【《新型冠状病毒检测方法研究进展论文》5600字】

新型冠状病毒检测方法研究进展综述目录TOC\o"1-3"\h\u28864引言 1233921新冠病毒病原学检测 1256732新冠病毒核算检测 2226272.1全基因组测序技术 2215072.2聚合酶链式反应 330822.2.1实时荧光聚合酶链式反应（qRT-PCR） 328582.2.2数字聚合酶链式反应（DIG-PCR） 3246692.3等温扩增技术 4206022.3.1环介导等温扩增技术（LAMP） 4150243.3.2重组酶聚合酶恒温扩增（RPA） 4285083免疫检测 5201323.1血清学检测 5295273.2酶联免疫吸附试验（ELISA） 5200413.3胶体金免疫层析技术（GICA） 6287393.4化学发光免疫分析法（CLIA） 620704医学影像生物学检测 7摘要：SARS-CoV-2是一种具有高度传染性的新型冠状病毒，具有广泛的传染性。目前，我国已经出现了许多变体，这些变体有可能逃过现行疫苗的保护。回顾了国内外有关新型冠状病毒检测技术的文献，并从病毒学检测、核算检测、免疫检测、医学影响检测四个角度总结了目前主要检测方法的研究状况。关键词：新冠病毒；检测方法；研究进展引言新冠病毒于2019年12月在武汉暴发，随后迅速扩散到世界各地。截至2023年二月一日，全世界已有七亿五千三百万的新冠病毒确诊，以及六十一万四千人的死亡。目前，国内外的研究人员普遍认为，新型冠状病毒会持续很长一段时间。目前，新冠病毒的检测已经成为防疫工作中的一个重要内容，国内外的学者都在努力探索新冠病毒的检测技术，并取得了一定的成绩，为世界范围内的疫情防控作出了巨大的贡献。1新冠病毒病原学检测病原学的检测要求实验室条件苛刻，操作人员必须具备一定的技术水平，因此，在大规模爆发时，病毒培养、分离和鉴定是检验病原学的金标准。Liu等通过冷冻电子断层扫描获得SARS-CoV-2超微结构，发现在融合前后，病毒颗粒包膜上的峰构象明显增大，且呈长条形，这为SARS-CoV-2的识别及高通量序列分析奠定了基础[[]LIUC，MENDONAL，YANGY，etal.Thearchitectureofinactivatedsars-cov-2withpostfusionspikesrevealedbycryo-emandcryo-et-sciencedirect［J］.Structure，2020，28（11）：1218-1224.]。Zhu等首先从病人的支气管肺泡灌洗液样本上清中分离出这种病毒，4天后发现有明显的细胞变化，而非洲绿猴属的VeroE6和Huh-7型Huh-7型，则需要4~6天的时间才能发现特异的细胞变化[[]ZHUN，ZHANGD，WANGW，etal.Anovelcoronavirusfrom[]LIUC，MENDONAL，YANGY，etal.Thearchitectureofinactivatedsars-cov-2withpostfusionspikesrevealedbycryo-emandcryo-et-sciencedirect［J］.Structure，2020，28（11）：1218-1224.[]ZHUN，ZHANGD，WANGW，etal.AnovelcoronavirusfrompatientswithpneumoniainChina，2019［J］.NewEnglandJournalofMedicine，2020，382（8）：727-733.[]EYMIEUXS，ROUILLÉY，TERRIERO，etal.Ultrastructuralmodificationsinducedbysars-cov-2inverocells：akineticanalysisofviralfactoryformation，viralparticlemorphogenesisandvirionrelease［J］.CellularandMolecularLifeSciences，2021，78（7）：3565-3576.2新冠病毒核算检测以鼻咽拭子、口咽拭子、痰液、支气管肺泡灌洗液作为核酸检测的主要内容，对“早发现”、“早诊断”具有重要意义，是COVID-19临床无创性诊断的金标准。目前，SARS-CoV-2特异RNA的研究重点是：ORF1ab基因和N基因，有些产品以S、E、M基因的保守区作为检测指标。