生物制药考试

1.制药链（pharmaceuticalpipeline）：从药物研发、生产制造到上市的诸多

环节和过程。

2.制药工艺辅助过程：基础设施设计与布局、动力系统、包装、储运、三废处

理等过程。

3.制药工艺学（Pharmaceuticaltechnology）：研究药物工业生产过程的共性

规律及应用的一门学科。

制药工艺研究三步骤：

IZMtlU*

IUMSStf

I

“I“一3g

KUiJt?IUI

UH

4.生长与生产关系的动力学模型（分批发酵）

按照菌体生长，碳源利用和产物生成的变化

第一类型

第二类型

第三类型

按照产物生成与菌体生长是否同步

生长关联型（第一类型）

生长无关联型（第二，三类型）

第一类型（生长关联型）..........产付比生产也睾

产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所必需的代谢），菌体生长与产物形成

不分开。

例如，单细胞蛋白和葡萄糖酸的发酵。

第二类型（部分生长关联型）

代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰。例如，柠檬酸和

某些氨基酸的发酵。

第三类型（非生长关联型）

产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产物

的形成和初级代谢是分开的。产物的形成速度与生长无关，只与细胞积累量有关。

如抗生素发酵。

5.微生物发酵基本过程特征

（分批发酵）菌体生长与产物生成的特征，主要分三个阶段：①发酵前期或菌体生长

期②发酵中期或产物合成（生产）期③发酵后期或菌体自溶期

⑴前期特征：

时间：生长期，包括延滞期、对数期和减速期。

代谢特征：碳源、氮源等基质不断消耗，减少。

生长特征：菌体不断地生长和繁殖，生物量增加。

溶氧变化：不断下降，菌体临界值时，浓度最低。

pH变化：先升后降一先氨基酸作为碳源，释放出氨，而后氨被利用。先降后升一先用

糖作为碳源，释放出丙酮酸等有机酸，后又被利用

⑵中期特征

时间：生产期，以次级代谢产物或目标产物的生物合成为主的一段时间，主要静止期。

菌体生长：恒定，不增加菌体数目。

呼吸强度：无明显变化。

产物量：逐渐增加，生产速率加快，直至最大高峰，随后合成能力衰退。

对外界变化敏感：容易影响代谢过程，从而影响整个发酵进程。

⑶后期

菌体：衰老，细胞开始自溶的一段时间。

产物合成能力：衰退，生产速率减慢。

pH：上升，氨基氮增加。

发酵控制：必须结束，否则产物被破坏。

菌体自溶给过滤和提取等带来困难。

6.菌种库建库流程

质保实验室,

保存实验室,

主菌种库MCB：来源于原始菌种或细胞培养物

工作菌种库WCB：由主菌种库或主细胞库繁殖而来

QC:质量控制

7.前体及其他因子的选择直接参与抗生素生物合成并组成其结构的一部分小分子化合

物，称为前体。前体可以是产物的中间体，也可以是其中的一部分。

促进产物生成的物质为促进剂，其不是营养物，也不是前体的一类化合物。

消泡剂的作用是消除泡沫，防止逃液和染菌。

8.分批灭菌的优缺点优点

(1)设备要求低，不需要另外设置加热、冷却装置

(2)操作要求低，适于手动操作

(3)适合于小批量生产规模

(4)适合于含有大量固体物质的培养基的灭菌

缺点

(1)、培养基的营养物质损失较多，灭菌后培养基的质量下降

(2)、需要进行反复的加热和冷却，能耗较高

(3)、不适合大规模生产过程的灭菌

(4)、发酵罐的利用率低

9.连续灭菌的优缺点

优点

(1)灭菌温度较高，可减少培养基中营养物质的损失

(2)操作条件恒定，灭菌质量稳定

(3)易于实现管道化和自动化操作

(4)避免了反复的加热和冷却，提高了热的利用率

(5)发酵设备利用率高

缺点

(1)对设备的要求高，需另外设置加热、冷却装置

(2)操作较繁琐

(3)不适合于含大量固体物料的灭菌

(4)染菌机会较多

(5、对蒸汽的要求高

10.空气中微生物的分布：

空气中微生物的含量和种类，随地区，季节和空气中灰尘粒子多少以及人们的活动

情况而异。

北方气候干燥、寒冷，空气中的含菌量较少，离地面越高，含菌量越少；

般每升高10米，空气中的含菌量就降低一个数量级。

城市的空气中含菌量比农村的空气中含菌量多。

空气中的微生物种类以细菌和细菌芽胞楚多，也有酵母，霉芭和病毒。

微生物大小不一，球菌的直径一般在0.5—2口01,杆菌一般长lFum,宽为0.5—111m,

酵母则个体更大。了些微生物一般附着在空气中的灰尘上或雾滴上，空气中微生物

的含量一般为103—104个/m3。

灰尘学子的平均大小约0.6pm左右，所以空气除菌主要是去除空气中的微粒

(0.6~1pm)。

空气中尘埃数与细菌数的关系如下：丁=0-003内-2.6

11.空气除菌要求工业发酵对空气处理的要求

随发酵产品和菌种不同而异；

半固体制曲和单细胞蛋白的生产中无菌要求不十分严格，一般无需复杂的空气净化

处理；

密闭的深层通气发酵需严格的纯种培养，进入发酵罐前空气必须进行冷却、脱水、

脱油和过滤除菌等处理。

12.严格纯种发酵对空气无菌程度的要求

(1)连续提供一定流量的压缩空气。VVM的意义受单位时间(min)单位体积(m3)培养

基中通入标准状况下空气的体积(m3),一般为0.2~2.0。

(2)进入过滤器之前，空气的相对湿度6W60]or70)。

(3)进入发酵罐的空气温度可比培养温度高10-30。€\

(4)压缩空气的洁净度，在设计空气过滤器时，一般取失败概率为10-3为指标。

13.两级分离、冷却、加热除菌流程

图6-4两级冷却、加热除菌流程

