副溶血性弧菌PFGE操作程序

副溶血性弧菌PFGE操作程序生物安全：根据相关要求，处理所有被污染的塑料制品、玻璃制品、移液管、刀片等。第0天菌株接种挑取新鲜单个菌落，划线接种血琼脂平板，37℃第1天plug的制备打开恒温振荡水浴器（54℃），恒温水浴锅（55℃～60制备TE缓冲液。注意：TE缓冲液用于制备plug琼脂糖、洗涤裂解后的plug。制备1%SeaKemGold（SKG）琼脂糖，以备制作PFGEplug。称取0.25gSKG琼脂糖，加入100mL锥形瓶。加入24.75mL～25mLTE缓冲液，轻轻振荡，使琼脂糖充分扩散。盖上盖子（切勿太紧），微波加热30s，轻轻混合，每隔5s～10s重复一次，直到琼脂糖完全溶解。将溶化的琼脂糖置于55℃～60℃在比浊管上标记相应的菌株编号。制备细胞悬浮液（CSB）。分别在标记的比浊管中加入约2mL～3mL的CSB，使用无菌棉签从琼脂平板上刮取适量细菌，均匀悬浮于CSB中。调节菌悬液浓度：bioMérieuxVitek比浊计：透光度≈20%（Falcon2054管）；或，分光光度计：610nm，吸光度0.9（范围0.8～1.0）；或，DadeMicroscan浊度计：0.35～0.45（Falcon2054管）0.52～0.64（Falcon2057管）。取200µL调节好的菌悬液加入相应的1.5mL微量离心管中。如果菌悬液处于室温，可直接加入琼脂糖；如果菌悬液温度较低，应置于37℃每个微量离心管加入10µL的蛋白酶K（浓度为20mg/mL），用枪头轻轻混匀。注意：蛋白酶K要置于冰/冰盒里。使用前适量融化，实验结束后，丢弃所有融化的蛋白酶K。每管中再加入200µL溶化的1%SKG琼脂糖，用枪头轻轻混匀。注意：混匀过程中，应避免气泡的产生。使用过程中，溶化的1%SKG琼脂糖应置于55℃～60℃立即将上述混合物加入plug模具，室温凝固10min～15min，或4℃注意：混合物加入模具时应避免产生气泡。使用一次性制胶模具，可制作3个～4个plug。如果选择可重复使用的plug模具时，需要用400μL菌悬液、20μL蛋白酶K（浓度为20mg/mL）、400μL的1%SKG琼脂糖，可制作2个plug。细菌的裂解注意：同一株菌的3个～4个plug可以放在同一个50mL的管中裂解。在50mL的聚丙烯screw-cap管上做好标记。配制细胞裂解液（CLB）。按照下表，计算CLB/蛋白酶K缓冲液的体积：每管需要5mL的CLB。每管CLB需要25µL蛋白酶K（浓度为20mg/mL）。把需要的CLB和蛋白酶K加入适当的容器中，混匀。菌株数量CLB蛋白酶K（20mg/mL）15mL25µL1365mL325µL1575mL375µL20100mL500µL注意：CLB中蛋白酶K溶液的终浓度是0.1mg/mL，与加入到菌悬液中的浓度（0.5mg/mL）不同。每个50mL的管中加入5mL的CLB/蛋白酶K缓冲液。如果需要，用刀片削去模具顶部多余的胶。一次性模具：撕掉模具下面的胶带，用小铲将plug移入相应的screw-cap管中。可重复使用的模具：打开模具，用小铲的宽头部分将plug移入相应的screw-cap管中。注意：保证plug在液面下，切勿贴在管壁上。碎胶、胶带、模具、小铲或刀片等（被污染的）应进行适当的灭菌处理。在54℃50℃plug的清洗将恒温振荡水浴器温度调至50℃从恒温振荡水浴器中拿出screw-cap管，盖上GreenScreenedCaps，倒掉CLB。注意：将管倒置在吸水纸上，尽量排干管内液体。以下操作与此相同。每管中加入预热至50℃的无菌超纯水10mL～15mL，50注意：要确保plug在液面下而不在管壁或盖子上。以下操作与此相同。倒掉超纯水，用预热至50℃倒掉超纯水，用预热至50℃的TE缓冲液10mL～15mL洗涤，50倒掉TE，用预热至50℃倒掉最后的洗涤液，加上5mL～10mLTE。可直接进行酶切或放置在4℃保存备用。也可用刀片把plug直接切成2mm宽的胶块，转移至装有TE缓冲液的1.5mL微量离心管中，4第2天plug中DNA的酶切在1.5mL的微量离心管上标记相应的菌株编号，并标记3管或4管（15孔胶）H9812。按照下表1：10稀释10×缓冲液。试剂µL/胶块µL/7胶块µL/13胶块无菌超纯水1801260234010×缓冲液20140260总体积20014002600注意：缓冲液要放在冰/冰盒里。不同的限制性内切酶使用的缓冲液不同，请根据产品说明书进行选择。每个1.5mL的微量离心管中加入200µL的1×缓冲液。