磁性碳纳米管对甾体激素类药物雌二醇识别分析方法的建立与评价

论文题目：磁性碳纳米管对甾体激素类药物雌二醇识别分析方法的建立与评价摘要17β-雌二醇（estradiol，E2）属于甾体激素，是生物活性最强的一种天然雌激素，可以促进生物第二性征的发育，在调节生物体内分泌方面有着重要的生理作用。临床主要应用E2治疗妇科疾病，如补充雌激素不足或治疗转移性乳腺癌等。近年来有研究发现，雌激素类药物的生产中，会产生大量具有强烈生物活性的中间体及副产物。E2作为雌性激素类药物生产的母体化合物，会随工业废水一起排出进入环境，造成非常严重的环境激素污染问题，给生态带来严重甚至毁灭性的影响。研究表明，E2及相似活性的化学物质在水体环境中聚集，会以直接接触或食物链等途径进入动物和人的体内，对水生生物造成严重的危害，还会干扰人体血浆中激素的正常水平，对机体造成多方面的不良影响。目前已有E2传统检测方法主要有光谱分析法、质谱分析法和免疫分析法，但都存在一些着不可忽视的问题：光谱分析法不具备分离能力，易受到基质干扰；质谱分析法仪器昂贵，操作难度大；免疫分析法由于蛋白质类抗体稳定性差，分析过程易受干扰。因此，研究建立一种高灵敏度、高准确度且经济有效的17β-雌二醇-磁固相萃取-高效液相色谱（E2-MSPE-HPLC）分析监测方法，对保障生态环境稳定和人民生命健康具有重要的研究意义和应用价值。目的：制备一种对17β-雌二醇（E2）具有良好特异性识别能力的磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料，优化其制备条件，表征其化学结构，优化其对17β-雌二醇（E2）的吸附条件，评价其吸附性能，并进一步将该材料作为固相萃取吸附介质，优化萃取条件，建立17β-雌二醇-磁固相萃取-高效液相色谱（E2-MSPE-HPLC）检测方法。方法：采用了氨基修饰的磁性纳米粒修饰多壁碳纳米管，制备磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料，并优化其制备条件；采用了X-射线衍射（XRD）对所制备的磁性碳纳米管（MMWCNTs）进行结构表征；运用了高效液相色谱法（HPLC）测定该复合材料对17β-雌二醇（E2）的吸附容量，通过改变吸附溶剂pH，吸附溶剂含水量等条件选择出最佳吸附条件；设计了等温吸附实验和选择性吸附实验对磁性碳纳米管（MMWCNTs）的吸附性能进行考察。并希望经过进一步研究，以所制备的复合材料为固相萃取剂，优化萃取条件，建立17β-雌二醇-磁固相萃取-高效液相色谱（E2-MSPE-HPLC）分析监测方法，对制药工业废水中的17β-雌二醇进行富集、分离和分析。结果：成功制备得到了磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料，且结构表征正确，当羧基碳纳米管（MWCNTs-COOH）和氨基修饰的磁性纳米粒（Fe3O4-NH2）质量比为3:1时，所得复合材料吸附性能最佳；在pH=3，溶剂为乙腈：水=3:1（v/v）的条件下，复合材料对17β-雌二醇（E2）的吸附能力最强；在一定范围内，所制备的复合材料对E2的吸附容量随溶液中E2浓度的增加而增加，在E2浓度为130µg/mL时，达到饱和吸附量为16.14mg/g；所制备的磁性碳纳米管（MMWCNTs）对E2具有较好的选择吸附性。结论：用氨基修饰的磁性纳米粒修饰碳纳米管，成功制备了对17β-雌二醇（E2）具有良好吸附能力和选择性的磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料，并优化了其制备条件和吸附条件，为进一步研究建立17β-雌二醇-磁固相萃取-高效液相色谱（E2-MSPE-HPLC）检测方法，提供了前期实验研究基础，为制药工业废水中的17β-雌二醇的富集、纯化和分析提供了新的思路和方法。关键词：17β-雌二醇；碳纳米管；制药工业废水；磁性碳纳米管

绪论17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）属于甾体类雌激素，具有环戊烷并多氢菲母核结构，是体内生物活性最强，含量最多的一种天然雌激素，由卵巢内卵泡的颗粒细胞分泌，可以促进生物第二性征的发育，在调节生物体内分泌等方面有着重要的生理作用，临床主要应用17β-雌二醇治疗妇科疾病，如补充雌激素不足或治疗转移性乳腺癌等[1]。近年来经研究发现，有些内源性雌激素会通过人类的生产和生活活动进入环境，对水体环境和水生生物体内的正常分泌机制产生严重的不良影响，这类化学物质通常被称为环境激素（environmentalhormones），又称为内分泌干扰物或者环境荷尔蒙[2]。在众多的环境激素中，17β-雌二醇被认为是作用最强烈、最具潜在影响且在水环境中普遍存在的一种[3,4]，它主要通过人类和动物的排泄物进入环境，近年来随着制药工业的发展，作为雌激素药物生产的母核化合物，17β-雌二醇随工业废水进入环境也成为一个不可忽视的途径[5]。17β-雌二醇在水体环境中大量富集，会对水生生物的生命活动造成严重危害，影响其生殖系统形态与功能，并导致免疫缺陷，从而破坏神经-内分泌-免疫系统网络[6]。因此，研究建立一种高灵敏度、高准确度且经济有效的17β-雌二醇检测方法，对监测水体激素污染情况，保护水生生物，并进一步保障人民的生命健康和生态平衡具有重要的现实意义。固相萃取法（solidphaseextraction，SPE）是近年来迅速发展起来的常用的样品前处理技术，其通过吸附介质来富集复杂样品中的目标分析物，除去样品中基质和干扰物，再用洗脱液洗脱目标分析物，以达到富集、纯化和分离目标分析物的目的。