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文档简介

微生物的培养技术及应用第一课时微生物的选择培养和计数课前导入

自然界中微生物数量繁多,种类庞杂,要想从中分离出需要的特定微生物并不容易,尤其当要分离的微生物在混合菌群中不是优势种群时,更难实现。那么我们又如何达成这一目标呢?1973年,科学家从美国黄石国家公园的热泉中筛选出水生栖热菌,进而从这种菌中提取出耐高温的DNA聚合酶。聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外扩增DNA片段的技术,此项技术要求使用耐高温的DNA聚合酶。寻找耐高温的DNA聚合酶筛选原因:水生栖热菌能在70-80℃高温条件下生存,而绝大多数微生物在此条件下不能生存。实例选择培养基1有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖,因此,能够在选择培养基上生长的不一定都是目的菌株。2、实验室中微生物筛选的原理

人为提供

的条件(包括

等),同时抑制或阻止其他微生物的生长。1、概念:

特定种类的微生物生长,同时

其他种类微生物生长的培养基。允许抑制或阻止有利于目的菌生长营养、温度、pH选择培养基三种常见制备方法或实例(1)添加某些特定的物质(前提是培养基具备全部营养成分)加入某些特定的物质原理举例改变培养基的营养成分培养基缺乏氮源时培养基缺乏有机碳源时依据某些微生物对某些物质的抗性,在培养基中加入某些物质,以“抑制”不需要的微生物的生长,“促进”所需要的微生物的生长(前提是培养基具备全部营养成分)加入青霉素分离得到酵母菌和霉菌可分离自生固氮微生物,非自生固氮微生物因缺乏氮源而无法生存异养微生物无法生存,而自养微生物可利用空气中的CO2制造有机物而生存选择培养基三种常见制备方法或实例(2)利用培养基“特定化学成分”分离(3)通过某些“特殊环境”分离利用培养基“特定化学成分”分离当石油为唯一碳源时当尿素是唯一氮源时当以纤维素为唯一碳源时不能利用石油的微生物不能生存,能够利用石油的微生物能生存,从而分离出能降解石油的微生物不能利用尿素的微生物因缺乏氮源而不能正常生长,能够分解尿素的微生物能利用尿素作为氮源而正常长能分解纤维素的微生物具有更多的生存机会而大量繁殖通过某些“特殊环境分离”在高盐环境中在高温环境中可分离耐盐微生物(金黄色葡萄球菌),其他微生物在—盐浓度高时易失水而不能生存可分离得到耐高温的微生物(水生栖热菌),其他微生物在高温中因酶失活而无法生存举例培养基中加氨苄青霉素培养基应有菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌被淘汰怎样选择出抗氨苄青霉素能力的细菌?具有氨苄青霉素抗性的菌落没有氨苄青霉素抗性的细菌biàn土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1、实验目的(1)从土壤中分离出能够分解尿素的细菌(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌探究·实践2、实验设计(1)明确实验原理请阅读书本16页,提出从土壤中分离出能够分解尿素的细菌的实验原理选择培养基配方的设计

尿素[CO(NH2)2]含氮量高,化学性质稳定,是现代农业生产中一种重要的氮肥。尿素施入土壤后,会被土壤中的某些细菌分解成NH3,再被转化为NO3-、NH4+等被植物吸收。而这些细菌之所以能分解尿素,是因为它们能合成脲酶,脲酶催化尿素分解产生NH3,NH3可以作为细菌生长的氮源。尿素的分子模型讨论:

