抗体工程制药课件

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抗体工程制药

*抗体工程制药概述单克隆抗体及其制备基因工程抗体多功能抗体噬菌体抗体工程抗体诊断试剂抗体治疗药物*概述*概述抗体的产生IgG的结构抗原抗体反应抗体的应用抗体制药的发展历史抗体制药的现状*德国贝尔；日本北里柴三郎第一届诺贝尔医学或生理学奖得主发现白喉杆菌抗毒素治疗白喉抗体治疗的理念最早源于中国贝尔曾经发自肺腑感叹：“中国人远在2000年前就知晓以毒攻毒医理，它是合乎现代科学的一句古训！”*****抗体：能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白免疫球蛋白：具有抗体活性、化学结构与抗体相似的球蛋白Ig：化学结构；抗体：生物学功能所有抗体均是Ig，但并非所有Ig分子都具有抗体活性*（1）抗体的产生MMMMDMDGMDA成熟B细胞祖B细胞前B细胞（胞浆出现

IgM重链）不成熟B细胞MatureBcellsImmatureBcellsPre-BcellsPro-BcellsB细胞的发育过程第一节、概述*（2）IgG结构*****（3）抗原抗体反应*****（5）抗体制药发展历史

1890年发现白喉抗毒素，建立了血清疗法，开抗体制药之先河(马血清多克隆抗体）。1937年用电泳法将血清分为白蛋白、甲种、乙种、丙种球蛋白，并证明抗体活性主要存在于丙种球蛋白组分。1975年首次利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备出McAb.在临床上主要用于诊断和治疗。1986年第一个治疗用单抗OKT3上市*McAb

在免疫导向疗法中存在的问题：A、McAb均是鼠源性抗体，可产生人抗鼠抗体（HAMA），加速了排斥反应，在人体内的半衰期只有5-6h，难以维持有效药物作用靶组织时间；B、完整的抗体分子的相对分子质量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。需要解决的问题：A、降低McAb的免疫源性；B、降低McAb的相对分子质量。*解决问题的方法或途径—基因工程技术

1984年报道了人—鼠嵌合抗体，之后制备出了改型抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等多种类型，基本上消除了抗体的鼠源性（免疫源性），相对分子质量只有完整抗体分子的1/80-1/3。***

小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种。小分子抗体有很多优点:

可以用细菌发酵生产，成本低;

分子小，穿透力强;

不含Fc，没有Fc带来的效应;

在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出;

易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或酶标抗体等。

小分子抗体*FvScFv单区抗体最小识别单位Fab*

由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。

把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的活性。(1)Fab*

Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。(2)Fv或ScFv

FvScFv连接肽*基因工程包括以下内容基因克隆技术将全套抗体Ｈ链和Ｌ链Ｖ区基因克隆出来，进行原核表达，筛选特异性的基因噬菌体抗体库技术含人免疫球蛋白的转基因小鼠*治疗用抗体发展的三个阶段单克隆抗体基因工程抗体多克隆抗血清第一代抗体第二代抗体第三代抗体*整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术

基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术

Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术*（6）抗体制药的现状1986年，美FDA批准上市了第一个用于治疗移植物抗宿主病（GVHD）抗体药物

OrthocloneOKT3，翻开了生物医药历史崭新的一页8年后，FDA批准了第二个抗体药物上市。21世纪后，抗体药物研发上市速度加快，目前共有150余个抗体药物正在临床评估中，其中20多个已经上市，超过500种处于临床前研究阶段。1996年开始进入快速发展的轨道。

2002年治疗类风湿关节炎的完全人源化单抗humira批准上市，这是抗体药物发展具有里程碑意义大事。*至06年底，全世界共有21个治疗用抗体药物批准上市，其中美国18个(包括9个被欧盟批准的），中国2个，日本1个。2004年，约占全球药物市场份额的2％2006年，单抗药物的联合销售额为200亿美元。2006-2012年间的年销售额增长率将为14%。而同一时期，小分子药物增长率预计仅为0.6%。单克隆抗体药成为增长最快的药物*现在有5大单抗药物占据了80%的市场份额，其中Roche和Geneteck联合开发上市的单抗药物：Avastin、Herceptin和Rituxan；另外还有雅培公司的Humira和强生公司的Remicade。抗体药物的价格昂贵，治疗乳腺癌的Herceptin，250mg／支(15000元／支，一个疗程8支)，治疗淋巴瘤的Rituxan，400mg／支(21000元／支，一个疗程４支)。*全世界正在研制的生物技术药品，25%为各类单克隆抗体。抗体市场快速增长的主要推动：一、销售持续攀升；二、新品种不断上市；三、研发方面的重金投入。大型医药公司还会通过收购来获得对抗体新药的控制权。如最近美国强生公司收购了抗体药物研发的领头羊Centocor公司。**产品研究者适应症目标抗原批准年份抗体类型