目前多种新型的吸附介质，如多孔材料、分子印迹材料、碳纳米管、磁性纳米粒子等，已被逐步应用于固相萃取[7]。在这些新型的吸附介质中，磁性碳纳米管（magneticcarbonnanotubes，MCNTs）由于其吸附能力强、化学性质稳定、易于分离等优良物理和化学性质，受到广泛的关注和研究[8-10]。本章节主要针对17β-雌二醇的性质及其检测方法的研究进展、磁性碳纳米管的研究进展及应用和本课题的设计提出进行综述。17β-雌二醇的研究概况17β-雌二醇的结构与性质17β-雌二醇（17β-estradiol，E2）属于甾体类雌激素，分子式为C18H24O2，化学名为雌甾-1,3,5-(10)-三烯-3,17β-二醇，分子量为272，CAS号为50-28-2，具有环戊烷骈多氢菲母核结构，C3位上有酚羟基，C17位上有羟基且为β构型，化学结构式见图1-1。图1-117β-雌二醇的化学结构图本品为白色或叶片状或针状结晶，无臭，在空气中稳定，熔点为178-179℃，比旋度为+76°-+83°。E2为脂溶性药物，溶于二氧六环和丙酮，略溶于乙醇，不溶于水。E2具有紫外吸收，最大吸收大约在280.0nm波长处。17β-雌二醇的药理作用E2由卵巢内卵泡的颗粒细胞分泌，具有最强的雌激素作用，靶器官为子宫、阴道、输卵管和垂体。17β-雌二醇能促使第二性征的发育和性器官的最后形成，并保持第二性征外。能使子宫内膜发生一系列的变化，产生周期性月经。能增加子宫和输卵管的活动，并增加子宫肌对催产素的敏感性。除此之外，E2还能增加骨骼钙盐的沉积，加速骨骺闭合，大剂量时能升高血清中甘油三脂和磷脂，引起水钠潴留。较大剂量时E2还能作用下丘脑-垂体系统，抑制促性腺激素及催乳素的分泌，并能抵消雄激素的主要作用[1]。在临床应用中，E2为一种经皮肤吸收的雌激素治疗剂，主要用于治疗妇科疾病，如补充雌激素不足或治疗转移性乳腺癌等。17β-雌二醇的环境污染现状近年来经研究发现，有些内源性雌激素会通过人类的生产和生活活动进入环境，对水体环境和水生生物体内的正常分泌机制产生严重的不良影响，这类化学物质通常被称为环境激素（environmentalhormones），又称为内分泌干扰物或者环境荷尔蒙。在众多的环境激素中，E2被认为是作用最强烈、最具潜在影响且在水环境中普遍存在的一种，它主要通过人类和动物的排泄物进入环境，近年来随着制药工业的发展，作为雌激素药物生产的母核化合物，E2随工业废水进入环境也成为一个不可忽视的途径。有研究显示，水体中E2浓度达到1ng/L时，就会对生物体产生明显的影响；浓度大于1ng/L时，就会诱导雄鱼产生卵黄；浓度达到41ng/L时，就会表现雌激素活性，干扰人体正常的内分泌系统[11]。欧盟环保署于2011年出台的水环境质量标准中规定水体中E2不得超过0.5ng/L[12]，CaldwellD.J.等[13]于2012年提出水体中E2的预测无影响浓度（Predicted-No-Effect-Concentrations）为2ng/L，中国环境科学研究院的吴丰昌院士等[14]于2014年提出了中国水体中E2的预测无影响浓度为0.73ng/L。经文献调研发现，国内外大多数污水处理厂的出水中，E2的浓度水平都在0~几十ng/L之间（见表1-1）[15-21]，个别则超过100ng/L[21-23]。水体中超标的E2对水体环境和水生生物的正常内分泌造成了严重的危害，并进一步对生态平衡和人类的生命健康构成了巨大威胁。表1-1国内外污水处理厂出水E2水平国家E2浓度（ng/L）中国[15]0~20英国[16]2.7~48加拿大[17]0.2~14.7a挪威等[18]0.7~5.7日本[19]0.49~16.7美国[20]0~5.4b澳大利亚[21]0~30a.挪威、荷兰、瑞典、瑞士、芬兰、比利时、法国和德国的17个污水处理厂出水水样；b.采样率（n）为77个，平均值为9.9ng/L，90%以上的测量值在20ng/L以下，个别则高达160ng/L。17β-雌二醇检测方法E2作为一种作用最强烈、最具潜在影响且在水环境中普遍存在的环境激素，对水体造成了严重污染，对水生生物体内的正常内分泌机制存造成了不良影响，并进一步威胁着生态平衡和人类健康。因此，建立一种高灵敏度、高特异性、准确性高、成本低且快速有效的检测水体中17β-雌二醇的方法，对行业监管和保障人民的生命健康具有重要意义。目前，E2的检测方法主要有气相色谱法（GC）[24]、气相色谱-质谱联用法（GC-MS）[25]、高效液相色谱法（HPLC）[26]、液相色谱-质谱联用法（LC-MS）[27]、免疫分析法[28]等。免疫分析法具有灵敏度高、检测限低、检验快速等优点，但其应用成本高、定量不准确，易出现假阳性结果，影响实验的准确性，现大都仅应用于临床诊断，在环境科学领域极少采用；气相色谱、气质联用、高效液相色谱法、液质联用等色谱分析法具有分析时间短、准确度高、重现好等优点，是目前主要的E2检测方法，但在检测之前需要对样品进行前处理，当下主要应用的是传统的液-液萃取（liquid-liquidextraction）、固相萃取（solidphaseextraction，SPE）等方法[29]。在通常情况下，由于所分析的样品存在样品成分复杂、干扰物质多、目标分析物的浓度较低等多种因素，这些传统前处理方法往往因其选择性和识别性差，导致分析结果存在重复性差、专属性不强和准确度不高的问题，因此需要综合多种因素合理选择吸附介质，从而能高效、快速、便捷地从样本中富集得到目标分析物。目前多种新型的吸附介质，如多孔材料、分子印迹材料、碳纳米管、磁性纳米粒子等，已被逐步应用于固相萃取。