以4-氨基苯硫酚为连接的含氮杂环烷烃侧链的截断侧耳素衍生物的设计、合成及抗MRSA活性评价

前言抗生素(antibiotics)又称为抗菌素，是指由微生物（包括细菌、真菌、放线菌属）分泌及其改造产物或以人工全合成的,可选择性抑制某些生物活动的小分子化合物,具有抗细菌、真菌、病毒以及肿瘤等作用。自1928年AlexanderFleming发现青霉素以来,已经有超过31个大类,160种以上抗生素被发现REF_Ref16585\r\h[4]。抗生素一般可根据来源分为天然抗生素和人工合成抗生素。同时也可以根据他们母体结构分为β-内酰胺类、大环内酯类、四环素类、酰胺醇类等。抗生素自20世纪80年代以后,新批准的抗生素不断减少，发展进入了瓶颈期REF_Ref7093\r\h[7]。近几十年只有个位数新结构的抗生素。抗生素的滥用会导致大量的耐药菌产生,而新的抗生素发现却停滞不前,这会影响到临床中抗生素的正常使用。另外,通过比较几十年变化的金黄色葡萄球菌,结果显示耐药性发展非常快REF_Ref7034\r\h[8]。新抗生素的研发迟缓这一问题引起科学界的重视,FDA对多个正在研发的新抗生素给予优先评审和快速评审的资格,这给予抗生素研发者极大鼓舞。而对已有的抗生素进行改造一直是抗生素研发的大趋势REF_Ref7093\r\h[9]。通过结构改造可以使得抗生素的具有更好的药物稳定性,较低的毒副作用以及更广的抗菌谱。研究表明,MRSA等革兰阳性菌正发展为多种抗生素耐药菌:耐青霉素类(苯甲异噁唑青霉素和氨苄青霉素)、耐万古霉素类和耐氟喹诺酮类等药物细菌REF_Ref4954\r\h[10]REF_Ref6561\r\h[11]。因此，为了解决MRSA引起的感染问题，迫切需要开发新的抗菌药物，截短侧耳素及其衍生物就是新型抗菌药物的研究方向之一。1.1截短侧耳素简介截短侧耳素(pleuromutilin，图1)是一种三环二萜类天然化合物，于二十世纪五十年代从两种真菌(Pleurotusmutilus和P.passeckerianus)的培养物中分离出结晶形式，并确定其分子式为C22H34O5，相对分子量为378.51，具有八个立体中心极具刚性的568三环碳骨架和C(14)的乙醇酸链等结构REF_Ref7191\r\h[12]。图11.2抗菌机制截短侧耳素类属于三环二萜类抗生素，其发挥抗菌作用的主要结构是化合物中的三环骨架，能够与细菌核糖体50S亚基的肽酰转移酶活性中心（PTC）形成诱导契合效应，导致其亚基发生重排，同时三环核心突出部分能够覆盖核糖体P位点。这种抗菌机制不同于其他抑制蛋白合成的抗生素。值得注意的是，截短侧耳素类化合物结构分子中的C14侧链，能够深入核糖体亚基的疏水部分，影响其抗菌活性，因此，C14侧链的化学修饰一直是截短侧耳素衍生物改造的关键位置REF_Ref16911\r\h[14]。1.3已上市的截短侧耳素衍生物1.3.1泰妙菌素泰妙菌素（Tiamulin）作为第一个动物专用截短侧耳素类抗生素，并于1979年被批准用于治疗猪的支原体肺炎和猪痢疾短螺旋体等感染REF_Ref18521\r\h[15]，结构如下图。图21.3.2沃尼妙林沃尼妙林（Valnemulin）同样也作为动物专用抗菌药用于治疗猪和鸡的呼吸道病以及兔的流行性肠炎，结构如下图。图31.3.3瑞他妙林瑞他妙林（Retapamulin）作为第一个人用的截短侧耳素类抗生素于截短侧耳素药物被发现近50年以后才获批准用于临床，但且仅作为局部用药治疗成人及9个月以上儿童因金黄色葡萄球菌和化脓链球菌引起的脓疱病REF_Ref7217\r\h[13]REF_Ref7246\r\h[14]，结构如下图。