1通过滤器2-压缩机3-归端4,6-冷却器5-旋风分离器7-丝网分离器8-加热器9-过滤器

14.高效前置过滤除菌流程

1-高效前置过滤器2-压缩机3-贮罐4-冷却器5-丝网分离器6

-加热器7-过滤器

15.种子应具备的条件

菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；

生理状态稳定；

茵体总量及浓度能满足大容量发酵罐的要求；

无杂菌污染，保证纯种发酵；

保持稳定的生产能力

16.影响种子质量的因素

(1)原材料质量。培养基中所含的营养成分含量发生变化，影响种子的质量，如微量

元素Mg2+、Cu2+、Ba2+能刺激施子的形成，磷含量太多或太少也会影响抱子质量。

(2)培养温度。温度对多数微生物的斜面抱子质量有显著影啊。

(3)湿度。湿度低，抱子快；湿度大，抱子生长慢。

(4)通气量。在种子罐中培养的种子除保证供给易于利用的营养物质外，应有足够的

通气量，以保证菌种代谢正常，提高种子的质量。

(5)斜面冷藏时间。斜面冷藏对抱子质量的影响与施子的成熟度有关，抱子成熟，

则不易导致菌体细胞自溶；冷藏时间对施子的生产能力也有影响，通常冷藏时间越

长，生产能力下降越多。

17.分批发酵的定义:是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。在这一过程中,

除了氧气、消泡剂及控制pH的酸或碱外，不再加入任何其它物质。发酵过程中培养基

成分减少，微生物得到繁殖。

分批发酵的特点：微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物

参数都随时间而变化，是一个非衡态的过程。

优点

操作简单；

操作引起染菌的概率低。

不会产生菌种老化和变异等问题

缺点

非生产时间较长、设备利用率低。

18.补料分批发酵定义：补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发

酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。

优点

使发酵系统中维持很低的基质浓度；

和连续发酵比、不需要严格的无菌条件；

不会产生菌种老化和变异等问题。

缺点

存在一定的非生产时间；

和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。

19.连续发酵定义：培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵

液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产

物浓度、恒定的pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。

优点

能维持低基质浓度；

可以提高设备利用率和单位时间的产量；

便于自动控制。

缺点

菌种发生变异的可能性较大；

要求严格的无菌条件。

20.染菌的检查与判断

从三方面进行：1）无菌试验2）显微镜检查3）生理生化指标的变化

21.杂菌的检查方法

①显微镜检查：染色、镜检。多在染菌程度较深时，用于判断杂菌的种类，靠显微镜

无法发现染菌初期的杂菌。

②平板划线检查或斜面培养检查：倒平板、空培养、待测样品划线、培养观察

③酚红肉汤培养检查：无菌肉汤培养基空培养、接入样品、培养观察

④通过发酵的生理生化指标检查

在实际生产中可以根据以下参数的异常变化来判断是否染菌。结合计算机控制，建模

后，可以及早发现与预测是否染菌。降糖速度产酸速度，pH值溶解氧光密度，排气中

CO2含量，产物含量，02的消耗。

22.种子带菌的原因及防止带菌的原因

无菌室的无菌条件不符合要求

培养基灭菌不彻底

操作不当

种子带杂菌是发酵前期染菌的原因之一。在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平

板、肉汤培养，检查种子中是否带杂菌。

23.无菌室的基本要求

无菌室面积不宜过大，一般约4―6米2高约2.6米。

为了减少外界空气的侵入，无菌室要有「3个套间（缓冲过道）

无菌室内部的墙壁、天花板要涂白漆或采用磨光石子，要求无裂缝，墙角最好做成圆弧

形。

室内布置应尽量简单，最好能安装空气调节装置，通入无菌空气并调节室内的温湿度。

无菌室的每个套间一般都用紫外线灭菌

24.发酵设备、管件的渗漏、死角

对于设备的灭菌主要是为了避免“死角”和渗漏。

常见的“死角”

A、法兰连接的死角。发酵工厂的管路要保持光滑、通畅、密封性好，以避免和减少管

道染菌的机会。

B、罐底与环式空气分布管所形成的死角

C、不锈钢衬里的死角

D、接种管路的死角

E、排气管的死角

25.试漏方法

气压试验：先在发酵罐内放满清水，用压缩空气通入管子，观察水面有无气泡产

生以确定管子有否渗漏和渗漏的部位。气压法快速方便。

水压试验：用手动泵或试压齿轮泵将水逐渐压入冷却管，到一定压力时，观察管

子有否渗漏现象

26.温度对发酵过程的影响及控制

(1)、温度对微生物的影响，不仅表现为对微生物表面的作用，对微生物内部的所有

结构物质都有作用。

(2)、温度对酶的影响，酶很容易受热失活，温度越高，失活越快，从而影响发酵过

程的最终产物产量。

(3)、温度可以通过改变培养液的物理性质，间接影响微生物细胞的生长。如，溶解

氧浓度。

(4)、温度影响到微生物的生物合成方向，温度低于30度，金色链霉菌生成金霉素,

温度高于35度，金色链霉菌生成四环素。

(5)、一般生长阶段与生产阶段对温度的要求不同(前高后低)