在这些新型的吸附介质中，磁性碳纳米管（magneticcarbonnanotubes，MCNTs）由于其吸附能力强、化学性质稳定、易于分离等多种优良特性，受到广泛的关注和研究。碳纳米管的研究概况碳纳米管概述于1991年问世的碳纳米管(carbonnanotubes，CNTs)是一种由单层或多层碳六元环结构环绕其共同的中心线，指向一定的螺旋角卷曲形成的纳米级、无缝、中空管状结构的纳米材料，其长度和直径比通常超过1000，两端的影响可以忽略，被认为是典型的一维物质。CNTs每层碳管壁上的每个碳原子通过sp2杂化与周围3个碳原子发生完全键合构成碳六元环平面网状结构，而这些网状结构在形成过程中会存在一些缺陷，从而形成空间拓扑结构。[30,31]图1-2碳纳米管结构示意图根据CNTs的管壁层数，可以将其分为两种类型，分别是单壁碳纳米管(single-walledcarbonnanotubes，SWCNTs)和多壁碳纳米管(multi-walledcarbonnanotubes，MWCNTs)。SWCNTs呈现出直径小、管体窄等特征，具有较好的一致性和均一性；MWCNTs则具有形状不规则、多变等特征，能提供更多活化位点，更易于进行不同的化学基团修饰，从而发挥不同的功能[32]。由于CNTs具有比表面积大、机械强度高、耐高温、耐酸碱能力强、化学性质稳定等优良的物理和化学特性，已被报道作为固相萃取（SPE）的吸附介质，对多种无机和有机化合物均有着卓越的富集能力[33,34]。碳纳米管的表面预处理方法虽然CNTs具有诸多优点，并已在多个领域得到广泛的应用，但其也存在着明显的缺点，比如在溶液中溶解性差、分散性差、易聚集成束、表面活化能太高等，这些缺点使其较难被修饰改造而满足不同领域的需求，因此对碳纳米管进行修饰之前，需要对CNTs表面进行预处理。已报道的CNTs表面预处理方法主要有三种：强酸氧化法、表面组装技术和表面接枝反应等。1）强酸氧化法强酸氧化法作为传统的CNTs表面处理方法，是目前最为有效，也最为常用的预处理方法，其过程为：利用强氧化性酸（如浓硫酸和浓硝酸混合酸液）的强氧化作用打开CNTs的端口，将其截断为大量短管，然后运用相应化学方法在CNTs短管的端口和侧壁的缺陷位点引入羟基、羰基和羧基等亲水基团，以增强CNTs在溶液中的分散能力[35]。已有贾宝平[36]、Chin[37]、陈久岭[38]等人对此方法进行了研究报道。2）表面组装技术表面组装技术的原理是非共价键结合，其通过氢键作用、疏水作用、静电作用、范德华力作用等分子间非共价键作用力，将CNTs与两亲性物质的疏水区域结合，再通过两亲性物质的亲水区域增加CNTs在水或其他极性溶剂中的分散能力。已有Cheng[39]、Matarredona[40]、Chambers[41]等对此方法进行了研究报道。3）表面接枝反应表面接枝反应是在强酸氧化法的基础上对CNTs的进一步修饰，其首先通过强酸氧化法在CNTs表面引入羟基、羰基和羧基等亲水基团，然后进一步通过这些引入的基团接枝功能化的聚合物，以便进行更多不同的修饰，从而使CNTs具备不同特性。已有Kumar[42]、高超[43]等人对此方法进行了研究报道。磁性碳纳米管的制备方法碳纳米管（CNTs）和磁性纳米粒子复合制成的磁性碳纳米管（MCNTs）将碳纳米管和磁性纳米材料的优势有机结合，具有优良的物理和化学性质。磁性碳纳米管的制备主要有两种类型，分别是管内填充和表面包覆。其中，CNTs管内填充磁性纳米粒子的研究报道较少，其原理是通过一定的技术手段，如毛细管吸附法[44]和化学气相沉积法[45]等，将磁性纳米粒子填充到碳纳米管的管腔中，从而使CNTs具备磁性。较为常见的是在CNTs的表面包覆磁性碳纳米粒子，应用的技术主要有化学共沉淀法、自组装法和溶剂热法。1）化学共沉淀法化学共沉淀法是目前最为常用的制备表面包覆型MCNTs的方法，其过程为：将Fe2＋和Fe3＋按摩尔比1:2的比例加入分散有经表面预处理的CNTs的水溶液，以氨水或氢氧化钠溶液作为沉淀剂，发生反应2Fe3++Fe2++8OH-→Fe4O3+4H2O，使Fe4O3纳米粒子在CNTs表面成核生长，从而完成MCNTs的制备。此方法具有磁性纳米粒分散均匀、粒径小等优点，已有Chen[46]等人进行了研究报道。2）自组装法自组装法的原理是通过非共价键作用将制备的磁性纳米粒与经表面预处理的CNTs进行结合，实现磁性纳米粒在CNTs表面的包覆。这种方法操作较为复杂，且产生的非共价键作用难以控制，已有研究报道较少。3）溶剂热法溶剂热法是一种通常在高温高压的密闭条件下进行的反应，运用溶剂热法制备MCNTs的过程为：将铁源加入分散有经表面预处理的CNTs的溶液中，在一定温度和压强下进行反应，使Fe4O3纳米粒子在CNTs表面成核生长，从而完成MCNTs的制备。已有王旭珍[47]、Liu[48]等人对此方法进行了研究报道。磁性固相萃取的研究概述在研究和应用中，传统固相萃取（SPE）技术中的吸附介质往往存在固液分离困难、目标分析物分离方法复杂等缺点，为样品的前处理造成了诸多麻烦，随着1999年Šafařı́Ková等[49]首次提出磁固相萃取（magneticsolidphaseextraction，MSPE）的概念，这些问题得到了有效的解决。MSPE技术的优势十分明显，只需外加一定强度的磁场便可实现复杂体系中的固液分离，快速、便捷地获得目标分析物，且十分绿色、经济。MSPE的操作流程为：将磁性吸附介质加入含目标分析物的样品中，待目标分析物被充分吸附富集，在外加磁场下实现固液分离，再用有机溶剂洗脱目标分析物，即可用于下游检测。显而易见，MSPE技术的核心是磁性吸附介质的选择，已有报道的磁性吸附介质有磁性硅基材料、磁性胶束、磁性碳材料、磁性分析印迹材料、磁性纳米材料等[50]。