图41.3.4来法莫林来法莫林(Lefamulin)是第一个在人体内全身使用的截短侧耳素类抗生素，2019年8月被美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗社区获得性细菌性肺炎专用药[]，结构如下图。图51.4本课题的主要研究内容(1)将对甲苯磺酰氯与原料截短侧耳素缩合，以活化截短侧耳素母核上14号位侧链中的取代羟基，得中间体Ⅰ对甲苯磺酰化截短侧耳素，用于下步反应。

(2)以对甲苯磺酰化截短侧耳素与4-氨基苯硫酚在加热回流条件下反应合成得到中间体Ⅱ粗品，用于下步反应。(3)硅胶柱纯化后将上述中间体Ⅱ粗品经硅胶柱纯化后，得到纯净的中间体Ⅱ用于下步反应。(4)氯乙酰氯与上述截短侧耳素中间体Ⅱ在低温条件下反应得到中间体Ⅲ。(5)硅胶柱纯化后将上述中间体Ⅲ粗品经硅胶柱纯化后，得到纯净的中间体Ⅲ用于下步反应。(6)中间体Ⅲ与含氮杂环烷烃在高温条件下反应得到最终化合物。(7)运用质谱、核磁等检测方法对得到的产物进行结构表征，以确证所得截短侧耳素衍生物的化学结构。

(8)利用上述合成得到的截短侧耳素衍生物进行药敏实验，研究以4-氨基苯硫酚为连接的含氮杂环烷烃侧链的截短侧耳素衍生物的设计、合成及抗MRSA活性评价.2截短侧耳素衍生物的设计与合成2.1截短侧耳素衍生物路线的设计2.1.1设计理念根据文献报道REF_Ref25866\r\h[2],截短侧耳素类衍生物的构效关系应当如下:C14侧链中连接中性基团或酸性基团的化合物抗菌活性较低，只有连接一个碱性中心会使衍生物活性改变;C14侧链中含有硫醚基团可以促进抗菌活性;C14侧链需要酰基化修饰；C14侧链需要含有像苯环、杂环或环烷基之类取代的环系可以提高衍生物的抗菌活性。2.1.2中间体1的制备原材料截短侧耳素对甲苯磺酰化，生成相应的磺酸脂，结构如图。图72.1.3中间体2的制备生成的中间体1与4-氨基苯硫醇在加热回流条件下反应合成得到中间体Ⅱ粗品（结构如图），用于下步反应。图82.1.4中间体3的制备氯乙酰氯与上述截短侧耳素中间体Ⅱ在低温条件下反应得到中间体Ⅲ，结构如下图。图92.1.5化合物的制备中间体Ⅲ与不同含氮杂环烷烃在高温条件下反应得到最终化合物。化合物1：22O[(4(2((四氢吡咯)乙酰氨基)苯基)]硫乙酰基妙林图10化合物2：22O[(4(2((四哌啶基哌啶)乙酰氨基)苯基)]硫乙酰基妙林图11化合物3：22O[(4(2((哌啶)乙酰氨基)苯基)]硫乙酰基妙林图122.2截短侧耳素衍生物的合成2.2.1合成中间体1的一般程序将5.0g(13.2mmol)截短侧耳素溶于15mL乙酸乙酯中，并置于冰浴条件下，将3.3g(17.3mmol)对甲基苯磺酰氯缓慢加入上述溶液中，3分钟后缓慢滴加(1-2滴/秒)6mol/L的氢氧化钠溶液3ml。混合液在完成滴加3分钟后撤去冰浴，再反应3小时左右，用薄层色谱法(TLC)监测反应进程(展开剂比例为二氯甲烷：乙酸乙酯：石油醚=1:1:2)，当观测到原料点淡化至消失，即反应结束。旋蒸除去溶剂后，将反应液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷进行二次萃取，加入适量无水硫酸钠除水，取有机相再次旋蒸，加入乙醇进行重结晶（通过加热让溶剂溶解产物，再降温析出），抽滤，烘干，即可得中间体1截短侧耳素对甲苯磺酸酯。