由于SARS-CoV-2是一种单股正链RNA病毒，因此它的RNA依赖RNA聚合酶基因的测试也逐渐进入了人们的视线，成为了检验结果可靠性的先决条件。2.1全基因组测序技术高通量测序技术是利用细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种病原体的基因组信息，对其进行无培养、无偏好的性病原检测。在COVID-19疫情爆发后，我国科研人员首次对SARS-CoV-2进行了测序，并将其全部基因序列信息共享[[]WUF，ZHAOS，YUB，etal.AnewcoronavirusassociatedwithhumanrespiratorydiseaseinChina［J］.Nature，2020，579（7798）：1-8][]WUF，ZHAOS，YUB，etal.AnewcoronavirusassociatedwithhumanrespiratorydiseaseinChina［J］.Nature，2020，579（7798）：1-8[]］LAMT，JIAN，ZHANGY，etal.Identifyingsars-cov-2-relatedcoronavirusesinmalayanpangolins［J］.Nature，2020，583（7815）：282-285.[]RENLL，WANGYM，WUZQ，etal.Identificationofanovelcoronaviruscausingseverepneumoniainhuman：adescriptivestudy［J］.ChineseMedicalJournal，2020，133（9）：1015-1024.2.2聚合酶链式反应2.2.1实时荧光聚合酶链式反应（qRT-PCR）qRT-PCR技术具有高度的特异性和敏感性，并且具有较低的检测费用，因此成为大规模的新型传染病检测的首选标准检测方法。在最优的情况下，检测的时间通常为3小时。qRT-PCR是以猝灭基团和荧光基团为基础，相对或绝对定量地测定PCR反应系统，但在检测过程中要非常小心，避免了交叉污染。《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》中明确规定，如果双靶标特异性的qRT-PCR检测结果为阳性，那么该患者就是COVID-19患者；如果只有一个目标的病人，在反复取样的时候，也是一个合格的病人。Corman研究小组在缺乏病毒分离和原病人样本的条件下，设计了SARS-CoV-2的RdRP、E、N基因的引物和探针，通过qRT-PCR技术获得E基因的最低检出限为3.2copies/反应，除了SARS-CoV以外，其它CoV和呼吸系统疾病均无交叉反应，因此，我们推荐将E基因作为初步的检测筛选线，RdRp基因探针能够特异性地捕获SARS-CoV-2，因此可以利用RdRp基因进行强化[[][]CORMANVM，LANDTO，KAISERM，etal.Detectionof2019novelcoronavirus（2019-ncov）byreal-timert-pcr［J］.Eurosurveillance，2020，25（3）：20000452.2.2数字聚合酶链式反应（DIG-PCR）美国研究人员VogelsteinB在1999年提出DIG-PCR，将样品稀释，分为几百个或几百万个单独的纳级反应池，每一个含有一份或更多份的模板，进行同步PCR扩增，并从不同的反应池中读出荧光信号，最后利用终点的定量和泊松分布的统计方法，可以获得产品的相关信息，是一种非常可靠的定量检测手段。中国计量科学研究所团队已成功研制出高灵敏度DIG-PCR技术，用于SARS-CoV-2病毒感染。程京院士的研究小组研制出了一种新型的微流控芯片，它可以在90分钟内，检测出6种常见的呼吸道病毒，比如流感病毒、肺炎支原体感染等。于祥春等人研制出一种能够一次通过一个小孔检测三个基因的新试剂[[][]于祥春，龚建，郑祖亮，等.用于新型冠状病毒核酸检测的数字PCR试剂盒：CN212955181U［P］.2021.2.3等温扩增技术由于它具有良好的易用性、特异性和敏感性，可以取代常规的常规PCR，因此它是COVID-19新的分子检测手段中的一种典型。不需要专家，只需要在社区医院、卫生站等小型诊所就能完成，而且很快就能做出报告，缩短诊断时间，有效遏制疫情的蔓延。目前已经有很多IAT技术已经通过了审核，并在护理中心得到了广泛的使用。