在这些新型的磁性吸附介质中，磁性碳纳米管（magneticcarbonnanotubes，MCNTs）将碳纳米管和磁性吸附介质的优点进行了有机结合，其较大的比表面积、稳定的物理和化学性质、π-π键相互作用和中空结构，使其能稳定高效地吸附多种无机和有机化合物，且其磁性可实现快速、高效的固液分离，目前已在医学、化工、食品工业、农业、环境保护等多个领域进行了研究和应用[51]。课题的提出17β-雌二醇（E2）作为一种甾体类雌激素，是生物活性最强，体内含量最多的一种天然雌激素，可以促进生物第二性征的发育，在调节生物体内分泌等方面有着重要的生理作用。而同时，E2也作为一种作用最强烈、最具潜在影响且在水环境中普遍存在的环境激素，对水体造成了严重污染，对水生生物体内的正常内分泌机制存造成了不良影响，并进一步威胁着生态平衡和人类健康。目前最常用的E2检测方法主要有气相色谱法、气相色谱-质谱联用法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法，这些方法均需要对待测样品进行前处理，现采用的样品前处理方法往往存在吸附容量低、特异性差、固液分离困难、成本较高等问题，严重影响了分析的准确性、专属性、时效性和经济环保性。因此，研究建立一种高灵敏度、高准确度且经济有效的E2检测方法，对监测水体激素污染情况，保护水生生物，并进一步保障人民的生命健康和生态平衡具有重要的现实意义。多壁碳纳米管（MWCNTs）作为一种新型纳米复合材料，有着较高的比表面积，化学惰性和生物相容性，具有较多的孔隙结构，良好的孔道稳定性，较高反应活性，疏水亲脂等特性，因此，MWCNTs比活性炭、分子聚合物、石墨粉等物质具有更高的吸附容量和重复利用性。磁性固相萃取（MSPE）技术的提出，有效解决了传统固相萃取中存在的固液分离困难、目标分析物分离方法复杂的难题，使分离操作更为快速、便捷、高效且经济环保。将多壁碳纳米管和磁性吸附介质的优势有机结合，可以为样品的前处理工作提供新的方法和思路，对复杂样品中目标分析物的分离分析具有重要意义。本课题拟针对目前工业废水中17β-雌二醇（E2）的分离分析方法的问题，以羧基修饰的多壁碳纳米管为原料，采用化学沉淀法，将制备的氨基修饰的磁性纳米粒与其进行复合，最终制备得到磁性多壁碳纳米管（magneticmulti-walledcarbonnanotubes，MMWCNTs），并采用X-射线衍射法（XRD）对其进行结构表征。结合高效液相色谱法（HPLC），以MMWCNTs为吸附介质，探究优化MMWCNTs的制备条件和吸附条件，以及对MMWCNTs的E2吸附性能和选择性进行考察。并希望经过进一步研究，运用磁性固相萃取技术（MSPE），以所制备的复合材料为固相萃取剂，优化萃取条件，建立一种高灵敏度、高准确度且经济有效的17β-雌二醇-磁固相萃取-高效液相色谱（E2-MSPE-HPLC）分析监测方法，实现对制药工业废水中的17β-雌二醇进行富集、分离和分析。

磁性碳纳米管的制备及表征17β-雌二醇（estradiol，E2）属于甾体激素，是生物活性最强的一种人类雌激素，可以促进生物第二性征的发育，在调节生物体内分泌方面有着重要的生理作用。然而E2在水体环境中的大量富集，会对水生生物的生命活动造成严重危害，影响其生殖系统形态与功能，并导致免疫缺陷，从而破坏神经-内分泌-免疫系统网络，进一步威胁着人类的生命健康和生态平衡。因此，建立一种高灵敏度、高准确度且经济有效的E2检测方法，对监测水体激素污染情况，保护水生生物，并进一步保障人民的生命健康和生态平衡具有重要的现实意义。本章将介绍我们以实验制备的羧基修饰的多壁碳纳米管（MWCNTs-COOH）和氨基修饰的磁性纳米粒（Fe3O4-NH2）为原料，反应制备得到了磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料；同时采用高效液相色谱（HPLC）技术，以吸附容量（Q）为考察指标，结合实际情况，对MMWCNTs的制备条件进行了优化；此外，运用X-射线衍射（XRD）对其结构进行了表征。实验部分试剂与材料实验所用试剂与材料如表2-1所示：表2-1试剂与材料试剂名称化学式纯度生产厂家羧基碳纳米管MWCNTs-COOH≥95％北京德科岛金公司17β-雌二醇C18H24O2≥99％北京百灵威科技有限公司N-(3-二甲氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC≥99%北京百灵威科技有限公司N-羟基磺酰基琥珀酰亚胺钠盐NHS≥98%北京百灵威科技有限公司1,6-己二胺HDM≥99%青岛德邦化工有限公司乙二醇甲醇CH3OH分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司乙腈CH3CN分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司无水乙醇CH3CH2OH分析纯天津市富宇精细化工有限公司乙腈CH3CN色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司甲醇CH3OH色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司蒸馏水H2O/实验室自制去离子水H2O/实验室自制三氯化铁FeCl3•6H2O分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司实验仪器实验所用仪器如表2-2所示：表2