Panorex

Centocor

肿瘤17-1A1995鼠源抗体

OthocloneOrtho异体移植CD31986鼠源抗体

Reopro

Centocor

心血管疾病IIIαIIIβ1994嵌合抗体

RituxanIDEC淋巴癌CD201997嵌合抗体

Remicade

Centocor

类风湿关节炎TNF-α1999嵌合抗体

SimulectNovartis肾脏移植CD251998嵌合抗体

Enbrel

Immunex

类风湿关节炎TNF-α1998抗体融合蛋白

Synagis

Medimmune

呼吸道感染Fprotein1998人源化抗体

ZenapaxPDL肾脏移植CD251997人源化抗体

HerceptinGenentech乳腺癌HER2/neu1998人源化抗体

Mylotarg

Celltech

白血病CD332000人源化抗体

CampathMillennium淋巴癌CD522001人源化抗体

ZevalinIDEC淋巴癌CD20-Y902002鼠源抗体

HumiraAbbott类风湿关节炎TNF-α2002人源化抗体

XolairGenentech哮喘IgE2003人源化抗体

Alefacept

Biogen

银屑病CD22003抗体融合蛋白*抗体药物销售趋势图*（6）抗体制药－国内市场1.利妥昔单抗销售额领先

国内市场上主要有的利妥昔和抗Tac单抗（2001)、鼠抗人T淋巴细胞CD3单抗(2002)、群司珠和巴利昔单抗(2003)。2.广州地区销量最大

广州是最大的抗体药物市场，占有总市场份额的30％，其次是北京和上海。**3.罗氏产品占绝对优势上海罗氏制药操控着整个国内抗体药物市场。巴利昔单抗是北京诺华的独家产品鼠抗人CD3单抗是唯一国产品种，国内企业生产的该产品在整个抗体药物市场所占的份额不足1％。抗CD3单抗企业份额：武汉生物制品所54.6％、北京费森尤斯医药公司44.9％、武汉生化制药厂0.5％。*（6）抗体制药－国内生产研究现状SFDA到目前为止共批准了11个抗体药物上市，5个是进口产品，6个是在我国研发的，其中4个是国家生物制品I类新药，均为抗癌药物。此外，还有一些仿制产品处于3期临床阶段。已批准的诊断性单抗有31个国内形成了三个抗体药物的中试及产业化基地。北京基地以百泰生物药业为主；上海基地以上海中信国健药业为主；西安基地由第四军医大学和成都华神集团合作形成。

*泰欣生(尼妥珠单抗,Nimotuzumab，百泰药业)：重组人源化抗人表皮因子受体(EGFR)单克隆抗体注射液，2008年6月上市，人源化程度95%，是世界上第三个用于治疗实体瘤的单克隆抗体。目前定价:50mg/10ml（3680元）泰欣生上市不仅代表我国在单抗药物人源化技术领域取得了重大突破,更重要的意义在于突破了哺乳动物细胞规模化培养这一生物技术瓶颈

**碘［131I］美妥昔单抗注射液（西安基地）［131I］人鼠嵌合型肿瘤细胞核单抗注射液（上海基地）注射用重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白”（商品名为“益赛普”）（上海基地）*抗体制药的国内状态目前国内正在进行临床前研究的抗体药物有：抗CEA嵌合抗体；抗破伤风抗体；抗乙型脑炎单抗；抗FabC1027，用于治疗肝癌。瓶颈：大规模动物细胞培养工艺，而此类工艺属于欧美严禁出口的技术，长期以来对我国实行封锁。

*（1）概念抗原决定族

（Epitope,Antigenicdeterminant）●一个抗原分子上可能有数个抗原决定基●

每个抗原决定族至少诱生一种专一性抗体●蛋白质性质抗原决定基含有六个以上氨基酸第二节、单克隆抗体及其制备*（1）概念抗原决定族

（Epitope,Antigenicdeterminant）●一个抗原分子上可能有数个抗原决定基●

每个抗原决定族至少诱生一种专一性抗体●蛋白质性质抗原决定基含有六个以上氨基酸第二节、单克隆抗体及其制备*（2）多克隆抗体

(Polyclonalantibody)（2－1）概念给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物,它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的,称为多克隆抗体.*（2－2

）实验室制备多克隆抗体研究、诊断用所用动物：1Balb/c小鼠，6－8周龄；雄性

2大鼠3兔子生后约12周。抗原：1纯化的抗原（线性抗原或构型抗原）

2非纯化抗原技术关键：抗原制备应用：免疫学检测

*类毒素毒素马血清抗毒素超敏反应抗体抗原*马血清抗毒素的两重性：(1)特异性抗体----中和毒素(2)异种抗原，可刺激机体产生抗马血清抗体马血清具有立即提供保护的优势，但异种gamma-球蛋白只是短期有效，常常导致病理合并症（血清病）和过敏反应。*人源多克隆抗体－血液制品

人的gamma-球蛋白是最理想的(同源性免疫球蛋白)，但具有传播肝炎和爱滋病的风险。献血员免疫（白喉毒素、狂犬病疫苗等）少量采血测效价大量采血制备抗体是*（3）单克隆抗体

(Monoclonalantibody,McAb)（3－1）概念:通过B细胞杂交瘤技术,获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.特点:单一特异;可重复;大量供应不需纯抗原;灵敏度高

**HAT:次黄嘌呤(H),氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)HGPRT：次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转化酶*

(3-2)、抗原与动物免疫抗原：颗粒性抗原和可溶性抗原不需纯化化学合成或者提纯微生物或细胞可直接作为抗原*免疫动物：BALB/c小鼠和Lou大鼠

Balb/c小鼠，8-12周龄；雄性动物与骨髓瘤同品系P183页佐剂:弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂*免疫方法：体内免疫:免疫原性强,抗原量多.皮下注射,腹腔注射免疫体外免疫:不能用体内免疫的杂交瘤细胞株不稳定

*初步免疫和加强免疫测定抗体效价处死小鼠,去脾细胞**基本方法：取适量脾细胞（1*108）与骨髓瘤细胞（2*107-3*107）进行混合，在PEG作用下诱导它们融合，时间控制在2min以内，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释。其他融合方法:电融合等细胞：骨髓瘤细胞（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核苷转移酶(HGPRT)缺陷型）应和免疫动物属于同一品系，这样杂交率高。（3－3）免疫及细胞融合*饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其他活细胞则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的细胞称饲养细胞。常用的有小鼠腹腔巨噬细胞、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。用于细胞融和的骨髓瘤细胞应具备融和率高，自