(6)、影响产物的稳定性(降低温度)

27.pH值对发酵过程的影响及控制微生物细胞生长最适pH

微生物的正常生*需要一定的pH值，不同微生期对pH值的要求也不同。大多数细菌

的最适pH值为6.5—7.5;事菌的最适pH值为4.0—5.8;酵母的最适pH值为3.8-6.0;

放线菌的最适pH值为6.5~8.0

pH值对微生物生长和代谢产物形成产生影响

1)pH值影响微生物细胞原生质膜的电荷，引起原生质膜对个别离子渗透性的改变,

从而影响到微生物对营养物质的吸收和代谢产物的渗漏。

2)pH值会直接影响到微生物细胞内的酶活性

3)pH值会影响到培养基中某些重要的营养物质和中间代谢产物的解离，从而影响到

对这些物质的吸收和利用。

28.CO2的影响及其控制。尾气分析一呼吸炳(Respiratoryquotient,RQ)

CQ生成速率

Q=/消耗速率

29.发酵过程泡沫的影响及控制泡沫的副作用

1)使发酵罐的装填系数减少；

2)造成大量逃液，导致产物损失；

3)泡沫“顶罐”有可能使培养基从搅拌的轴封渗出，增加染菌机会；

4)由于泡沫的液位变动，以及不同生长周期的微生物随泡沫漂浮或黏附在罐盖或罐壁

上，使微生物生长的环境发生了变化，影响了微生物群体的效果，增加了微生物群体的

非均一性；

5）影响通气搅拌的正常进行，妨碍了微生物的呼吸，造成发酵异常，导致最终发酵产

物产量下降；

6）使微生物群体提早自溶，这一过程的发展又会促进更多泡沫的生成。

30.青霉素的优点是毒性小，但其降解物或聚合物易引起免疫变态反应，即过敏反应，

临床应用前需要进行皮试。

青霉素的缺点是对酸不稳定，不能口服，排泄快，对革兰氏阴性菌无效。

青霉素的理化性质

青霉素是有机酸，易溶于醇、酸、酸、酯类。

在水中溶解度很小，且很快失去活性。

青霉素G的pK值为2.76,能与无机或有机碱成盐。

青霉素盐极易溶于水，但难溶于有机溶剂

温度的影响和控制

pH的影响和控制

溶氧的在线控制

消泡

31.青霉素的分离纯化工艺过程

青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活；

水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定；

易溶于有机溶剂，水中溶解度很小；青霉素盐很稳定，降解产物具有致敏性；

防止降解，条件需温和、快速。

青霉素的提取和精制

32.溶剂萃取法原理：

青霉素与碱金属所生成的盐类在水中溶解度很大，而青霉素游离酸易溶解于有

机溶剂中。

33.

萃取（extraction）是利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分

离纯化操作，所以，萃取操作中至少有一相为流体，一般称该流体为萃取剂

（extractant）

逆流萃取过程

—正向萃取：酸化pHl.8—2.0,滤液:醋酸丁酯=1:0.3,碟片式离心机分离（浓缩

1.5-2.1倍）

33.反相萃取：pH6.8—7.4（磷酸盐、碳酸盐缓冲液）。把青霉素从丁酯中提取到缓冲液

中。

反"萃取2—3次，达到结晶要求。

萃取条件：10℃o萃取罐冷冻盐水冷却。

萃取方式

⑴单级萃取。单级萃取只包括一个混合器和一个分离器，

⑵多级萃取

多级错流萃取

多级逆流萃取

34.抗生素后效应（PAE）指细菌与抗生素短暂接触，当药物浓度下降，低于最低抑菌浓

度（MIC）或清除后，细菌的生长仍受到持续抑制的效应。

35.链霉素发酵条件及中间控制要点

⑴溶氧的影响及控制

链霉菌的临界溶氧浓度（criticalvalueofdissolvedoxygenconcentration）

约%0.001mol/L在100L发酵罐中，搅拌转速应在300—500rpm

（2）温度的影响及控制链霉素发酵温度以左右为宜。

⑶pH值的影响及控制_

链霉菌菌丝生长的pH值约为6.5-7.0,而链霉素合成的pH值约为6.8-7.3

（4）中间补料控制

补碳解除葡萄糖对甘露糖昔酶的分解阻遏作用，调节pH

补氮硫酸锭和氨水的控制指标，是以培养基的pH值和氨基氮的含量高低为准。如

氨基氮含量和pH值都较低，可加入氨水；如pH值较高，就补硫酸镀溶液。

36.链霉素生物合成的途径及代谢调节机制

D-葡萄糖和NH3合成链霉素的大致途径如上图所示

37.红霉素发酵液中有多种组分，以红霉素A

38.三废处理

废水：主要是菌渣的分离、纯化、精制及原材料和设备的清洗生产车间地面的冲洗

所产生的废水。

废渣：主要是培养基中的营养废渣和发酵后产生的菌渣。

废气：主要指在发酵过程中产生的有异味、有害的气体。

流程：废水一A1C13沉淀池一酸发池（pH7.3）—厌氧塔一中央调控池一曝气池一检测

（COD<300）一排放

废渣处理一般流程：

।废渣处理一般流程:

废气处理

（1）生产过程中产生的恶臭气体，被收集在密封系统里，通过收集风管和风机，将

密封系统里的臭气，首先抽引到预处理进行前处理，再送至复合光催化金属裸网单

元。在C波段紫外灯照射下，分解部分臭气成分，再高空排放。

（2）塔式处理方法，如图所示：

生物制药废气|PLD-洗涤净化牢—》pLD-加压喷淋瑁一》pLD-催化氧化

IDDBD等离子闱—►好处理塔1»排气,

39.四环素类抗生素理化性质_

⑴金黄色结晶粉末、味苦。熔点170~173℃o

⑵不易溶于水（低于pH4的酸或高于pH8的碱溶液中，溶解度很高。

⑶在弱极性溶液中，四环素的溶解度较小或不溶；在有机溶剂中，四环素及其盐酸盐的

溶解度接近。

⑷与金属离子形成不熔螯合物，如：钙离子（吸收受乳制品及二、三价阳离子影响一配

伍禁忌

⑸两性化合物（等电点处以游离碱形式存在）

酸性基团：酚羟基、烯醇羟基

碱性基团：二甲氨基（制备成盐酸盐供临床应用）

四环素类药物在干燥条件下稳定。但遇光、氧色加深。在碱性溶液中不够稳定，或

药效显著降低、或产生毒性（密闭、防潮、避光保存）40.在谷氨酸发酵中，如果能

够改变细胞膜的通透性，使谷氨酸不断地排到细胞外面，就会大量生成谷氨酸。

研究表明，影响细胞膜通透性的主要因素是细胞膜中的磷脂含量。因此，对谷氨酸

产生菌的选育，往往从控制磷脂的合成或使细胞膜受损伤入手，如生物素缺陷型菌

种的选育。生物素（维生素HCoA的辅酶。生物素缺陷型菌种因不能合成生物素，从

而抑制了不饱和脂肪酸的合成。而不饱和脂肪酸是磷脂的组成成分之一。因此，磷

脂的合成量也相应减少，这就会导致细胞膜结构不完整，提高细胞膜对谷氨酸的通

透性

41.腺酶活性强

能将尿素（腺）分解为氨和二氧化碳或碳酸核的酶。

42.淀粉糖化工艺酸水解工艺

液化：淀粉原料加盐酸，PH1.5

糖化:蒸汽加热，300kPa左右，25min

冷却：80℃

中和：加碱，PH4-5,析出蛋白质和胶体

脱色：除去色素和杂质(抑制发酵)一活性炭吸附和树脂

过滤：得到糖液，制备培养基，进入发酵阶段

43.中和：加碱，，析出蛋白质和胶体

酶水解工艺

糊化，糊化：水浴加热并不断搅拌，淀粉浆逐趣糊液化：70~80℃,a-淀粉酶不断搅拌

使其液化。灭酶过滤，滤液冷却加糖化酶在60-65C恒温水浴糖化。所形成的混合型糖

汁，主要是麦芽糖，还有葡萄糖，低聚糖、糊精等其他单糖和低聚糖的混合物。

赖氨酸生产菌的特性

44.赖氨酸生产菌的特性

①营养缺陷型突变株。利用营养缺陷型突变株发酵生产氨基酸的关键是限制某种反

馈抑制物或阻遏物的量，以解除代谢调节机制而有利于代谢中间体或最终产物的过

量积累。因此，不同氨基酸缺陷型生长在含有限量的所要求氨基酸的培养基中，往

往能产生和积累大量某种氨基酸。例如,L-赖氨酸的生产菌株多采用高丝氨酸缺陷型

突变株。

②调节突变株。采用调节突变株发酵生产氨基酸是成功的工艺之一，因为这类突变

株一旦对氨基酸结构类似物具备了抗性之后，其正常代谢调节机制即被解除，因而

能够积累大量的相应的氨基酸；

③营养缺陷型与抗反馈调节多重突变株。采用这类多重突变株对提高某些氨基酸的

发酵产率有明显的效果。例如，生产L-精氨酸、L-色氨酸、L-苯丙氨酸、L-酪

氨酸、L-白氨酸和L-苏氨酸等就常采用多重突变株。

45.维生素c莱氏法化学合成工艺

(1)双酮糖法：D-葡萄糖为原料，经过催化氢化生成D-山梨醇，然后生物氧化转变为

L-山梨糖，酸性液中丙酮化，对a,B-二仲醇进行保护。

高镒酸钾在碱性溶液中，氧化为二丙酮-2-酮-L-古龙酸，除去丙酮，内酯化和烯醇

化，得L-抗坏血酸。

整个合成过程必须保持第4位碳原子的构型不变

(2)生物氧化:

醋酸杆菌(Acetobacter),发酵温度也一30℃,pH4.4-6.8,山梨醇浓度19.8%,

0.5%酵母膏为营养源，通气比，培养3(C40h,山梨糖的收率达97%以上。

46.两步发酵生产工艺

两条工艺的比较

从L-山梨糖至2-酮基-L-古龙酸的步骤不同：

省去了丙酮化反应和化学氧化反应

节约丙酮、硫酸、高镒酸钾、氢氧化钠等原料试剂，防爆设备

三废和污染小，提高了生产能力

47.维生素B2的新用途

(1)用于治疗心绞痛

维生素B2可以改善心脏的血液供应。

(2)用于防治偏头痛

偏头痛是由于脑细胞的能量储备减少所致。而维生素B2则能提高脑细胞内线粒体的

潜能。

(3)防治癌症

科学家研究发现，若维生素B2缺乏，可增强化学致癌物的致癌作用。因此日常生活

中多补充维生素B2可防治癌症。

48.维生素B12

(1)是唯一含必须矿物质的维生素，因含钻而呈红色，又称红色维生素，是少数有

色的维生素。

(2)维生素B12是需要一种肠道分泌物(内源因子)帮助才能被吸收的唯一的一种

维生素。有的人由于肠胃异常，缺乏这种内源因子，即使膳食中来源充足也会患恶

性贫血

(3)叶酸(维生素M)是一种重要的维生素，它与B12一起有利于血红细胞形成，

预防贫血。

49.维生素B12的生产方式

(1)抗生素废液提取

(2)放线菌发酵

(3)下水道废水中提取

(4)丙酸菌发酵(目前最常用的方法)