2.2.2合成中间体2的一般程序由于4-氨基苯硫醇保存状态为一整块固体，一般提前拿出来放在旋蒸水浴锅里复温，之后即可用吸管取;称取9g（16.9mmol）中间体1溶于30-50mL乙酸乙酷，将反应瓶置于电子上称量滴加2.33g（18.6mmol）的4-氨基苯硫醇;小烧杯称好NaOH溶于水中，尽量以饱和溶液状态(6.67g一般溶于10mL)，溶解时可将烧杯放入冰中帮助降温，边搅拌边溶解;NaOH水溶液滴加入反应瓶中，架在反应台上开搅拌后加，不需要加得很慢。反应瓶置于油浴锅中70℃回流搅拌反应2-3h;TLC监测反应进度，展开剂石油醚:乙酸乙酯=2:1，产物极性变大;旋蒸除去瓶中乙酸乙酯，用二氯甲烷和饱和食盐水萃取，适量100-200目硅胶吸附;过柱纯化，洗脱剂二氯甲烷:甲醇=200:1,旋干溶剂得中间体2白色轻质粉末，产率约70%;2.2.3合成中间体3的一般程序将3.0g（6.2mmol）中间体2溶于20mL二氯甲烷中，并置于冰盐浴条件下，将1.7g(12.3mmol)无水碳酸钾加入上述溶液中，然后缓慢滴加(1-2滴/秒)0.84g(7.5mmol)的氯乙酰氯。混合液在冰盐浴下搅拌反应2小时后撤去冰浴，用薄层色谱法(TLC)监测反应进程(展开剂比例为乙酸乙酯：石油醚=1:1)，当观测到原料点淡化至消失，即反应结束。加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取有机相，再用饱和碳酸氢钠萃有机层2-3次，加入适量无水硫酸钠除水，取有机相再次旋蒸，旋干后得白色粉末中间体3。2.2.4合成化合物1的一般程序将0.5g（1.1mmol）中间体3溶解在3ml乙腈中，将0.09g（1.3mmol）四氢吡咯加入上述溶液，再加入0.29g(2.1mmol)无水碳酸钾于该溶液中，于70℃冷凝回流搅拌2小时。用薄层色谱法(TLC)监测反应进程(展开剂比例为乙酸乙酯：石油醚=1:1)，当观测到原料点淡化至消失，即反应结束。搅拌结束将反应液倒入分液漏斗中，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取有机相，再用饱和食盐水萃有机层2-3次，加入适量无水硫酸钠除水，取有机相再次旋蒸，所得有机相旋转蒸干即可得化合物1。2.2.5合成化合物2的一般程序将0.5g（1.1mmol）中间体溶解在3ml乙腈中，将0.21g（1.3mmol）4-哌啶基哌啶加入上述溶液，再加入0.29g(2.1mmol)无水碳酸钾于该溶液中，于70℃冷凝回流搅拌2小时。用薄层色谱法(TLC)监测反应进程(展开剂比例为乙酸乙酯：石油醚=1:1)，当观测到原料点淡化至消失，即反应结束。搅拌结束将反应液倒入分液漏斗中，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取有机相，再用饱和食盐水萃有机层2-3次，加入适量无水硫酸钠除水，取有机相再次旋蒸，所得有机相旋转蒸干即可得化合物2。2.2.6合成化合物3的一般程序将0.5g（1.1mmol）中间体溶解在3ml乙腈中，将0.11g（1.3mmol）哌啶加入上述溶液，再加入0.29g(2.1mmol)无水碳酸钾于该溶液中，于70℃冷凝回流搅拌2小时。用薄层色谱法(TLC)监测反应进程(展开剂比例为乙酸乙酯：石油醚=1:1)，当观测到原料点淡化至消失，即反应结束。搅拌结束将反应液倒入分液漏斗中，加水淬灭反应，用二氯甲烷萃取有机相，再用饱和食盐水萃有机层2-3次，加入适量无水硫酸钠除水，取有机相再次旋蒸，所得有机相旋转蒸干即可得化合物3。2.3本章小结对于实验过程中旋蒸之后的产物一般需要过柱纯化，纯化后的产物才可进行后续实验，药物的保存一般置于-4℃的冰箱保存，而且在使用前要点板检验药物纯度，可能存在药物的分解问题。