水平以辅助诊断和/或评估鼻咽癌早期转移风险。[0019]进一步地，[0020]所述的检测外泌体miR-3150a-5p表达的试剂，包括PCR检测试剂。[0021]更进一步地，[0022]所述的PCR检测试剂中的扩增引物序列：上游引物为[0023]优选地，所述检测样本为血清外泌体。[0024]本发明的目的之四是提供一种鼻咽癌转移预后制剂，包括检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂。[0025]所述的检测外泌体miR-3150a-5p表达试剂包括PCR检测试剂。[0026]更进一步地，[0027]所述的PCR检测试剂中的扩增引物序列：上游引物为下游引物为CAGTCTCAGGGTCCGAGGTATTC。[0028]优选地，所述检测样本为血清外泌体。[0029]本发明通过临床血清外泌体miRNA测序和TCGA数据库分析，发现miR-3150a-5p在鼻咽癌转移患者中的表达显著高于未转移患者，其可以作为预测鼻咽癌转移风险和不良预后的可靠标志物。[0030]本发明通过特异性扩增miR-3150a-5p的试剂盒和血清样本检测，实现鼻咽癌早期转移的快速辅助诊断，且经计算分析AUC曲线下面积达0.84,灵敏度78%,特异度83%。[0031]本发明设计了基于miR-3150a-5p的抑制剂序列靶向敲低该miRNA能够显著抑制鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭能力，表明其具有开发为治疗鼻咽癌药物的潜力。[0032]检测血清外泌体中miR-3150a-5p表达水平，用于鼻咽癌转移的辅助诊断和风险预测。基于该miRNA的引物设计、试剂盒开发及其在临床诊断中的具体应用。通过miR-3150a-55p的特异性抑制剂序列，抑制其表达以治疗鼻咽癌。包含使用miRNAinhibitor或其他载体(如核酸药物、生物活性片段)的药物开发和治疗应用。[0033]本发明可能的变更设计方向或者变形方案：[0035]可能会以miR-3150a-5p与其他miRNA的组合(如多标志物联合检测)取代单一miRNA的诊断功能，以提升灵敏度和特异度。[0036](二)样本来源改进[0037]本发明基于血清外泌体样本检测，可能的变形包括利用其他生物样本如唾液、尿[0038](三)替代抑制剂设计[0039]本发明利用miR-3150a-5pinhibitor序列抑制该miRNA,还可能设计小分子化合物、反义寡核苷酸(ASO)、siRNA等其他形式的miRNA抑制[0040]本发明有益效果[0041]本发明的优点如下：本发明发现miR-3150a-5p在鼻咽癌转移患者血清外泌体中的表达水平显著高于未转移患者，且经计算分析AUC曲线下面积为0.84,miR-3150a-5p的诊断灵敏度可达到78%,特异度可达83%。证实miR-3150a-5p基因在鼻咽癌患者诊断预后中具备良好的应用前景。另外，发现敲低miR-3150a-5p会显著抑制鼻咽癌细胞及其分泌的外泌体中miR-3150a-5p的表达量且能有效抑制鼻咽癌细胞转移等恶性进展。上述发现表明miR-3150a-5p对鼻咽癌的重要性，并提示采用miRNAinhibitor靶向敲低miR-3150a-5p进行鼻咽癌治疗的可行性。附图说明[0042]图1:5例高转移风险和5例低转移风险鼻咽癌患者血清外泌体中miRNA测序分析[0043]图1A:鼻咽癌患者血清样本外泌体中miRNA测序的散点图；图1B:鼻咽癌患者血清样本外泌体miRNA测序中最明显的8个上调和4个下调miRNA表达量的分析；图2A:TCGA数据库对头颈部肿瘤(HNSC)中候选外泌体miR-205-5p表达进行总体生存分析；图2B:TCGA数据库对头颈部肿瘤(HNSC)中候选外泌体miR-885-5p表达进行总体生存分析；图2C:TCGA数据库对头颈部肿瘤(HNSC)中候选外泌体miR-3150a-5p表达进行总体生存分析；[0046]图4:外泌体miR-3150a-5p区分转移鼻咽癌患者与未转移鼻咽癌患者的受试者工作特征(ROC曲线);[0047]图5:miR-3150a-5pinhibitor处理前后鼻咽癌细胞5-8F中miR-3150a-5p基因的表达；[0048]图6:miR-3150a-5pinhibitor处理前后鼻咽癌细胞5-8F增殖能力分析；[0049]图7:miR-3150a-5pinhibitor处理前后鼻咽癌细胞5-8F迁移及侵袭能力分析。6风险(初诊无转移，且根治性治疗后随访未出现转移及复发)鼻咽癌患者的初诊血清标本，主；分组依据有无远处转移，其中转移组需明确存在远处转移证据(如影像学或组织学诊断),非转移组需无远处转移；所有病例的基患者诊断为鼻咽癌，但尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的。干冰运载至Ribo差异，红色点表示在转移NPC患者血清中上临床病理病例性别TNM分期未转移病例1女未转移病例2女未转移病例3男未转移男未转移病例5男转移女肺转移病例7男结、骨转移病例8男肝转移男肺转移女利用TCGA(TheCancerGenomeAtlas)数据库对头颈部鳞癌(HNSC)患者样本进行7存时间和miRNA表达量作为分析指标。根据miRNA表达水平(高表达组与低表达组)进行分组，表达量的高低以中位数为分界。