(5)巨大芽袍杆菌中提取

(6)转基因大肠杆菌生产

50.基因工程菌

概念：以微生物为操作对象，通过基因工程技术获得的表达外源基因，或过量表达

或抑制自身基因的工程生物体。

种类：基因工程大肠杆菌和酵母：重组蛋白质药物

基因工程技术改造出发菌：氨基酸、抗生素、管体激素、中间体生

51.大肠杆菌表达系统的问题

缺点:

1)缺乏翻译后修饰，如糖基化

2)常形成包涵体，复性效果差

3)蛋白质易被降解

4)内毒素难以除尽，产生热源

5)N端增加的蛋氨酸容易引起免疫反应

优点：

1)简单，经济，快速

2)适合于制备抗体，供下游研究

52.酵母表达系统

(1)形态特征

细胞：单细胞真核生物，球形，椭圆形，卵形

繁殖：芽殖、裂殖，在特定条件下才产生子囊抱子

菌落：乳白色，有光泽，边沿整齐

(2)生长与遗传特征

两个性别不同的单倍体细胞结合形成二倍体结合子或营养细胞，进行芽殖。

能发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖等。

生长繁殖迅速，倍增期约2h

酿酒酵母有17条染色体

(3)优点与不足

载体：安全、无毒

营养缺陷选择外来质粒

培养条件简单，大规模培养技术成熟

亚细胞器分化，进行蛋白质的翻译后正确修饰和加工，并具有良好的蛋白质分泌能力

缺点:

酿酒酵母发酵产生乙醇，制约了高密度发酵

修饰的蛋白质糖基化侧链过长，会引起副作用

53.毕赤酵母表达系统

(1)酿酒酵母表达系统Saccharomycescerevisiae过去常用

毕赤酵母Pichiapastoris现在多用

(2)Pichiapastoris表达系统

Pichiapastoris是甲醇利用型酵母，可以用甲醇作为唯一的碳源；

易操作，培养容易；

表达量高，可达培养液中10g/L;

可以有真核生物的翻译后修饰，如糖基化；

避免了酿酒酵母的过糖基化问题。

54.毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：

1.蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。

2.操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它

真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。

3.同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋

白表达水平是后者的十倍以至百倍。

55.毕赤酵母系统的注意事项

(1)严格无菌操作，防止污染；可以镜检

(2)温度W30(C

(3)转化

(4)PCR检测

⑸诱导时间

56.蛋白质糖基化

蛋白质的糖基化是真核生物的一种常见的翻译后修饰方式；

糖基化影响蛋白折叠、定位、转运、生物活性、可溶性、抗原性、半衰期

57.酵母蛋白糖基化

酿酒酵母与毕赤酵母大多数为N-连接糖基化高甘露糖型；

然而毕赤酵母中蛋g转录后所增加的寡糖链长度(平均每个支链8~14个甘露糖残基)

比酿酒酵母中的(50—150个甘露糖残基)短得多；

酿酒酵母核心寡糖有末端a-L,3聚糖连接头，而毕赤酵母则没有。一般认为a-1,3

聚糖接头与蛋白的超抗原性有关，使得这些蛋白不适于治疗应用。

58.RNA提取注意事项

严格防止RNA酶污染

1.佩戴一次性手套

2.玻璃器皿可以在250。。烘箱中烘烤3小时

3.枪头、Eppendorf管用0.1%DEPC(搅拌搅匀)水中浸泡。通风橱中室温过夜，扣

去液体，高压灭菌30分钟。

DEPC(diethypyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)为剧毒物，活性很强，小心在通风

柜中使用。

4.DEPC处理的水：0.1%DEPC处理，高压灭菌30分钟脱毒

5.防止环境中RNA酶污染

59.转化后细胞筛选与鉴定

转化后的细胞类型

非转化子：没有导入外源DNA的非转化宿主细胞

转化子：导入外源DNA的转化细胞

非重组子：仅含有空载体分子的转化子

重组子：含有重组DNA分子的转化子

非目标重组子：连接不正确的重组子

目标重组子：含有连接正确的重组子(目的)

60.蓝白斑筛选-a互补原理

质粒lacZ标记基因，编码产物为B-半乳糖普酶N端146aa,无活性，a受体。

大肠杆菌染色体DNA：编码C端部分序列，无酶活性，a供体。

受体与供体结合，恢复B-半乳糖甘酶的活性，从而将无色X-gal底物水解成蓝色产

物。

有外源基因，白色菌落；

无外源基因，蓝色菌落.