-2实验仪器仪器/设备名称型号生产厂家电子天平AUY220日本SHIMADZU公司电子天平EX125DZH奥豪斯仪器（常州）有限公司高效液相色谱仪LC-2010AHTSHIMADZU数显pH计FE20/EL20德国梅特勒-托利多集团定时电动搅拌器JJ-1江苏省金坛市正基仪器有限公司恒温振荡器SHA-C常州智博瑞仪器制造有限公司数控超声波清洗器SB-5200DT宁波新艺生物科技股份有限公司电热恒温鼓风干燥烘箱101-2AB天津市泰斯特仪器有限公司X-射线衍射测量仪D8ADVANCEBruker，德国集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S河南省予华仪器有限公司真空干燥箱DZ-3BCII天津市泰斯特仪器有限公司氨基修饰的磁性纳米粒的制备称取FeCl3·6H2O1.0g，加入乙二醇20mL，超声分散5min使其溶解。加入HDM6.0g，置于50℃恒温水浴中溶解。加入NaAc3.5g搅拌溶解后，置于磁力搅拌器中，室温反应1h，得均一黄色溶液。将反应体系转移至反应釜中，置于真空箱中，在200℃条件下反应8h，得黑色反应产物。取出该产物静置30min，磁性分离。将分离所得产物分别用去离子水和无水乙醇洗涤三次后，置于恒温鼓风干燥箱中干燥12h，得到目标产物Fe3O4-NH2。磁性碳纳米管的制备称取MWCNTs-COOH150mg，加入蒸馏水150ml，超声处理1h使其分散，得到悬浮液。将EDC1.5g和NHS1.2g加入到上述悬浮液中，置于25℃水浴中高功率搅拌30min，使羧基活化。然后加入Fe3O4-NH2150mg，超声处理30min。最后于50℃下大功率搅拌60min，泠却至室温，加外部磁场分离。去离子水洗涤三次，60℃真空干燥12h，即得到目标产物MMWCNTs。吸附实验1）溶液的配制称取E2约2.5mg，加入乙腈7.5ml溶解后，移入25mL量瓶中，用磷酸盐缓冲液（pH=7)稀释至刻度，配制成浓度为100µg/mLE2-乙腈/PB溶液。2）吸附与测定在E2的初始浓度为100μg/mL，吸附溶剂为乙腈-水=3-7（v/v），pH=7的条件下，向10mL锥形瓶中加入MMWCNTs5mg，E2溶液5mL，置于25℃恒温振荡箱中，在120r/min条件下振荡一定时间，吸取上清液经0.45μm微孔滤膜滤过，进行HPLC分析。实验同时进行三组平行对照，一组空白对照，经公式（2-1）计算ce，取平均值作为剩余E2的浓度。通过E2初始浓度和剩余浓度的比较，考察所制备的MMWCNTs的吸附性能。以吸附量（Q）为评价指标，计算公式如（2-1）和（2-2）所示。A0AQ=c0式中：c0—吸附前溶液中E2的浓度（µg/mL）；ce—吸附后溶液中E2的平衡浓度（µg/mL）；V—E2溶液的体积（mL）；W—MMWCNTs的质量（mg）；Q—吸附介质对溶质分子的吸附量（mg/g）。合成条件的优化为了优化MMWCNTs的吸附容量，使磁性纳米粒对碳纳米管得到最好的修饰效果，依据2.1.4中MMWCNTs的制备方法，控制MWCNTs-COOH和Fe3O4-NH2的质量比例进行实验，配制m（MWCNTs-COOH）：m（Fe3O4-NH2）分别为1:2，1:1，2:1，3:1，4:1，比较其吸附效果。实验试剂用量如下：表2-3MMWCNTs合成条件MWCNTs-COOH：Fe3O4-NH2去离子水/mLEDC/mgNHS/mgFe3O4-NH2/mgMWCNTs-COOH/mg1:22550040050251:1150150012001501502:1150750600751503:1150500400501504:115037530037.5150结构表征本次实验采取X-射线衍射（XRD）技术对所合成的磁性碳纳米管（MMWCNTs）进行结构表征，选取XRD-6100X射线衍射分析仪，测试条件为Cu靶，扫描范围确定20-80°，扫描速度为2°/min。实验过程为：取适量实验制备的磁性碳纳米管（MMWCNTs）样品至铝制样品槽中，用厚玻璃片进行压实后放入仪器中测量，扫描时长为30min。结果与讨论本实验以MWNTs-COOH为原材料，在蛋白偶联剂的作用下形成活泼酯中间体，与制备的Fe3O4-NH2发生成酰胺反应，制备出对E2具有良好吸附能力的磁性碳纳米管复合材料（MMWCNTs）。同时考察了反应中MWNTs-COOH和Fe3O4-NH2的质量比对MMWCNTs的吸附性能的影响，此外运用X射线衍射（XRD）对所制备的复合材料进行了结构表征。合成条件的优化结果吸附实验结果如图，结果表明，MMWCNTs的吸附容量随MWCNTs与Fe3O4-NH2质量比的增大而增大。当m（MWCNTs-COOH）：m（Fe3O4-NH2）大于3:1时合成的吸附介质磁性太弱不利于分离，因此本实验取m（MWCNTs-COOH）：m（Fe3O4-NH2）=3:1为最佳合成比例。图2-1MWCNTs-COOH与Fe3O4-NH2的质量比对MMWCNTs吸附容量的影响合成条件的优化结果X-射线衍射（XRD）扫描结果如图2-2所示。图2-2MWCNTs-COOH（a），Fe3O4-NH2（b）和MMWCNTs（c）的XRD图图中25.88°处的衍射峰是MWNTs-COOH上典型的石墨结构（002）晶面，29.92°、35.32°、42.92°、53.44°、56.80°、62.56°处的衍射峰分别归属于四氧化三铁磁性纳米颗（220）、（311）、（400）、（422）、（511）、（440）晶面的特征衍射峰。与图1-6a和b相比，图1-6c中同时出现了四氧化三铁磁性纳米粒的六个特征衍射峰和羧基碳纳米管上典型的石墨结构（002）晶面，这从侧面说明了磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料制备成功。

