（正式版）DB65∕T 4590-2022 《重大动物疫病监测样品采集、送检技术规范》

2022-12-09实施2022-12-09实施I本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心提本文件由新疆维吾尔自治区畜牧兽医局归口并组织实本文件起草单位：新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心。本文件主要起草人：任娟、刘亚涛、惠志华、王文、李舵、薛文、秦菊、李彦芳、符玉涓、李琴、丁剑。本文件实施应用中的疑问，请咨询新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心。对本文件的修改意见和建议，请反馈至新疆维吾尔自治区畜牧兽医局(乌鲁木齐市天山区新华南路408号)、新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心(新疆乌鲁木齐市高新技术产业开发区蓝天路268号)、新疆维吾尔自治区市场监督管理局(新疆乌鲁木齐市天山区新华南路167号)。新疆维吾尔自治区畜牧兽医局联系电话传真邮编：830004新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心联系电话传真邮编：830011新疆维吾尔自治区市场监督管理局联系电话传真邮编：1本文件规定了重大动物疫病监测样品的采样原则、采样前准备和样品采集、送检、保存与包装。本文件适用于各级动物疫病预防控制机构及相关单位重大动物疫病监测样品采集工作。仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T18935口蹄疫诊断技术NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T561动物炭疽诊断技术一、二、三类动物疫病病种名录农业部公告第1125号中华人民共和国动物防疫法中华人民共和国主席病原微生物实验室生物安全管理条例国务院令第424号，2018修订版兽医实验室生物安全技术管理规范农业部公告第302号高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范农业部公告第503号长期地、连续地收集、核对、分析疾病的动态分布和影响因素的资料，并将信息及时上报和反馈，通过一定的方法，按照特定的程序和要求，对样品进行收集、处理及整理的过程。取自动物或环境，拟通过检测反映动物个体、群体或环境有关状况的材料或物品。动物传染病、寄生虫病。2高致病性禽流感等发病率或者死亡率高的动物疫病突然发生，迅重威胁、危害，以及可能对公众身体健康与生命安全造成危害的情形，包括特别重大动物疫情。《一、二、三类动物疫病病种名录》规定的非洲猪瘟、皮肤病等二类动物疫病；我国尚未发现的及我国已消灭的动物疫病。食道-咽部分泌物4采样原则4.1先排除炭疽后采样根据动物的实际情况和实验目的，选择适当的采样时机。对疫苗免疫动物进行抗体监测，免疫后24.4典型采样选取未经药物治疗、症状明显的动物，在病变明显的部位采样，采样部位不应用消毒剂处理。3样。每份样品的体积应满足所有检测项目的需要，并有剩余样品。疑似阳性动物的样本应平行采集2份，一份送检，一份留样备检。4.7减少应激和伤密活体动物采样时，应考虑动物福利，避免过度刺激或伤害动物。4.8生物安全防护采样人员加强个人防护，使用合格的医用防护用品(防护服、口罩、帽子、手套、鞋套等),避免病。5.1.1采样人员经生物安全知识培训，熟悉样品采集方法，熟练掌握样品采集操作技术。5.1.2采样人员做好生物安全防护，需佩戴防护口罩、护目镜、连体防护服、双层乳胶手套、防水靴套，防止感染人畜共患病和污染环境，造成动物疫病扩散。5.2.1保温箱、探杯、开口器、采样枪、解剖刀、剪刀、镊子、酒精灯、酒精棉、棉签、注射器及针头。5.2.2样品容器：离心管、封口袋、带螺帽的塑料离心管，盛放同批样品的容器类型、大小须统一。5.2.3试管架、铝饭盒、无菌聚丙烯纤维头塑料杆拭子或棉拭子、封口膜、封条、冰袋。5.2.4采样刀剪等器具和样品容器应洁净、干燥，并提前消毒。刀、剪、镊子应经103kPa高压蒸汽灭菌或者煮沸消毒30min,使用前用酒精擦拭或者进行火焰灭菌处理。器皿(玻制、陶制等)应经103kPa高压蒸汽灭菌或者160℃干烤2h灭菌。根据监测目的和样品的种类准备保存试剂，并提前分装好。0.01mol/L或0.04mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,ph7.4)、30%或50%甘油磷酸盐保存液(用于病毒检测时，应加入双抗)、0-P液保存液配置4541的规定。主要重大动物疫病监测采样部位见表1。高致病性禽流感/新城疫咽喉/泄殖腔拭子、气管分泌物、肺、新鲜粪使、血清等口蹄疫高致病性猪蓝耳病小反刍兽疫牛结节性皮肤病6.1.1全血样品采集大型哺乳动物可通过颈静脉或尾静脉采血。猪可通过前腔静脉或耳静脉采血。可通过翅静脉或心脏采血。可通过耳静脉、颈静脉或心脏采血。少量采血可穿刺耳尖或者耳外侧静脉，也可划破脚垫剪短，多量采血可通过隐静脉采集。对采血部位的皮肤先剃毛，用1%～2%碘酊消毒后，再用75%酒精棉球由内向外螺旋式擦拭，干燥后使用含有EDTA抗凝剂的真空采血管采集血液样品3mL～4mL。5分离和培养外周血中淋巴细胞的样本，使用含有肝素抗凝剂的真空采血管采集血液。