61.表达筛选与产物鉴定

不同菌种的表达筛选

诱导表达时间和诱导强度的筛选

产物存在形式和存在场所的鉴定

一胞外，周质，胞内；包涵体，可溶性蛋白

表达产物结构与活性鉴定

一电泳，SDS,等电点电泳

一免疫杂交，末端测序，质谱分析

一分析与目标产物的同一性

基因工程菌不同诱导时间下的表达

在不同诱导时间，取样，电泳

随着诱导时间的延长，表达量增加

62.产物诱导

(1)化学诱导表达

化学诱导型启动子：lac、tac、T7等

诱导时间：对数生长期

细菌：IPTG诱导

甲基营养型酵母：甲醇诱导

(2)温度诱导表达

温度诱导型启动子：PL、PR

两段培养发酵

诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。

63.干扰素(interferon,IFN)

干扰素是最早发现、研究最多、第一个被克隆、第一个用于临床治疗疾病的细胞因子。

干扰素是机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过

抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。

在正常个体的脾脏、肝脏、肾脏、外周血淋巴细胞和骨髓中都可以检出。

64.天然干扰素的分类与命名

根据世界卫生组织规定，将人细胞所产生的几种干扰素，按其抗原性不同分为a、

B和Y三类，Le干扰素即为。-干扰素(洋2(1),F干扰素为0干扰素(IFN-B)。

T-干扰素即Y干扰素(IFN-Y)

65.干扰素抗病毒作用的特点：

(1)不能杀死病毒，仅仅是抑制作用；

(2)对病毒没有直接的作用，通过细胞核内的基因产生蛋白质因子发挥作用，因此

不同细胞对干扰素的敏感不同；

(3)病毒大量复制时引发细胞炎症应答，此时干扰素易产生作用；

(4)当病毒DNA已整合到宿主细胞的染色体中时，干扰素不能发挥其抗病毒活性。

66.干扰素抗肿瘤作用机制

肿瘤细胞：无限繁殖能力；转化能力；滋润能力。

干扰素抗肿瘤作用机制：

(1)直接抑制肿瘤细胞

(2)调节宿主抗肿瘤免疫反应

(3)改变宿主与肿瘤细胞的关系

67.干扰素的免疫调节活性

免疫是机体识别和排除抗原异物，起维持机体的生理平衡和稳定的功能。

包括三部分：免疫监视系统、免疫防卫系统和免疫自稳系统。

在异常情况下，免疫会产生排斥性反应，对机体造成损伤。

68.干扰素的生产工艺研究

(1).体外诱生干扰素制备工艺：仙台(Sendai)病毒诱导人白细胞

(2)人源转化细胞系培养生产工艺

(3)基因工程大肠杆菌发酵生产工艺

(4)动物无限细胞系培养生产工艺/

(5)基因工程假单胞杆菌发酵生产工艺：宿主：腐生型假单胞杆菌

表达产物：无糖基化可溶性蛋白质，具有天然分子结构和生物活性。

69.干扰素分离工艺过程

(1)菌体裂解

(2)预处理

(3)初级分离

1.菌体裂解_

裂解缓冲液：纯化水配置，2℃~10℃(pH7.5)

使用保护剂：DTDE(硫二乙醇)、EDTA(乙二胺四乙酸)、PMSF(苯甲基磺酰氟)

将-20C冷冻的菌体破碎成2cm以下的碎块

搅拌：加裂解缓冲液，2℃~10℃,搅拌2h

冻融：细胞完全破裂，释放干扰素

2.预处理

加絮凝剂聚乙烯亚胺：2℃j0℃,气动搅拌45min,对菌体碎片进行絮凝。

加凝聚剂醋酸钙溶液：2℃-10℃,气动搅拌15min,对菌体碎片、DNA等进行沉淀。

3.初级分离

盐析：4mol/L硫酸锭，2℃-10℃,搅匀静置过夜

离心:连续流离心机，16000rpm

保存：收集沉淀，粗干扰素，4℃(不得超过3个月)

