DB65T 3179-2010 加工番茄品种SSR指纹数据库构建规范

B加工番茄品种SSR指纹数据库构建规范2010-12-30实施2010-12-30实施新疆维吾尔自治区质量技术监督局发布I本标准根据国家标准化法有关规定，按GB/T1.1-2009《标准化工作导则第一部分：标准的结构和起草规则》编写。本标准由新疆农业科学院园艺作物研究所提出。本标准由新疆维吾尔自治区农业厅归口。本标准由新疆农业科学院园艺作物研究所起草。本标准主要起草人：王柏柯、余庆辉、杨生保、帕提古丽、杨涛、张贵仁。1DB65/T3179--2010加工番茄品种SSR指纹数据库构建规范本标准规定了加工番茄品种SSR标记方法及标记来源、检测平台、试剂质量保证、样品的米源及性质、引物及流程的评估、不同来源数据的有效整合、构建品种DNA指纹模式库、构建品种DNA指纹扩展库、数据库数据的随机盲测。本标准适用于加工番茄品种鉴定及DNA指纹库的建立。2规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T3543.5-1995农作物种子检验规程真实性和品种纯度鉴定GB/T19557.1-2004植物新品种特异性、一致性和稳定性测试指南总则GB/T3543.1-1995农作物种子检验规程总则3术语和定义SSR(SimpleSequenceRepeats)标记是近年米发展起来的一种以特异引物PCR为基础的分子标记技术，也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA),是一类由儿个核苷酸(一般为1～6个)为重复单位组成的长达儿十个核苷酸的串联重复序列.由于每个SSR两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列是根据寡核苷酸的大小米分离，因此可将全长产物与不完整的短分子分开，适合变性蛋白的处理。是一小段单链DNA或RNA,作为DNA复制的起始点，在核酸合成反应时，作为每个多核苷酸链进行延必须是游离的。4SSR操作程序2通过特异性引物进行PCR扩增反应，扩增产物通过琼脂糖凝胶屯泳(或聚丙烯酰胺凝胶电泳)和放射自显影(或银染),就可以检测到在简单重复序列重复单位数不同的DNA区域的多态性。5标记方法及标记来源国际植物品种权保护组织(UPOV)在2005年拟定的BMT测试指南草案中将构建DNA指纹数据库标记方法确定为SSR和SNP。SSR标记技术比较成熟，成为当前各个作物建库的首选标记。通过对儿种分子标记方法RFLP,RAPD,AFLP,SSR,SNP等进行比较，最终确定采用SSR作为番茄DNA指纹库构建的标记方法。选用的SSR引物必须来自权威的文献或机构，以保证结果的可靠性。6检测平台检测的方法主要是变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和毛细管电泳：常规变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结合银染检测最小分辨率可达到1bp,技术方法己经成熟，操作简单，且成本低廉，但不能直接读取片段的大小，且通址较低，适用于筛选引物和样品数量较少的情况；毛细管屯泳结合多色荧光检测方法是近年来发展比较迅速的方法，该方法能够直接读取片段大小，通量较高，且操作简单、数据统计方便，但需要特殊的仪器设备和配套试剂，适用于人批量样品的情况。7试剂质量保证7.2引物序列应明确引物是否采用荧光标记、如采用荧光标记，应明确采用何种荧光标记以及是否采用加尾序列。根据番茄建库的具体情况，以ABT3730XL毛细管电泳五色荧光检测系统的数据作为建库的标准数据，并规定不同引物应标记的荧光类型，所有建库标准指纹数据均是采用无加尾序列的引物获得的。7.3酶及PCR反应相关试剂对构建标准DNA指纹库时采用的试剂指定供货厂家及规格。7.4PCR扩增反应统一采用相同的反应程序及反应体系。8样品的来源及性质8.1品种来源要求品种米源可靠。根据自治区加工番茄育种实际情况，建库品种主要来自治区区域试验和白治区品种审定委员会审定的品种以及自治区品种权保护部门保护的品种；其次来自国家种质资源库；少量材料米自向育种单位直接征集。对征集材料，均与育种单位签订协议。DB65/T3179—201038.2样品类型主要包括种子或叶片。为了扩大库容，特别是扩大入库白交系数量，可以提供叶片等营养组织或提供符合要求的DNA样品。8.3样品分析数量根据繁殖方式不同而有区别。由于番茄材料具有多种繁殖方式，对完全纯合的白交系材料和高度一致的单交种材料规定每个品种分析3-5个个体；对农家种、综合种、开放授粉品种、除单交种外的其它类型杂交种(三交、双交等),如果采用混合样品，每个品种至少混样3份，每份混样至少混合10个个体。