将plug小心地从TE中取出，置于干净的培养皿上。用刀片切下2.0mm宽的胶块，并转移到含有1×缓冲液的微量离心管中，确保胶块在液面下。将剩余的胶块放入原来的TE缓冲液中，4℃将微量离心管放入37℃温育后，用枪头吸出缓冲液。注意：避免损伤和吸出胶块。按照下表，配制酶切混合液【限制性内切酶SfiⅠ（37.5U/胶块）或NotⅠ（30U/胶块）】，混匀。SfiⅠ酶切混合液试剂µL/胶块µL/7胶块µL/13胶块无菌超纯水132.5625µL927.9375µL1723.3125µL10×缓冲液15µL105µL195µL100×BSA1.5µL10.5µL19.5µLSfiⅠ（40U/µL）0.9375µL6.5625µL12.1875µL总体积150µL1050µL1950µL注意：限制性内切酶一直放在冰/冰盒中。使用前从冰箱中取出，用后立即放入-20℃。NotⅠ酶切混合液试剂µL/胶块µL/7胶块µL/13胶块无菌超纯水130.5µL913.5µL1696.5µL10×缓冲液15µL105µL195µL100×BSA1.5µL10.5µL19.5µLNotⅠ（10U/µL）3µL21µL39µL总体积150µL1050µL1950µL注意：限制性内切酶一直放在冰/冰盒中。使用前从冰箱中取出，用后立即放入-20℃每管中加入150µL限制性内切酶混合液。盖上盖子，在试验台上轻磕管子的底部，保证胶块在液面下。酶切温度和时间SfiⅠ：50℃NotⅠ：37℃在酶切反应结束之前的0.5h就开始准备制胶操作的1～4步，这样就可以在倒胶之前，使液体胶的温度冷却至55℃～60℃酶切片段的电泳制胶调节水浴温度为55℃～60℃制备0.5×TBE缓冲液。用0.5×TBE制备1%SKG琼脂糖（15孔胶）：称取1.5g的SKG琼脂糖加入300mL的锥形瓶中。加入150mL的0.5×TBE，轻轻混匀。盖上盖子，微波加热60s，轻轻混匀，每隔10s～15s重复一次，直到琼脂糖完全溶化。置于55℃～60℃注意：取加热后的锥形瓶，需带上防热手套。取2mL左右溶化的1%SKG琼脂糖放入1.5mL微量离心管中，置于55℃～60℃注意：保证制胶模具【Bio-Rad，货号170-3704（21cm×14cm）】放置在水平桌面上。调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽底面平行（相隔约2mm）。从37℃从管中取出胶块；把梳子放在胶槽上面，把胶块加在梳子齿上：把H9812放在第1、8、15个或第1、5、10、15个梳子齿上。将样品置于其他梳子齿上。用吸水纸吸去胶块上多余的缓冲液，室温下风干10min～15min。将梳子放入胶槽，保证所有的胶块都位于梳齿的底部。从胶槽的下部中央缓慢倒入溶化的55℃～60℃在胶凝固30min～45min后移去梳子。使用溶化的55℃～60℃电泳用2L左右的纯水清洗电泳槽，并排出液体。保证电泳槽水平放置。否则，调整电泳槽底部的旋钮。注意：不要接触电极。将黑色的胶框放在电泳槽内。加入2L～2.2L新配制的0.5×TBE，盖上盖子。在电泳之前30min，打开主机、泵（设置为≈70，这时缓冲液的流速约为1L/min）和冷凝器（14℃注意：开机顺序为主机-泵-冷凝器。保证电泳液在管道中正常循环。确保冷凝器预设温度为14℃打开胶槽的旋钮和边框，取出凝固好的胶，清除胶四周和底部多余的碎胶。小心把胶放入电泳槽。盖上盖子。注意：确保电泳液实际温度为14℃必要时，可加入硫脲（硫脲储存液的浓度1mol/L，1:10000稀释，即在2200mL0.5×TBE中加入220µL储存液），以防止DNA的降解。硫脲具有毒性，废弃的加有硫脲的电泳液应妥善处理。设置电泳参数。CHEF-mapper型脉冲场凝胶电泳仪SfiⅠ、NotⅠ酶切“AutoAlgorithm”模式：LowMW——78kbHighMW——396kbRuntime：19hInitialswitchtime=10s；Finalswitchtime=35s记录电泳初始电流（通常为120mA～145mA）注意：以上所推荐电泳时间是以CDC仪器和试剂确定的。在不同实验室，电泳时间可能不同；调整电泳时间，使电泳胶中H9812最小片段距胶底端1.0cm～1.5cm。第3天图像的获取结束电泳：关机顺序为冷凝器-泵-主机。取出胶，置于盛放400mLEB溶液的盒子中（EB储存液的浓度10mg/mL，1:10000稀释，即在400mL水中加入40µL储存液）。在振荡器上染色30min。注意：EB是强致癌剂