使用Kaplan-Meier生存分析方法对患者的总生存时间进行评估，生存曲线通过GraphPadPrism9.5软件绘制。[0058]进一步的生存分析显示，miR-205-5p和miR-885-5p高表达的患者其总生存时间较长，提示其高表达与较好的预后呈正相关；而miR-3150a-5p高表达的患者其总生存时间显步通过TCGA数据库进行miR-3150a-5p表达分析，发现miR-3150a-5p在头颈部鳞癌组织中的表达高于正常组织(P<0.05)(图3)。[0059]实施例3miR-3150a-5p基因在大规模鼻咽癌患者中诊断价值分析：[0061]另外收集59例高转移风险(初诊无转移，但在根治性治疗后出现远处转移)60例低转移风险(初诊无转移，且根治性治疗后随访未出现转移及复发)鼻咽癌患者的初诊血清标临床病理转移(%)未转移(%)总计性别男女肿瘤分期区域淋巴结分期[0064]将血清从冰箱中拿出，置于冰上解冻，加入1/3体积的RiboTM血清外泌体提取试剂，涡旋混匀；4°℃静置60min后，12000g于4℃离心20min,管底应有肉眼可见的黄白色沉淀，小心吸除全部上清液；向离心管中加入适量PBS溶液，混匀所得即为富含外泌体的溶液。收集的外泌体沉淀中加入内参cel-miR-39-3p,在超净工作台中加入1mL试剂盒中的总RNA提取试剂TRnaZolReagent,静置2min,吹打均匀后移至新的1.5mLEP管中，后续步骤相同；向上述溶液中加入1/5的RNAExtractionBuffer,剧烈振荡15s,显示液体8为均一的粉红色，室温静置5min,12000g于4℃离心20min,观察到最下层为粉红色有机相、中间层为白色物质，最上层为无色水相。将上层水相尽量都转移至新酶的EP管中；在得到的无色水相的EP管中，加入与无色水相等体积的异丙醇，上下颠倒混匀，室温静置15min,12000g于4°℃离心15min,小心吸弃上清，在管底可以观察到半透明状沉淀，即提取到的RNA;使用DEPC处理的无菌ddH₂0配制75%乙醇洗涤沉淀，加入与使用的TRnaZolReagent等体积的75%乙醇，8000g于4°℃离心5min。吸弃上清，室温10min晾干沉淀。加入20-50μL的RNase-FreeWater,充分溶解RNA,测浓度后将样品[0067](四)实时定量PCR[0068]通过Mir-XmiRNAFirst-StrandSynthesisKit(638315,TaKaRa)将从血清中提cDNA(10ng/μL),并根据制造商的使用说明在CFX96RealTimeSystem(Bio-Rad)实时定量PCR平台中进行。首先进行95℃10分钟预变性，接着进行循环反应，条件为1)95℃2秒，引物序列(5′-3')hsa-miR-3150a-5p-正向引物本实施例中对参与实验的所有受试者进行了随机分组，按7:3的比例将所有受试者分为训练队列和验证队列。并进行AUC曲线下面积计算其敏感度和特异度。结果如图4所为0.84,其诊断灵敏度可达到78%,特异度达83%。通过该实验数据分析进一步证实miR-3150a-5p在鼻咽癌患者早期转移诊断中具备良好的应用前景。[0071]实施例4抑制miR-3150a-5p的表达量对鼻咽癌改善情况分析：[0073]人高转移潜能鼻咽癌细胞5-8F在含10%FBS的RMPI-1640培养液中进行活化处理，37℃,5%CO₂条件下进行传代培养，备用。[0074](二)试验方法[0075](1)miR-3150a-5pinhibitor片段设计：在广州锐博公司合成siRNA序列，其中inhibitor序列为GCUGAGGAGAUCGUCGAGGUUG;阴性对照序列为CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA。[0076](2)细胞转染：实验组：向5-8F细胞转染miR-3150a-5pinhibitor,对照组转染ncinhibitor,转染根据转染试剂Lipo3000操作说明转染；转染48h后，收集细胞以及细胞培养上清液。9[0077](3)抑制效率验证：1)细胞水平：使用NcmSpinCell/TissueTotalRNAKit(M5101,NCMBiotech)提取细胞总RNA,具体分析方法可参见试剂盒说明书。2)外泌体水平：细胞外泌体提取：收集对数生长期细胞的培养上清，2000g于4℃离心15min,转移上清至新的离心管，加入1/4外泌体提取试剂(EXOTC10A-1,SBI),涡旋混匀。4℃静置4h后，13000rpm于4℃离心60min,除TotalRNAKit(M5101,NCMBiotech)提取外泌体总RNA,具体分析方法可参见试剂盒说明书。分别按照上述步骤提取细胞以及细胞培养上清液中外泌体的RNA,随后按照实施例3中实时定量PCR方法检测细胞以及细胞培养上清液中外泌体的miR-3150a-5p表达水平。[0078](4)细胞增殖能力分析：采用cck8细胞增殖试剂盒(CO005,Targetmol)分析转染inhibitor前后的5-8F的增殖能力。具体分析方法可参见试剂盒说明书。[0079](5)细胞侵袭与迁移实验：收集转染inhibitor48h后的实验组和对照组细胞，加入完全培养液重悬，细胞计数。在未铺和预铺基质胶的Transwell小室内加入200μL细胞悬液(含无血清培基RMPI-16