9引物及流程的评估评估阶段是指对在一个实验室确定下的引物和流程通过扩大到一个以上实验室和不同的检测设备米评估引物和I流程的重复性和稳定性，根据反馈的结果对引物名单及流程进行调整。9.1评估用的品种数量及名单的确定在控制合适的数量的情况下，要求材料具有足够的代表性和比较广泛的遗传基础。此外，应至少包括1-2套遗传上或形态上极为相似的材料以评估引物对近似品种的区分能力。9.2引物评估的取舍标准一般而言，引物在任何一个实验室出现扩增困难、统计困难、统计错误的情况均不再进一步使用。但如果仅在一个实验室出现统计结果与其它实验室不一致，可通过互换样品的方式进行复验，以排除取样错误的可能。10不同来源数据的有效整合不同来源DNA指纹数据的有效整合问题是DNA指纹库构建过程中的重点，为了解决这…-难题，通过对大量的研究进行总结归纳，提出以下儿种解决策略，这些策略可以结合起来进行。10.1固定一套核心引物核心引物是指多态性、稳定性、重复性等综合特性好、可作为DNA指纹鉴定优先选用的一套引物。包括基本核心引物和扩展辅助核心引物。其中基本核心引物作为固定用丁品种鉴定和建库的引物，保证不同实验室数据具有可比性并可进行数据整合。扩展辅助核心引物相对固定，并可根据引物的最新研究结果和特殊鉴定性状进行调整。综合考虑引物的染色体分布、多态性和多重PCR组合情况，在番茄每条染色体的长臂和短臂上各选取1对引物，共计24对引物作为构建番茄DNA指纹数据库用的基本核心引物。10.2提供标准品种标准品种是在DNA指纹库构建过程中作为谱带分型的参照标准，并辅助判断试验的稳定性和可靠性。以一套典型的遗传基础广泛的高度纯合白交系为试材，对拟建库的引物进行DNA指纹分析，就可确定代表每个引物不同谱带的标准品种名单。标准品种选择的要求如下：10.2.1除了少数稀有谱带类型不易找到标准品种时选用特殊自交系外，尽量选用国内外已知的常用自交系为标准品种；4DB65/T3179—201010.2.2标准品种应足够纯合；10.2.3标准品种应容易扩繁保种；10.2.4标准品种由指定的单位统一扩繁保种，统一发放；10.2.5尽量以较少的品种代表较多种谱带类型。10.3提供标准DNA10.3.2DNA经过指纹分析反复验证，证明能够稳定扩增出预期大小的谱带；10.3.3同一批次提取的DNA量要足够大，大于或等于50ug。10.4确定引物等位基因BIN如果采用具有片段分析功能的毛细管电泳检测系统，如AB13730XL遗传分析仪，则可在分析软件上根据统计出的每个引物位点的所有可能的allel(等位基因)建立起每个引物的BIN。要求如下：10.4.1必须包括主要的等位基因；10.4.2如果稀有等位基因也包括在内的话，应标注其为突变型；10.4.3每个等位基因根据其表现特征，确定其扩增片段大小的区间范围。10.5规定对异常带型的数据处理方式在控制合适的数量的情况下，在具体试验中出现的异常带型主要包括稀有带型、零带型、弱带型、缺失带型等。对稀有带型应如实记录，但应标注其为稀有带型；对零带型应尽量避免，如果某引物出现的零带型比率较高(>5%),则该引物应剔除；对弱带型及缺失带型应尽可能通过重新扩增将数据补齐。10.6规定数据的编码方式DNA指纹数据可能的编码方式主要有3种：10.6.1根据扩增产物在电泳凝胶上的相对位置，确定不同的谱带类型，并按扩增片段从大到小的顺序编号。适用于仪器不具有直接读取片段大小的功能的情况。10.6.2根据扩增产物的片段大小，直接记录不同谱带片段大小。适用于仪器具有直接读取片段大小的功能且同一多态性位点上采用的引物固定的情况。10.6.3将同一多态性位点设计的不同引物获取的数据进行整合。适用丁在同一多态性位点同时设计并使用了多个不同引物进行数据库构建的情况。数据整合采取如下两种方案：方案1:采用记录扩增片段绝对大小的方式。指定某个引物为该多态性位点的标准引物，该位点设计的其它引物获得的数据按照片段大小整体向上或向下位移的规律，统一转换成标准引物的数据。方案2:采用记录片段相对大小的方式。规定引物扩增的最小片段的谱带长度为0,同一位点的所有引物的数据均以实际片段大小减去该引物扩增的最小片段大小后记录，因此，同一引物位点无论采用多少不DB65/T3179—20105同的引物，所获得指纹的编码方式是不变的，但应提供该引物位点不同引物的最小片段大小。11构建品种DNA指纹模式库确定构建模式库的材料名单及米源。根据白治区加工番茄的情况，模式库品种包括常用自交系，己审定的主推杂交种，白治区参加区试的新品种，白治区具有品种权保护品种。利用不同实验室或不同检测设备同时检测。不同实验室采用相同的标准试验体系，共用一套建库核心引物，指定实验室提供代表每个核心引物主要谱带的标准品种或标准DNA,用标准品种建立标准谱带或Bin,再进行DNA指纹数据分析。如果结果不同，可更换样品或DNA后复检。最终建