70.干扰素分离工艺的控制要点

(1)使用保护剂

干扰素中的疏基极易被氧化成二硫键，所以必须使用疏基试剂如硫乙二醇(DTDE)加

以保护；

金属离子是酶的激活剂和辅助因子，加入金属螯合剂EDTA可除去金属离子，从而抑

制酶的活性；

PMSF是丝氨酸蛋白酶和黄基蛋白酶的抑制剂，加入后保护目标产物以免被水解。

(2)使用絮凝剂

加入聚乙烯亚胺产生絮凝作用。

影响因素：絮凝剂种类、用量、溶液pH、搅拌速度和时间等。

浓度不易过高，否则会吸附饱和，在胶粒表面形成覆盖层而失去与其他胶粒架桥的作

用，影响絮凝效果，同时会包裹一些目标产物，造成损失。

过高剪切力会打碎絮团，因此适当的搅拌时间和速度可以提高絮凝效果。

加入时注意不要使溶液局部絮凝剂的浓度过高，否则会削弱沉淀作用。

(3)使用凝聚剂

加入醋酸钙产生凝聚作用。

菌体及其碎片大多带负电，由于静电引力作用将溶液中的带正电的粒子吸附在周围，

形成双电层的结构，水化作用是胶体稳定存在的一个重要原因。

加入醋酸钙的作用是破坏双电层和水化层，使粒子间的静电排斥力不足以抵抗范德华

力而聚集起来。

71.细胞代谢特性一糖代谢

葡萄糖代谢：糖酵解为主，生成丙酮酸进一步被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培

养液中积累。另一条途径为丙酮酸转化为乙酰辅酶A,经TCA循环，彻底氧化产生C02

和水。还有一小部分葡萄糖进入戊糖磷酸途径(PPP)，生成4、5、7碳糖和还原力NADPH,

五碳糖用于核酸合成。

72.细胞代谢特性一氨基酸代谢

流加葡萄糖或谷氨酰胺，控制整个代谢过程，避免有毒废物的积累。

73.细胞周期与凋亡

四个阶段：_

M期:分裂期，很短，0.5~lh

分裂间期=61+5+62

G1期：DNA复制前期，不同细胞持续时间差异大；生长和繁殖旺盛的时间短，老化和

衰退的时间长。

S期：DNA合成期，6—8111细胞敏感，突变或癌变。

G2期：DNA复制后期，2-5ho

GO期(停滞状态)和G1期，它们之间有一个控制点，多数细胞都停留在G0期，只

有通过控制点的细胞才能继续分裂，其余细胞只能分化或衰老死亡。

正常细胞不增殖，被滞留在G0期。

对功能分化的细胞，G0期相对较长，如腺细胞、淋巴细胞、结缔组织细胞等，在一

定条件下可返回增殖状态，如肝细胞，在复杂条件下也能体外培养。

以增殖为主的细胞，G0期较短，无分化，如胚胎细胞、干细胞和肿瘤细胞等，易于

体外培养，成活率高。

74.细胞死亡的两种方式：

坏死：环境因素或病原物入侵，细胞受到严重伤害时快速膨胀，染色质凝聚而死亡,

细胞直接裂解。特征是坏死过程不受细胞自主控制。

细胞凋亡：细胞对环境变化作出的有计划的、执行预定程序的死亡应答过程。特征是

细胞收缩，细胞核和DNA断裂，同时被膜包裹形成带凋亡小体。

75.昆虫表达系统

优点：

家蚕完成基因组测序。

安全：杆状病毒对脊椎和哺乳动物无致病性，遗传上是安全的表达载体，产品安全性

受FDA认可。

易饲养：家蚕丧失了野外生存能力，人工易饲养，发育快。

高量表达：强启动子，外源基因可超量表达。

高效表达：可容纳较大的外源基因(12kb),表达数个外源基因，如抗体，并且装配

成有功能的分子

翻译后的加工：能进行一系列翻译后的加工修饰，包括糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸

化、氨基酸的乙酰化、氨酰化等，大部分产物显示出良好的活性。

其不足：

①重组率低，筛选困难，周期长，需要4-10d。

②高水平表色不连续且时间短：外源基因的表达在转委的晚期，大约在20h后起始基

因表达，在72—94h细胞裂解死亡，基因表达时间约3(F50h。

③加工途径与哺乳动物细胞不完全相同：不提供复杂的N糖基化，如添加半乳糖和唾

液酸残基，有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等变化。

④修饰效率可能不高：表达水平非常高，加工装备跟不上。

因此，有效的病毒表达载体，特别是决定基因表达时期的启动子选择和无血

清培养基的昆虫细胞系，是今后的研究开发的主要方向。

76.哺乳动物细胞表达系统

(1)有限细胞系

概念：生长和寿命有限的细胞，经过若干传代培养后失去增殖能力，老化死亡。

(2)无限细胞系

概念：寿命和活性不受传代次数影响的细胞系，可连续培养。也称为永久细胞系或连

续细胞系。如肿瘤细胞，属于异倍体无限细胞系。

77.细胞系与细胞株

原代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。

从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过传代培养后的细胞，即称之

为细胞株。

78.动物细胞的表达载体

病毒载体：逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒

质粒穿梭载体：由质粒和表达筛选盒组成。

动物细胞中表达功能

动物细胞中复制筛选功能

大肠杆菌中复制筛选功能

79.转染与培养

转染：外源基因导入哺乳动物细胞的技术统称。

脂质体是磷脂分散在水中时形成的脂质双分子层，又称为人工生物膜。最初，人们只

是运用脂质体模拟生物膜，研究膜的构造及功能，从而发现了膜的融合及内吞作用，因

而可用作外源物质进入细胞的载体。

阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用将DNA分子包裹入内，

形成DNA一脂复合体，也能被表面带负电荷的细胞膜吸附，再通过膜的融合或细胞的内

吞作用，偶尔也通过直接渗透作用，将DNA传递进入细胞。

80.磷酸钙转染

物理方法：