本实验室前期进行了一些基础的截短侧耳素类衍生物的设计与合成，并获得较好活性的截短侧耳素衍生物，具有一定的经验，此外本项目研究所需仪器设备学院均有，不需要另外购买大型仪器设备，预计能够顺利进行。实验目标化合物的合成及其体外、内活性实验均有一定的难度，但预期可以顺利完成。3碳谱结果3.1仪器ChemBioDrawUltra20.0、mestrenova以及Prism等绘图软件。3.2结果图3.2.1化合物122O[(4(2((四氢吡咯)乙酰氨基)苯基)]硫乙酰基妙林通过2.2.4中描述的方法制备，产物为轻质粉末，产率为53.3%13CNMR(151MHz,CDCl3)δ217.07(C3),169.06,168.30(C21),138.94,137.24(C19),131.98,129.30,119.94,117.24(C20),74.61(C11),69.46(C14),59.73,58.18(C4),54.61,45.44(C9),44.73(C13),43.87(C12),41.76(C5),38.15(C6),36.77(C10),35.99(C2),34.47(C22),30.43(C8),26.83(C7),26.29(C18),24.84(C1),24.09,16.75(C16),14.87(C15),11.50(C17).图13化合物1碳谱图图14化合物2碳谱图3.2.2化合物222O[(4(2((四哌啶基哌啶)乙酰氨基)苯基)]硫乙酰基妙林通过2.2.5中描述的方法制备，产物为轻质粉末，产率为68.5%13CNMR(151MHz,CDCl3)δ217.09(C3),168.75,168.30(C21),138.93,138.93(C19),132.03,129.37,119.83,117.24(C20),74.60(C11),69.47(C14),61.99,61.70,58.18(C4),53.88,50.50,45.44(C9),44.72(C13),43.87(C12),41.76(C5),38.13(C6),36.77(C10),35.99(C2),34.47(C22),30.43(C8),28.76,26.83(C7),26.30(C18),26.28,24.84(C1),24.69,16.75(C16),14.87(C15),11.50(C17).3.2.3化合物322O[(4(2((哌啶)乙酰氨基)苯基)]硫乙酰基妙林通过2.2.6中描述的方法制备，产物为轻质粉末，产率为61.34%13CNMR(151MHz,CDCl3)δ217.07(C3),169.02,168.30(C21),138.94,137.24(C19),132.08,129.22,119.83,117.23(C20),74.61(C11),69.45(C14),62.76,58.18(C4),54.92,45.44(C9),44.72(C13),43.86(C12),41.76(C5),38.17(C6),36.77(C10),35.99(C2),34.47(C22),30.43(C8),26.83(C7),26.31(C18),26.26,24.84(C1),23.60,16.75(C16),14.87(C15),11.50(C17).