IAT技术利用如环介导等温扩增技术中所使用的嗜热硬脂杆菌DNA聚合酶，具有较高的敏感性；用重组酶聚合酶恒温法扩增了枯草杆菌DNA的聚合酶；利用BsoBI和exo-Bca的耐热DNA聚合酶进行嗜热链代扩增技术[[][]蒋天伦.链置换扩增术（SDA）及其进展［J］.国际检验医学杂志，1999，020（5）：196-198.2.3.1环介导等温扩增技术（LAMP）LAMP是在2000年由NotomiT等人开发的一种核酸扩增技术，它是以单链环为基础，利用一系列的链式反应聚合酶和一系列引物，实现了对靶序列的高选择性放大。此方法可在60~65℃恒温1小时，可使靶基因放大109倍，可迅速鉴别新传染病的诊断，但需设计4~6个引物对，以确定6~8个靶区，而非特异性扩增则需人为地减少。云熙白等设计了N基因的LAMP引物，并将140个其它呼吸道疾病的病毒与14个SARS-CoV-2的样品进行了鉴定，识别的正确性达到98.70%。吕仁飞等为病毒的N,S,RdRP的引物设计了相应的引物，并与qRT-PCR技术的SARS-CoV-2临床阳性样品的检测结果相吻合。黄卫东等利用RT-LAMP技术，对COVID-19的ORF1ab、S、N基因进行了靶标，从而提高了对COVID-19病毒的特异性。LAMP等温扩增技术因其所涉及的多个引物和多个酶，其优化过程中常常要进行大量的优化和验证。LAMP技术中采用的DNA聚合酶法，对温度的变化很敏感，在65℃以上时，其灵敏度会发生不稳定，易产生假阳性，并且在实验室中很难去除[[][]梁瑞英，梁琳，贾亚雄，等.新型冠状病毒一步法可视化恒温快速检测方法的建立［J］.病毒学报，2020，36（6）：983-988.3.3.2重组酶聚合酶恒温扩增（RPA）RPA是英国科学家于2006年研发的一种核酸等温扩增技术，其规模远远超出了指数级的扩增。RPA的DNA和RNA都可以用作RPA的模板。相对于常规PCR,RPA的反应装置要求相对较低，其主要依靠能与引物结合的重组酶、单链DNA结合蛋白和链替换DNA聚合酶。该工艺无需采用高温、变温等工艺，反应温度为37~42℃，10-20分钟即可完成。在RPA反应系统的基础上，可以通过实时荧光定量、侧流层析试纸、数码晶片等多种手段对其进行检测。RPA技术的应用范围很广，如：登革热病毒，埃博拉病毒，非洲猪瘟病毒，诺如病毒，布鲁氏菌，结核杆菌，隐孢子虫，弓形虫等。Lau研究小组研制和优化了RPA反应系统，它与SYBRGreenI或侧流层析试验纸相结合，它的最小检出限为7.659copies/uL，并且与SARS-CoV等其它病毒没有交叉反应，临床样品的检测灵敏度可达98.7%。Choi等人通过RPA反应对N基因进行扩增，并以rkDNA-石墨烯体系为基础，设计一种能够与RPA扩增序列互补的rkDNA探针，实现了对RPA荧光信号的放大。RPA技术可以通过添加相应的引物、探头，一次对多个反应产物进行检测，从而达到多重RPA的目的。而引物和探针设计是相关技术发展的关键，设计的优劣直接影响扩增速度和灵敏度，目前还没有广泛应用于新的传染病检测方法。3免疫检测早期的核酸筛查是预防COVID-19传播的一种主要手段，而抗原抗体的免疫检测技术具有很高的特异性和敏感性，可以通过免疫检查来帮助确诊。根据病毒抗原和宿主抗体的检测，常用的检测方法有：血清学检测、ELISA、胶体金免疫色谱、化学发光免疫法等。3.1血清学检测当病毒侵入人体后，机体开始产生适应的免疫反应，已有研究显示，当人体第一次对SARS-CoV-2感染时，IgM、IgG、IgA抗体的阳性率都很低，发病后3天即可发现IgM,IgM和IgA抗体在发病后3天左右出现，IgG、IgA抗体从发病4天开始呈阴性，IgG抗体的效价是恢复期的4倍或更多。根据新冠诊断和治疗方案，由于抗体检测在COVID-19无症状感染者排毒期间（即窗口期）的作用，因此血清学检查是一种辅助诊断手段，不能替代核酸检测。3.2酶联免疫吸附试验（ELISA）ELISA的基本原理是将抗原或抗体包裹在酶标记反应板上，使被检测的抗原或抗体与酶标记反应板结合，在酶等催化物的催化作用下，形成肉眼可见的色彩或仪器所能读出的色彩。Zahra等人利用ELISA技术，对300例流感患者和100例COVID-19确诊病例进行了ELISA检测，结果表明ELISA法的特异性高于98%，灵敏度为90%，而与其它商业化ELISA相比，假阳性率为15%。刘万兵等采用N、S蛋白为实验材料，对214名COVID-19患者进行IgM/IgG抗体的检测，其中IgM/IgG抗体的阳性率在80~82%之间，均在发病后10天左右。