基因枪、显微注射、电击穿孔

生物转染.病毒

病毒感染细胞的过程：吸附，脱壳，核酸进入，进入细胞核，整合

81.动物细胞培养基

培养基研究的关键：不同细胞系所需基本成分相同，但浓度和用量不同。

激素与附加成分

激素：调节细胞的生长（刺激作用），胰岛素。

贴附因子：细胞的贴壁生长必需，胶原。

脂类：不饱和脂肪酸亚油酸、固醇等。

82.动物细胞培养基的种类

天然培养基，合成培养基，无血清培养基

血清成分与作用

含有基本的营养成分：补充合成培养基成分的不足。

脂类和微量元素：磷脂、胆固醇、铜、锌、钻、钥、硒。

缓冲物质：钾、钠、氯、铁、钙等，稳定pH和渗透压。

激素和生长因子：胰岛素、前列腺素、皮质醇、雌二醇。

贴附和延伸因子：纤维结合蛋白、软骨素、胶原等。

载体蛋白：白蛋白、转铁蛋白

蛋白酶抑制剂：降解细胞死亡的蛋白；消除毒素和金属毒性。

蛋白质：抗机械剪切，保护细胞免于损伤的作用。

来源：胎牛、新生牛或成牛、马、鸡、羊血清及人血清。

83.培养基灭菌

不含葡萄糖的溶液常规高压灭菌。

含葡萄糖时，采用过滤除菌；或115C,15mino

血清使用：需要灭活（56C,30min）,过滤除菌，按一定比例加入。4C保存。

细胞生长和基质依赖性

84.生长基质

概念：改变支持介质表面特性，促进细胞贴附的物质。

作用：为支持介质表面提供适量带电荷，细胞被吸附在介质上，实现贴壁生长。

原理：细胞、玻璃和塑料介质表面带负电荷；要使细胞贴壁，必须进行二价阳离子或

糖蛋白、其他试剂交联，使之表面成正电荷（供应商已做到）。

天然生长基质：胞外基质成分，如胶原。

人工生长基质：多聚赖氨酸

85.接触抑制

概念：细胞在生长基质上分裂增殖，逐渐汇集成片，当每个细胞与其周围的细胞互相

接触时，细胞就停止增殖。

特点：保持充足的营养，细胞仍可存活一段时间，但细胞密度不再增加。

大多数细胞：形成单层细胞，有接触抑制

少数悬浮培养细胞（癌细胞），无接触抑制

86.细胞生长的基质依赖性

贴壁依赖性细胞：依赖于生长基质，并在表面才能生长的细胞。只能贴壁生长，多数

天然细胞。

非贴壁依赖性细胞：不依赖于生长基质，可悬浮生长，也称为悬浮细胞。淋巴细胞、

杂交瘤细胞、肿瘤细胞。

兼性细胞：对生长基质的依赖性不严格，既可贴壁生长，也可悬浮生长。CHO细胞、

BHK细胞（幼地鼠肾细胞）。

87.动物细胞实验室培养技术

1、原代培养：原代细胞的培养过程

2.传代培养：过程

概念:对长满器皿表面的细胞进行消化分离,接种到新的培养基上，进行新一轮培养。

传代时期：刚刚全部汇合的细胞。

消化方法：过程与原代细胞相同。

传代的次数：取决于细胞来源，保证特性

要领：适宜的时期和方法，消化不要过度

注意：防止细胞系之间混杂、非细胞生物的污染。

3、细胞系的保存

常用低温冷冻方法进行保存。_

冷冻保护液：10%血清的培养液，附加7.5%—10%二甲基亚飒。

保存期间，要控制环境条件，并定期监测变化。

复苏过程：将冷冻细胞取出，立即在37。。水浴中，快速融化。

在保护剂存在下，慢冻快融是保存复苏细胞的要领。

88.动物细胞大规模培养方法

1单层贴壁培养_一

规模：取决于表面积/体积，170-200cm2/100-200ml,2义107二倍体或108异倍体。

优点：容易更换全部培养液，如从血清培养基到无血清培养基；可改变培养液与细胞

的比例；容易灌注培养，高密度和产物分泌表达。

缺点：需要更大空间；细胞活性无法检测；过程参数检测和控制困难；放大困难而且

昂贵

2、悬浮培养

细胞在反应器内游离悬浮在培养液中生长的培养过程。

优点：操作简单，培养条件相对均一，传质和传氧较好，容易放大培养。

缺点：细胞体积小，密度低，培养病毒易失去标记而降低免疫能力。

适用范围：悬浮细胞，兼性贴壁细胞，杂交瘤

借鉴微生物发酵理论和经验，发挥动物细胞的特性。

3、固定化培养

3.1载体结合

(1).吸附法：用固体吸附剂将细胞吸附在其表面而使细胞固定化。

操作简便、条件温和，是动物细胞固定化中最早研究使用的方法。

缺点：载体的负荷能力低，细胞易脱落。

例：中空纤维培养、微载体培养

载体结合--中空纤维培养

概念：中空纤维细胞培养技术是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的

“毛细管”(即中空纤维)给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统。

优点：无剪切、高传质、营养成分的选择性渗入，使培养细胞和产物密度都可达到比

较高的水平。

缺点：膜的污染和堵塞，观察困难，细胞生长或过量气体产生会破坏纤维。

目前中空纤维反应器已进入工业化生产，主要用于培养杂交瘤细胞来生产单克隆抗体。

载体结合一微载体培养

细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，逐渐生长成单层，具有单层培养和悬浮培养

的优点。

优细胞生长的环境均一，培养基利用率高，重复性好，减少了劳动强度，容易放

大。兼具贴壁和悬浮培养的双重优点。

缺点：搅拌桨及微珠间的碰撞易损伤细胞；接种密度高，微载体吸附力弱，不适合培

养悬浮型细胞。

(2)共价贴附法：利用共价键将动物细胞与固相载体结合。

可减少细胞的泄露

但须引入化学试剂，对细胞活性有影响，且因贴附而导致扩散限制小，细胞得不到保

护。

(3)离子/共价交联法：双功能试剂处理细胞悬浮液，会在细胞间形成桥而絮结产生

交联作用，此固定化细胞方法称为离子/共价交联法。

交联试剂会使一些细胞死亡，也会产生扩散限制。

3.2包埋一微囊培养

概念：用一层亲水半透膜把细胞包埋在微囊内，再悬浮于培养液中培养的过程。

胶原包埋贴壁细胞；

海藻酸、琼脂糖包埋非贴壁细胞。

89.