6.1.2血清样品采集用一次性采血器或储血器采集血液样本3mL～4mL(采血器体积的2/3),不应暴晒，室温下倾斜30°静置2h～4h,待血液凝固有血清析出时，置4℃冰箱过夜；或将盛放血液的容器放在恒温箱(37℃)中静置4h～6h,待大部分血清析出后，无菌操作取出血清，必要时1000rpm～300离出血清于离心管中。应避免采集过于肥胖的动物的血液用于分离血清。血在眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，立即将拭子浸入灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液)的离心管中，将拭子尾部弃去，盖紧管盖。使用聚丙烯纤维头的塑料杆(或棉签)拭子，贴鼻孔进入，轻轻擦拭并缓慢旋转2圈或3圈，沾取鼻腔分泌物，立即将拭子浸入灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液)的离心管中，将拭子尾部弃去，盖紧管盖。使用聚丙烯纤维头的塑料杆(或棉签)拭子，插入家禽口腔至咽的后部，轻轻擦拭并缓慢旋转2圈或3圈，沾取咽喉分泌物后取出，立即将拭子浸入灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液)的离心管中，将拭子尾部弃去，盖紧管盖。使用聚丙烯纤维头的塑料杆(或棉签)拭子，插入家禽口腔至咽的后部直达喉气管处，轻轻擦拭并缓慢旋转2圈或3圈，沾取气管分泌物后取出，立即将拭子浸入灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液(也可使用等渗盐溶液、组织培养液)的离心管中，将拭子尾部弃去，盖紧管盖。采集发病动物(牛、羊或猪)未破裂的水泡皮和水泡液，样品采集部位可用清水清洗(不应使用酒精、碘酒等消毒剂消毒、擦拭)。用灭菌注射器吸出水泡液≥1mL,置于灭菌容器(可加双抗)中送检。剪取新鲜水泡皮3g～5g放入灭菌容器中，置于灭菌的30%或50%甘油磷酸盐6采集新鲜的粪便≥10g,保存于带螺帽的容器或灭菌塑料袋中送检，采集肠道内容物样品，可将病变最明显的胃肠部分两端结扎，从两端剪断，置于灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液中送检。6.1.5.1组织块或50%甘油磷酸盐保存液中送检。灭菌牙签挑至灭菌离心管中保存。采样器使用前用2%氢子放回采样管浸润，取出后再次涂抹采样，重复3次以上。采集血槽、泔水等污水样品时，用拭子直接浸入吸附污水，应多点分布式采样。6.1.6.3同一动物的环境样品同一动物的环境样品可置于同一容器中，置于灭菌的30%或50%甘油磷酸盐保存液中送检。6.3采样记录6.3.1采样人员做好样品信息记录，填写采样登记表，确保样品及相关信息可追溯。6.3.2采样登记表应准确记录采样时间、地点，畜主姓名、联系方式，样品种类、数量、编号，采样动物信息(畜种、品种、年龄、性别及标示号)及免疫状况(免疫时间、疫苗和类、疫苗生产厂家及批号等)。6.3.3疑似感染动物采样时，记录同群动物数量、饲养管理情况、发病过程、临床症状、用药情况。6.3.4采样登记表用钢笔或签字笔填写，采样人和被采样单位签章，一式三份，采样单位一份、被采7样单位一份、随样一份。7.1样品送检应符合《病原微生物实验室生物安全管理条例》第2章的规定。7.2采取有效措施确保样品安全、完整、无泄漏，严防发生被盗、丢失7.3样品由专人管理，运送人员和接收人员对样品进行双签收，核对样品来源、种类、数量、保存方法、送检单位和送检人的联系方式、送检日期等信息。接收人员在现场对样品进行编号、登记。7.4疑似阳性样品送至省级动物疫病预防控制机构进行检测，同时附采样登记表及相关情况说明。8样品保存与包装样品采集后应尽快送往实验室，24h内能检测的样品可置于4℃冷藏保存；24h内无法检测的样品置于-20℃冷冻保存(细菌类检测样品除外)。设立专柜单独保存样品。如需长途运输，样品应在冷藏和密封状态下运输，于保温箱中加冰袋保存。样品运输期间应避免反复冻融。8.2样品包装8.2.1样品处理的生物安全措施应符合《兽医实验室生物安全技术管理规范》第6章的规定。8.2.2样品盛放在密封、无菌、耐冷冻的容器里，容器外注明样品种类、编号及采样日期。血清、拭子放在离心管里，食道-咽部分泌物(0-P液)放在带螺旋盖的样品采集管里，组织、粪便样品放在大小适合的带螺旋盖的样品采集管或密封袋，每管/袋限一份样品。8.2.3将密闭后的样品装入密封袋，同一采样地点的同类型样品可装入同一个密封袋，不同类型样品分别包装，避免样品间交叉污染。密封袋外贴封条和标签，注明采样地点、样日期等信息，封条上有采样人签章和贴封日期。8.2.4样品运输包装应符合《高致病性动物病原微生物菌(毒)种或者样本运输包装规范》的规定，使用密封三层包装，外包装上贴生物危险标识。8.2.5将采样登记表放入一个独立的密封、防水的包装袋内，随样品一起送达实验室。8(规范性)相关试剂的配制A.10.1mol/L磷酸盐缓冲液(ph7.4)称取NaC180.0g、KC12.0g、Na₂HPO₄·12H₂030.0g、KH₂后加蒸馏水定容至1000mL,4℃冰箱保存。A.20.01mol/L磷酸盐缓冲液(ph7.4)量取0.1mol/L磷酸盐缓冲液(ph7.4)100mL,加入900mL蒸馏水，混匀，103kPa高压蒸汽A.30.04mol/L磷酸盐缓冲液(ph7.4)量取0.01mol/L磷酸盐缓冲液400mL