磁性碳纳米管对17β-雌二醇的吸附在前面的章节中，我们以MWCNTs-COOH和自行制备的Fe3O4-NH2为原料，成功制备了磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料，并对其制备条件进行了优化，最终将m（MWCNTs-COOH）：m（Fe3O4-NH2）=3:1定为制备MMWCNTs的最佳投料比。紧接着，我们采取X-射线衍射（XRD）技术对所合成的磁性碳纳米管（MMWCNTs）进行结构表征，结果显示所得复合材料结构正确。本章将介绍我们利用高效液相色谱（HPLC），通过研究pH值，吸附溶剂含水量对磁性碳纳米管（MMWCNTs）吸附17β-雌二醇（E2）性能的影响，选择出最佳吸附条件，为制药工业废水中E2的检测提供理论依据。实验部分试剂与材料实验所用试剂与材料如表3-1所示：表3-1试剂与材料试剂名称化学式纯度生产厂家17β-雌二醇C18H24O2≥99％北京百灵威科技有限公司甲醇CH3OH分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司乙腈CH3CN分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司无水乙醇CH3CH2OH分析纯天津市富宇精细化工有限公司甲醇CH3OH色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司乙腈CH3CN色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司三水合磷酸氢二钾K2HPO4•3H2O分析纯广州市金华大化学试剂有限公司磷酸二氢钾KH2PO4分析纯广州市金华大化学试剂有限公司六水合三氯化铁FeCl3•6H2O分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司去离子水H2O/实验室自制蒸馏水H2O/实验室自制实验仪器实验所用仪器如表3-2所示：表3-2实验仪器仪器/设备名称型号生产厂家电子天平AUY220日本SHIMADZU公司电子天平EX125DZH奥豪斯仪器（常州）有限公司高效液相色谱仪LC-2010AHTSHIMADZU数显pH计FE20/EL20德国梅特勒-托利多集团恒温振荡器SHA-C常州智博瑞仪器制造有限公司数控超声波清洗器SB-5200DT宁波新艺生物科技股份有限公司电热恒温鼓风干燥烘箱101-2AB天津市泰斯特仪器有限公司集热式恒温加热磁力搅拌器DF-101S河南省予华仪器有限公司真空干燥箱DZ-3BCII天津市泰斯特仪器有限公司溶剂含水量对吸附的影响配制乙腈:水=2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2，9:1（v/v）和纯乙腈溶液各30mL，分别称取9份E22.5mg，用以上9种不同含水比例的乙腈溶液溶解，用玻璃棒引流至25mL量瓶中，稀释至刻度，即得一组不同含水量的100μg/mlE2溶液。取9个10mL锥形瓶，分别加入5mg吸附材料，加入5mL不同含水量的E2溶液，置于25℃恒温振荡器中以120r/min的速度振荡一定时间，吸取上清液经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液进行HPLC分析。通过E2初始浓度和剩余浓度的比较，以吸附量（Q）为评价指标，考察溶剂含水量值对磁性碳纳米管（MMWCNTs）吸附17β-雌二醇（E2）的影响。pH值对吸附的影响称取KH2PO41.360g，加入去离子水500mL溶解，得到20mmol/LKH2PO4溶液，测得pH=4.76；称量K2HPO4•3H2O2.280g，加入去离子水500mL溶解，得到20mmol/LK2HPO4•3H2O溶液，测得pH=8.89。用0.01mol/LHCl和0.1mol/LNaOH调节pH,得到pH分别为2，3，4，5，6，7，8，9的磷酸盐缓冲液，备用。称取10份E22.5mg，分别加入7.5mL乙腈溶解，用玻璃棒引流至25mL量瓶中，分别用pH=2，3，4，5，6，7，8，9，10，11的磷酸盐缓冲液稀释至刻度，即得一组不同pH的100μg/mLE2溶液。取10个10mL锥形瓶，分别加入5mg吸附材料，加入5mL不同pH的E2溶液，置于25℃恒温振荡器中以120r/min的速度振荡一定时间，吸取上清液经0.45μm微孔滤膜滤过，滤液进行HPLC分析。通过E2初始浓度和剩余浓度的比较，以吸附量（Q）为评价指标，考察pH值对磁性碳纳米管（MMWCNTs）吸附E2的影响。结果与讨论本章以制备所得的磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料为吸附介质，主要针对pH值和溶剂含水量两个因素，对复合材料吸附17β-雌二醇（E2）的条件进行了优化探究。实验结果表明，MMWCNTs在pH=3，溶剂水含量为乙腈:水=3:1（v/v）的条件下，对E2的吸附效果最佳。3.2.1溶剂含水量对吸附的影响结果3.2.2pH值对吸附的影响结果