图15化合物3碳谱图4衍生物活性的测定4.1目标化合物最小抑菌浓度（MIC）的测定方法4.1.1菌种及对照药物实验菌种：金黄色葡萄球菌（ATCC43300）对照药物：泰妙菌素（Tiamulin）、万古霉素（Vancomycin）、盐酸沃尼妙林（Valnemulin）培养基配制：MH肉汤培养基、甘露醇培养基（培养基高压灭菌后使用）4.1.2药液配制分别精密称取6.4mg截短侧耳素、泰妙菌素以及三种目标化合物，于250μLDMSO中溶解，摇匀后添加250μL吐温80，最后加入4500μL超纯水，将药物配制成浓度为1280μg/ml的母液。在超净工作台中，用去除针头的注射器吸取母液，然后使用0.22μm的微孔滤膜对药液进行过滤，随后将其放置于-20℃冰箱中保存，备用。4.1.3菌液配制将低温保存的待测菌株MSRA（ATCC43300）接种到甘露醇培养基中进行菌的传代。菌株传代完成后将培养基中生长良好的单一菌落用接种环接种至培养基上，随后放到恒温培养箱中，37℃培养24小时之后取出，挑选大小合适、长势优良的单个菌落使用接种环接种到装有高压灭菌后的BHI肉汤培养基中。接好菌种的EP管固定于摇床中，继续37℃恒温在210rpm培养4.5h后获得菌液。4.1.4活性测定（1）在超净工作台上，取三个96孔滴定板，自上而下各排标号，A至H共八排。用移液枪向A-F各排第一孔添加180μL无菌MH肉汤，A-H各排其余孔添加100μL无菌MH肉汤。（2）每组药平行测定三次，因此分别用移液枪吸取20μL配制好的目标化合物1母液（浓度为1280μg/ml）添加进ABC排的第一个孔中，同理，分别吸取20μL配制好的目标化合物2母液（浓度为1280μg/ml）添加进DEF排的第一个孔中，将母液加入每个孔中的同时进行充分反复吹打混匀。用移液枪从A~F排第一个孔中吸取100μL混合液转移至A~F排第二孔中，进行充分的反复吹打混匀，重复上述操作至第十二个孔，最后用移液枪吸取100μL第十二孔中混合液弃去。此时A~F排每孔药物浓度依次是128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06μg/ml。（3）用移液枪向A~H各孔加入100μL稀释后的菌液，此时A-F排每孔药物浓度依次是64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125，0.06，0.03μg/ml。（4）在第G排各孔添加200μL无菌MH肉汤作阴性对照，第H排各孔添加100μL无菌MH肉汤以及100μL稀释后的菌液作阳性对照。（5）重复上述实验步骤将配制好的三个目标化合物、泰妙菌素、万古霉素、沃尼妙林母液（浓度均为1280μg/ml）稀释至各孔内并添加菌液。每个96孔板有俩组药，共三个板。（6）将配制好的96孔滴定板在37℃环境中静置恒温培养24小时后，取出，观察结果。（7）在光线良好的情况下观察滴定板，孔内若有浑浊现象，则说明有菌生长；孔内若是澄清状态，则说明无菌生长。滴定板每排各孔从右往左观察，以第一个出现澄清状态的孔的浓度视为该药物的最小抑菌浓度（MIC）。4.2目标化合物最小杀菌浓度（MBC）的测定方法（1）观察完药物的MIC之后，继续在37℃环境中静置恒温培养24小时后取出，观察情况，选取视为MIC的孔的左侧四个澄清孔进行涂板，取数个MH肉汤琼脂板于超净工作台中，使用移液枪移取50μL澄清孔的混合液分别于板上均匀涂布。（2）菌液均匀分布且琼脂平板表面干燥后在37℃环境中静置恒温培养24小时后，取出培养箱中的固体培养基进行观察，结果判定：若在平板观察到细菌的特征性菌落，则说明有细菌生长；若不能观察到菌落，则说明无菌生长。第一个出现无菌生长的药液浓度视为该药的最小杀菌浓度（MBC）。