（正式版）DB65∕T 4527-2022 《家畜布鲁氏菌LAMP检测方法》

家畜布鲁氏菌LAMP检测方法2022-10-10发布2022-12-09实施学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站、新对本文件的修改意见建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局(乌鲁木齐市新华南路408号乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心(乌鲁木齐市南湖西路15号)、深圳真瑞生物科技有限公司(广东省深圳市龙华区龙华街道清宁路1号富安娜工业园B栋5层)、新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)(乌鲁木齐市新市区冬融街726号)、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作总站(乌鲁木齐市米东区米东南路2188号红光雅居7号公建楼)、新疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话传真邮编：830004深圳真瑞生物科技有限公司联系电话邮编：518100新疆畜牧科学院兽医研究所(新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心)联系电话传真邮编：830013新疆维吾尔自治区动物疫病预防控制中心联系电话传真邮编：新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话传邮编：830004工家畜布鲁氏菌LAMP检测方法本文件规定了家畜布鲁氏菌环介导等温核酸扩增技术(LAMP)检测的生物安全措施、仪器耗材与试或使用布病疫苗免疫后的牛、羊应在接种疫苗后12规范性引用文件仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本GB19489实验室生物安全通用要求NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范本文件没有需要界定的术语和定义。4生物安全措施5仪器耗材与试剂b)微量移液器(1μ~10μ,20μL～200L,200L～1000μL);e)实时荧光恒温扩增仪或荧光定量PCR仪：激发光/检测光波长分别为480/523nm。2a)0.2mL透明顶盖PCR反应管(适配荧光定量PCR仪)或螺帽反应管(适配实时荧光恒温扩增c)样品保存管(15mL、4mL);b)LAMP反应液：含有布鲁氏菌特异性检测引物的商品化LAMP扩增试剂；d)阳性质控：含有目标核酸片段的质粒制品(商品化试剂);e)阴性质控：含有无关核酸序列的质粒制品(商品化试剂)。a)恒温震荡仪：S1(样本处理程序):95℃,转速2000rpm,时间10min;S2(恒温扩增程序):65℃,转速0rpm,时间40min;b)实时荧光恒温扩增检测仪或荧光定量PCR仪：扩增温度65℃,扩增时间40min,每分钟收集1次荧光。6.2.1.1母畜采集奶液或阴道拭子。每头母畜使用2支～3支点断式植绒拭子，同时塞入阴道内，应深插拭子，并将拭子在阴道内轻柔转动后取出，将拭子放入样本保存管中折断，盖严管盖。6.2.1.3家畜的关节腔积液、流产胎儿的绒毛膜水肿液、流产胎儿的胃内容物也可作为检测样本。6.2.1.4按照NY/T541和DB65/T3893采集所需布鲁氏菌病检测样品。采集的样本宜当天处理和检测，若不能当天检测，应暂放于冰箱冷藏室(4℃)保存。6.2.2.1阴道/尿道拭子：样本保存管中加入生理盐水1mL(此处加液应悬空加入管内，避免样品之间交叉污染),盖严盖子，涡旋15s,静置5min。小心打开样本保存管盖，用移液器带吸头伸入管底6.2.2.2奶液、尿液：取15mL样本放入样品保存管中，8000rpm离心10min,弃掉上清，用生理盐36.2.2.4采集的样本宜当天处理和检测，样本若需远距离运输，冷藏运输不宜超过24h,若时间过长振荡10min,程序结束后将样本处理管置于冰盒中冰浴3min。样本处理管冰浴后短暂离心5s,取上6.3LAMP方法检测核酸6.3.1将LAMP反应液置于室温彻底融化，上下颠倒6次～6.3.2按照表1配制反应体系。反应体系样本/阴/阳性对照石蜡油注：配制反应体系时，先配制好母液分装到各个反应管，再添加模母液后，再分别加入4L的扩增模板，用巴氏吸管加两滴石蜡油封闭反应液，最后将PCR管的管盖盖a)可视法试剂(反应液为紫罗兰色):将反应管置于恒温震荡仪孔内(放之前确认温度已达到65℃),运行程序S2,40min反应结束后取出反应管，肉眼观察颜色变化，判读并记录检b)荧光法试剂(反应液为无色透明):将反应管置于荧光定量PCR仪或实时荧光恒温扩增检测6.4.1.1可视法试剂：同批反应的阳性对照，反应后溶液颜色由紫6.4.1.2荧光法试剂：荧光定量PCR仪、实时荧光恒温扩增检测仪或便携式荧光检测仪上读取结果，同批反应的阴性质控荧光值<阴性阈值标准管荧光值；同批反应的阳性质控荧光值>阳性阈值标准管荧光值，且有典型的S型扩增曲线。46.4.2.1可视法试剂：反应后溶液颜色变成天蓝色的样本判为布鲁氏菌核酸阳性；反应后溶液颜色仍判为可疑，见图1。a)荧光定量PCR仪或实时荧光恒温扩增检测仪：样本有典型S型扩增曲线，且样本荧光峰值≥阳性阈值标准管荧光值，判为布鲁氏菌核酸阳性；样本荧光峰值<阴性阈值标准管，判为阴性，未检测到布鲁氏菌核酸；阴性阈值标准管≤样本的荧光峰值<阳性阈值标准管，判为可b)便携式荧光读取仪：样本的荧光值≥阳性阈值标准管荧光值