磁性碳纳米管的吸附性能研究前一章节我们对磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料对17β-雌二醇（E2）的吸附实验进行了条件优化，并选择出了最佳吸附条件为pH=3，溶剂含水量为乙腈:水=3:1（v/v）。本章节将介绍我们结合高效液相色谱法，采用等温吸附实验和选择性吸附实验，对磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料的吸附性能进行考察和研究。实验部分试剂与材料实验所用试剂与材料如表4-1所示：表4-1试剂与材料试剂名称化学式纯度生产厂家17β-雌二醇estradiol，E2≥99％北京百灵威科技有限公司雌酮原料药estrone，E1≥99％北京百灵威科技有限公司黄体酮原料药progesterone≥99％北京百灵威科技有限公司地塞米松原料药dexamethasone≥99％北京百灵威科技有限公司己烯雌酚原料药diethylstilbestrol≥99％北京百灵威科技有限公司双酚A原料药BisphenolA≥99％北京百灵威科技有限公司甲醇CH3OH色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司乙腈CH3CN色谱纯天津市科密欧化学试剂有限公司无水乙醇CH3CH2OH分析纯天津市富宇精细化工有限公司乙酸CH3COOH分析纯天津市科密欧化学试剂有限公司去离子水H2O/实验室自制蒸馏水H2O/实验室自制实验仪器实验所用仪器如表4-2所示：表4-2实验仪器仪器/设备名称型号生产厂家电子天平AUY220日本SHIMADZU公司电子天平EX125DZH奥豪斯仪器（常州）有限公司高效液相色谱仪LC-2010AHTSHIMADZU数显pH计FE20/EL20德国梅特勒-托利多集团恒温振荡器SHA-C常州智博瑞仪器制造有限公司数控超声波清洗器SB-5200DT宁波新艺生物科技股份有限公司等温吸附实验1）溶液的配制精密称取E225mg于100mL容量瓶中，用乙腈/PB（pH3)=3:7（v/v）稀释至刻度，配制成浓度为250µg/mLE2-乙腈/PB溶液。然后分别量取上述溶液1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、13.0、14.0和16.0mL于25mL容量瓶中，加入乙腈/PB（pH3)=3:7（v/v）定容至刻度，得浓度分别为10、20、40、80、100、130、140和160µg/mL的E2-乙腈/PB溶液。量取上述溶液1.0mL于50mL容量瓶中，加乙腈/PB（pH3)=3:7（v/v）溶液定容至刻度，即得浓度为5µg/mL的E2-乙腈/PB溶液。2）吸附与测定精密称取经干燥处理的磁性碳纳米管复合材料（MMWCNTs）5mg置于10mL具塞的磨口锥形瓶中，分别加入5~160µg/mL系列梯度的E2-乙腈/PB溶液各5mL，于25℃下在恒温振荡器中匀速振荡1h后，吸取上清液经0.45μm微孔滤膜滤过，在一定色谱条件下进行HPLC测定分析。根据吸附前后E2浓度的变化，计算该复合材料对E2的吸附量Q，并用Langmuir与Freundlich两种模型分析等温吸附数据。吸附量Q计算公式（4-1）、Langmuir方程（4-2）和Freundlich方程（4-3）如下。Q=c0−ceQ=logQ=mlogc式中：c0—吸附前溶液中E2的浓度（µg/mL）；ce—吸附后溶液中E2的平衡浓度（µg/mL）；V—E2溶液的体积（mL）；W—MMWCNTs的质量（mg）；Q—复合材料对E2的吸附量（mg/g）；KL—Langmuir吸附分配系数（L/mg）;Qm—复合材料的最大吸附量（mg/g）；KF和n—Freundlich参数。3）色谱条件色谱柱：KromasilC18色谱柱（4.6mm×150mm，i.d.，5μm）；流动相：乙腈-水（50:50，v/v），过滤超声备用；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：20μL。吸附选择性实验1）样品溶液的配制分别精密称取17β-雌二醇、雌酮、黄体酮、双酚A、地塞米松和己烯雌酚50mg于100mL量瓶中，用乙腈/PB（pH3)=3:7（v/v）缓冲溶液稀释至刻度，分别配制成浓度为500µg/mL的待测化合物的乙腈/PB溶液。然后量取上述溶液5.00mL于25mL量瓶中，加乙腈/PB（pH3)=3:7（v/v）缓冲溶液稀释至刻度，即得浓度为100µg/mL的待测化合物的乙腈/PB溶液。2）吸附与测定精密称取已干燥处理的MMWCNTs5mg置于10mL具塞的磨口锥形瓶中，分别加入100µg/mL上述配制好的溶液各5mL，于25℃下在恒温振荡器中匀速振荡1h后，吸取上清液经0.45μm微孔滤膜滤过，在一定色谱条件下进行HPLC测定分析。根据吸附前后目标分析物浓度的变化，运用公式（4-1）计算复合材料对目标分子的吸附量Q。3）色谱条件（1）雌二醇色谱柱：KromasilC18色谱柱（4.6mm×150mm，i.d.，5μm）；流动相：乙腈-水（50:50，v/v），过滤超声备用；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：20μL。（2）雌酮色谱柱：KromasilC18色谱柱（4.6mm×150mm，i.d.，5μm）；流动相：乙腈-水（50:50,v/v），过滤超声备用；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；柱温：40℃；进样量：10μL。（3）黄体酮色谱柱：KromasilC18色谱柱（4.6mm×150mm，i.d.，5μm）；流动相：甲醇-水（80:20，v/v），过滤超声备用；流速：1.0mL/min；检测波长：320nm；柱温：25℃；进样量：20μL。