1.如果让你配制一种培养基,将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来,培养基的配方该如何设计?2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点?思考·讨论脲酶尿素1.如果让你配制一种培养基,将土壤稀释液中能分解尿素的细菌分离出来,培养基的配方该如何设计?培养基的配方中应含有微生物生长所需的营养要素:碳源、氮源、水、无机盐等。但是只有能合成脲酶的微生物才能分解尿素,在培养基中加入尿素提供氮源,使培养基具有了选择作用。该培养基以尿素作为唯一氮源,只允许能以尿素作为氮源的微生物生长。2.该培养基与普通培养基有哪些共同点和不同点?该培养基与普通培养基相比较:共同点:都是以有机碳(如葡萄糖)作为碳源,都有水和无机盐;不同点:是该培养基以尿素作为唯一氮源,使只有能以尿素作为氮源的微生物生长。土壤中分解尿素的细菌的分离与计数1、提出问题(1)如何从土壤中分离出能够分解尿素的细菌?(2)统计每克土壤样品中究竟含有多少这样的细菌?探究·实践2、实验设计(2)明确实验方法——稀释涂布平板法(3)明确实验步骤1.选择培养2.计数(配置培养基—灭菌—接种—培养)(1)明确实验原理——制备以尿素为唯一氮源的选择性培养基微生物的选择培养2对样品进行充分稀释,然后将菌液涂布到制备好的选择培养基上。①铲取图样,将样品装入纸袋中——稀释涂布平板法1、方法2、操作步骤1.取样地点要求:细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长2.取样过程:铲去表层土(一般3cm左右),细菌绝大部分分布在距地表3~8cm的土壤层3.注意事项:取土样时用的铁铲和取样袋在使用前都需要灭菌。操作完成后一定要洗手组分含量KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO4·7H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0gH2O定容至1000mL②稀释(等比稀释)③涂布a.取0.1mL菌液滴加到培养基表面。b.将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中c.将涂布器放在火焰上灼烧,待酒精燃尽、涂布器冷却后,再进行涂布。b.用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面。②稀释:将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀。取1mL上清液加入盛有9mL无菌水的试管中,依次等比稀释。1×101mL1mL1mL1mL1mL1mL1×1021×1031×1041×1051×1061×1079mL无菌水(3)微生物的培养与观察①培养条件:

不同种类的微生物,往往需要不同的培养温度和培养时间。(细菌一般在30-37℃的温度下培养1-2d)②观察:每隔24h统计一次菌落数目,选取菌落数目稳定时的记录作为结果。(一般来说,在相同的培养条件下,同种微生物表现出稳定的菌落特征,如形状、大小和颜色等)主要方法稀释涂布平板法平板划线法主要步骤接种工具菌体获取能否用于计数共同点比较稀释涂布平板法和平板划线法系列梯度稀释操作和涂布平板操作涂布器从适宜稀释度的平板上的菌落中挑取菌体可以计数,但是操作复杂,需涂布多个平板都能将微生物分散到固体培养基表面,以获得单细胞菌落,达到分离纯化微生物的目的,也可以观察菌落特征。接种环在固体培养基表面连续划线接种环在具有显著的菌落特征的区域挑取菌体不能计数微生物的数量测定31.间接计数法—稀释涂布平板法①原理:当样品的稀释度足够高时,培养基表面生长的

,通过计数平板上的菌落数,就能推测出样品中大约含有多少

。②原则:一般选择菌落数在

的平板进行记数。同一稀释度下,至少对

个平板进行重复计数,然后求

。一个活菌落活菌30~3003平均值分析实验结果时,要考虑重复组结果是否接近,如果相差太大,意味着操作有误,需重新实验。★注意:统计的菌落往往比活菌的实际数目低统计的结果一般用菌落数而不是活菌数来表示测细菌时,一般选用1×104、1×105、1×106倍稀释的稀释液进行平板培养。在初次实验中,对于稀释的范围没有把握,应选择一个比较宽的范围,将1×103~1×107倍稀释的稀释液分别涂布到平板上培养,以保证能从中选择出菌落数在30~300的平板进行计数。每g样品中的菌落数=(C÷V)×MC代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(mL)M代表稀释倍数计算公式:③计数例:甲同学做此实验在稀释倍数105获得3个平板,菌落数分别是80、90、100,涂布平板时均使用0.1ml菌液,试计算每克土壤中可以分离尿素的细菌数目?(80+90+100)/30.1×105=9×107个细菌计数板血细胞计数板显微镜活菌死菌快速直观①25×16的血细胞计数板:酵母菌细胞数(个/mL)=(5个中方格内酵母菌细胞个数/80)×400×104×稀释倍数。②16×25的血细胞计数板:酵母细胞数(个/mL)=(4个中方格内酵母菌细胞个数/100)×400×104×稀释倍数。2.直接计数法—显微镜直接计数法科学思维——对比分析微生物计数的两种方法某同学在三种稀释度下取0.1mL的菌液涂布平板,统计菌落数

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