4.3结果观察泰妙菌素：24h观察时第9孔开始变澄清，经涂布培养24h后第7孔涂布结果开始无菌落。沃尼妙林：24h观察时第11孔开始变澄清，经涂布培养24h后第11孔涂布结果开始无菌落。万古霉素：24h观察时第6孔开始变澄清，经涂布培养24h后第5孔涂布结果开始无菌落。目标合成化合物1：24h观察时第9孔开始澄清，经涂布培养24h后第9孔涂布结果开始无菌落。目标合成化合物2：24h观察时第11孔开始变澄清，经涂布培养24h后第8孔涂布结果开始无菌落。目标合成化合物3：24h观察时第11孔开始变澄清，经涂布培养24h后第8孔涂布结果开始无菌落。表1MIC测定结果ATTCC43300(ul/mL)泰妙菌素0.25沃尼妙林0.06万古霉素2化合物10.125化合物20.06化合物30.06表2MBC测定结果表ATTCC43300(ul/mL)泰妙菌素1沃尼妙林0.06万古霉素4化合物10.25化合物20.5化合物30.5从表中的数据可以看出,制备的化合物对金黄色葡萄球菌的体外抑菌活性良好。对MRSA的MIC值分别为0.125μg/mL、0.06μg/mL、0.06μg/mL，对MRSA的MBC值分别为0.25ug/ml、0.5ug/ml、0.5ug/ml。其中化合物1对MRSA抑菌浓度与杀菌浓度一致，化合物2、3对MRSA的杀菌活性较差，抑菌浓度与杀菌浓度有明显变化。综上所述,三种化合物的体外抗菌活性均位于对照药物泰妙菌素与沃尼妙林之间,有进一步的研究价值。5结论抗生素自被发现使用至今，已经经过了多代抗生素药物的更迭。截短侧耳素类药物的广谱抗菌活性使其在耐药菌感染的治疗中具有广阔的应用前景,可以为多药耐药的细菌感染提供新的解决方案REF_Ref7093\r\h[7]。目前对截短侧耳素的构效关系和耐药机制的研究已经逐渐成熟,现在对于该类化合物的研究重点是如何进一步开发更广泛适用的截短侧耳素类衍生物。而目前在使用的动物专用抗生素泰妙菌素和沃尼妙林已经对部分革兰氏阳性菌产生了部分耐药性。因此,利用现有科技水平继续深入研究截短侧耳素类衍生物的结构修饰,,使截短侧耳素衍生物的在研发中加大抗耐药性，增加侧链骨架结构多样化,寻找新型良好抗菌活性的抗生素至关重要。细菌耐药是临床上一大难题，目前大部分抗生素都被发现有相对应的耐药菌株，而新截短侧耳素衍生物有较好的开发潜力和应用前景，本研究在前人的基础上，合成了新的基团，期待以后有更有效的截短侧耳素衍生物以及提供理论基础和科学依据。参考文献李云鸽.截短侧耳素衍生物的设计、合成及抗菌活性研究[D].锦州医科大学,2019崔格.截短侧耳素新型衍生物的合成[D].河北科技大学,2021丁超月,徐艳,孙丽,等.截短侧耳素类抗生素及其耐药研究进展[J].国外医药(抗生素分册),2023,44(03):166-172.DOI:10.13461/ki.wna.005548.林树乾，张家铭，衣云鹏，黄中利，赵增成，杨世发，殷斌，刘月月，李桂明，张荣玲，闫遵祥，宋士凯.截短侧耳素衍生物及其合成方法和应用[P].中国专利：CN116063227A,2023.05.05汤有志，李珂，靳珍，曾振灵，黄显会，丁焕中.一种具有噻唑侧链的截短侧耳素衍生物及其制备方法和应用[P].中国专利：CN117304133A,2023.12.29马丹倩,张贺超,齐显龙,等.截短侧耳素衍生物PCI对48株牛源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌临床菌株的抗菌活性[J/OL].中国草食动物科学:1-9[2024-04-08]./kcms/detail/62.12