ELISA技术是一种高度发展的免疫技术，其敏感性高、工作效率高、操作简单、对医务工作者的保护作用强，因而在SARS-CoV-2中使用ELISA试剂已经得到了广泛的应用，但其明显的缺陷在于无法达到早期诊断的目标。3.3胶体金免疫层析技术（GICA）胶体金是用柠檬酸钠等还原剂将氯金酸还原为不同直径的金粒子。在弱碱性条件下，能携带较强的负电荷，用光学显微镜观察到明亮的樱红色胶-金溶液，能与抗体结合，用作标记[[]孙莉，王军.胶体金免疫定性试剂质量评价和问题浅析［J］.首都食品与医药，2020，27（2）：182-184.]。呼吸疾病国家重点实验室采用胶体金间接免疫色谱技术，开发了一种IgM单抗体的快速检测方法，只需要一滴血液，15分钟内即可得到检测结果，而患者的血浆浓度在500~10000倍之间，仍然能保持阳性，能与核酸检测相互印证，帮助筛选防线向前推进[[]孙莉，王军.胶体金免疫定性试剂质量评价和问题浅析［J］.首都食品与医药，2020，27（2）：182-184.[]杨致亭，王传新，杜鲁涛，等.一种新型冠状病毒（2019-nCoV）IgM，IgG抗体检测试纸条，试剂盒及方法：CN111856003A［P］.2020.[]刘海森，宁波，蒋永青，等.一种新型冠状病毒IgG/IgM二联胶体金抗体检测卡：CN212321630U［P］.2021.3.4化学发光免疫分析法（CLIA）化学发光是一种在特定的化学反应过程中，通过吸收反应释放出的化学能，使其处于电子激励状态的中间物质或产品返回基态，从而形成一种光致发光。南开大学与多个研究小组合作开发了SARS-CoV-2IgM/IgG抗体的组合试剂，在15分钟内以聚合诱发荧光和胶体金技术为基础，对SARS-CoV-2IgM/IgG抗体进行了初步的临床试验，其抗体的阳性检出率达75%。MakotoHiki等收集临床症状轻、中、重症COVID-19病人的血清样品，用化学发光微粒免疫法测定各型COVID-19的水平。但这种抗体的敏感性受实验线性的限制，受不同个体的病毒抗原表达水平的影响，而且有一定的窗口期，COVID-19的病人在感染后，病毒核酸转阴，而在后续的随访中，则会出现假阴性。由于免疫检查中的内源和外部干扰因素，会造成样品的浓度变化，从而影响到反应的活性，所以需要综合流行病学史、临床表现和基本疾病等方面的综合考虑。4医学影像生物学检测COVID-19肺部组织的影像学检查，除了病原、核酸、免疫外，还可以作为一种无创的影像学手段。COVID-19肺组织的早期影像表现为多个小斑和间质的改变。随着病情的进展，发现双肺后区有两个肺泡浸润和浸润。肺部CT显示有多个斑点及玻璃质浑浊，严重时会发展为肺实变，其病理改变主要是肺膨胀，最后使肺组织失去功能，造成缺氧［2］。结合学科的创新，将人工智能技术与影像学相结合，不但可以减少人工阅读的工作量和主观效果，而且可以通过量化的方式，准确地定位病灶。参考文献[1]LIUC，MENDONAL，YANGY，etal.Thearchitectureofinactivatedsars-cov-2withpostfusionspikesrevealedbycryo-emandcryo-et-sciencedirect［J］.Structure，2020，28（11）：1218-1224.[2]ZHUN，ZHANGD，WANGW，etal.AnovelcoronavirusfrompatientswithpneumoniainChina，2019［J］.NewEnglandJournalofMedicine，2020，382（8）：727-733.[3]EYMIEUXS，ROUILLÉY，TERRIERO，etal.Ultrastructuralmodificationsinducedbysars-cov-2inverocells：akineticanalysisofviralfactoryformation，viralparticlemorphogenesisandvirionrelease［J］.CellularandMolecularLifeSciences，2021，78（7）：3565-3576.[4]WUF，ZHAOS，YUB，etal.AnewcoronavirusassociatedwithhumanrespiratorydiseaseinChina［J］.Nature，2020，579（7798）：1-8[5]］LAMT，JIAN，ZHANGY，etal.Identifyingsars-cov-2-re