（4）双酚A色谱柱：KromasilC18色谱柱（4.6mm×150mm，i.d.，5μm）；流动相：甲醇-水（80:20，v/v），过滤超声备用；流速：0.8mL/min；检测波长：280nm；柱温：25℃；进样量：20μL。（5）地塞米松色谱柱：KromasilC18色谱柱（4.6mm×150mm，i.d.，5μm）；流动相：甲醇-水（80:20，v/v），过滤超声备用；流速：1.0mL/min；检测波长：240nm；柱温：40℃；进样量：20μL。（6）己烯雌酚色谱柱：KromasilC18色谱柱（4.6mm×150mm，i.d.，5μm）；流动相：甲醇-水（85:15，v/v），过滤超声备用；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：40℃；进样量：10μL。结果与讨论等温吸附研究为考察复合材料对目标物的吸附性能，25℃下采用静态吸附实验测定了磁性碳纳米管复合材料（MMWCNTs）对17β-雌二醇（E2）的吸附量，并以E2溶液的系列浓度为横坐标，以吸附量为纵坐标，绘制磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料的等温吸附曲线，图4-1为25℃下MWCNTs的等温吸附曲线。由图4-1可知，随着溶液中E2浓度的增加，MMWCNTs对E2的吸附量均增加，当溶液浓度增加至130µg/mL，聚合物的吸附位点趋于饱和，从而使吸附处于平衡状态，MWCNTs的饱和吸附量为16.14mg/g。图4-125℃下MMWCNTs等温吸附曲线吸附选择性研究为考察MMWCNTs对E2的选择性识别能力，选择雌酮、黄体酮、地塞米松等甾体类药物和己烯雌酚、双酚A作为类似物进行吸附选择性实验，其化学结构和聚合物对其的吸附选择性结果见图4-3a、b。图4-3雌二醇及其类似物的化学结构（a）和MWCNTs对雌二醇及其类似物的吸附选择性（b）1：E2；2：雌酮；3：己烯雌酚；4：黄体酮；5：地塞米松从图4-3（b）中可以看出，MMWCNTs对E2的吸附能力最强，其对雌二醇、黄体酮和地塞米松等雌激素类药物也有一定的吸附作用，而对己烯雌酚和双酚A等其他类甾体激素的吸附量较小。表明磁性碳纳米管复合材料（MMWCNTs）对E2有较高的选择性和识别能力。4.3小结1）通过对磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料的等温吸附研究发现MMWCNTs对E2的吸附量会随雌二醇浓度的增大而增加，在浓度增大至130µg/mL时吸附量达到饱和。采用Langmuir模型和Freundlich模型进行拟合，得出MMWCNTs对E2的吸附行为符合Langmuir模型，表明该复合材料对雌二醇的吸附为单分子层吸附；2）通过对磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料的吸附选择性研究发现MWCNTs对雌二醇的吸附能力最强，此外对雌激素类药物也有一定吸附作用。表明所制备的MMWCNTs对目标物有较高的选择性和识别能力。

结论与展望结论本实验采用了氨基修饰的磁性纳米粒修饰碳纳米管得到吸附性能较好的磁性碳纳米管（MMWCNTs）复合材料，并优化了其制备条件；运用X-射线衍射法（XRD）对所制备的MMWCNTs进行了结构表征；采用高效液相色谱法（HPLC）测定该复合材料对17β-雌二醇（E2）的吸附容量，通过改变吸附溶剂pH，吸附溶剂含水量等条件选择出最佳吸附条件；采用等温吸附实验和选择性吸附实验对吸附介质的吸附性能进行了考察，为进一步研究建立17β-雌二醇-磁固相萃取-高效液相色谱（E2-MSPE-HPLC）检测方法，提供了前期实验研究基础。所得的主要结论如下：（1）制备条件的优化实验结果表明，在m(COOH-MWNTs)和m(Fe3O4-NH2)为3:1时，所制备得到的磁性碳纳米管复合材料（MMWCNTs）的吸附量最佳。（2）对样品进行X射线衍射分析结果表明，该磁性碳纳米管复合材料（MMWCNTs）制备成功。（3）吸附条件的优化实验结果表明，当磷酸盐缓冲液pH=3时，吸附效果达到最佳；溶剂含水量为乙腈：水=3：1时，吸附效果达到最佳。（4）对磁性碳纳米管复合材料的等温吸附研究结果表明，MMWCNTs对E2的吸附量会随E2浓度的增大而增加，在浓度增大至130µg/mL时吸附量达到饱和，采用Langmuir模型和Freundlich模型进行拟合，得出MMWCNTs对E2的吸附行为符合Langmuir模型，表明该复合材料对E2的吸附为单分子层吸附。（5）对磁性碳纳米管复合材料的吸附选择性研究表明，MMWCNTs对E2的吸附能力最强，此外对雌激素类药物也有一定吸附作用。说明所制备的MMWCNTs对目标物有较高的选择性和识别能力。展望1）磁性碳纳米粒复合材料制备完成后，对其做了相关表征，在以后的试验中，还可以对吸附剂通过元素分析、红外光谱分析、热重分析、扫描电镜分析方法，做更为完善的表征，从而能够更加深入了解该复合材料的特性。2）本试验所用到的雌二醇溶液为模拟制药工业废水中的雌二醇，成分单一，而实际制药工业废水中通常含多种成分，实验条件与实际区别较大，因此在以后的试验中，可深入研究混合成分溶液中磁性碳纳米粒复合材料吸附效果及影响因素。3）在进一步实验中，本课题拟将所制备的复合材料为固相萃取剂，优化萃取条件，建立17β-雌二醇-磁固相萃取-高效液相色谱（E2-MSPE-HPLC）分析监测方法，从而实现对制药工业废水中的17β-雌二醇的富集、分离和分析

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