玄参药材HPLC指纹图谱研究

玄参药材HPLC指纹图谱研究[摘要]目的：建立30批不同产地玄参药材的HPLC指纹图谱，为玄参药材等级质量标准的制定提供方法和依据。方法：采用HPLC-DAD法，ElipseXDB-C18(250mmx4.6mm,5µm)色谱柱，柱温25℃，以乙腈（A）-0.03%磷酸水（B）为流动相，流速1.0mL·min-1；检测波长207nm。建立玄参HPLC指纹图谱，并对不同产地进行相似度比较及非共有峰占比。结果：采用“中位数”法进行峰匹配之后，生成对照谱图，得出七个共有峰。不同地方各等级药材与对照药材的相似度，多数地方药材一等的相似度要偏高，二等三等相对偏低，各个道地药材之间不同批次相似度差异大，从而体现了化学成分差异大。结论：该方法分离效果好，操作简便，灵敏度高，同时采用相似度法与非共有峰占比相结合可综合分析玄参药材质量及动态变化规律，为控制玄参内在质量提供参考。[关键词]玄参；HPLC-DAD；指纹图谱；相似度；等级质量标准；《中国药典》收载的玄参来源为玄参科的干燥根[1]。多年生高大草本；根粗大；茎四菱形，有腺毛；叶对生，脉明显网结；\t"/item/%E7%8E%84%E5%8F%82%E7%A7%91/_blank"聚伞花序疏散开展呈圆锥状，花梗细长，有腺毛；萼裂片顶端钝圆；花小，暗紫色，花冠筒近球形，退化雄蕊大而近于圆形；蒴果卵圆形，端有喙。根供药用，为传统的中药材,具有清热凉血，滋阴降火，解毒散结等功能。现代药理实验进一步研究，玄参有轻度的强心作用；对促进局部血液循环从而消除炎症有一定作用；动物实验证实有降低血压作用；对肾型高血压降低作用更明显。此外，玄参还具有在体外中和白喉毒素的作用作为一味常用中药。由于其具有很强的生长适应性,在全国多个地区均有栽培，如浙江、四川、等,带来的问题是药材种质不清、质量不一,药材质量的可追溯性差等,使得“质”和“量”均无法保证。市场上玄参药材一般为统货，不同产地药材质量参差不齐。现有的等级标准1984年部颁布《七十六种药材商品规格标准》综合分析玄参药材质量及动态变化规律，为控制玄参内在质量提供实验依据[2]。1仪器与材料1.1仪器Agilent1260高效液相色谱仪(二级管阵列检测器)，OpenLABCDS色谱工作站（美国安捷伦公司），YP1001N型电子分析天平（上海青海仪器有限公司）；SB-25-12DT超声清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），202型电热恒温干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）1.2试剂哈巴苷（批号B20481）、哈巴俄苷（批号B20480）、肉桂酸（批号B21082）均购自上海源叶生物科技有限公司，乙腈、甲醇均为色谱纯，磷酸为分析纯，水为怡宝市售水。1.3不同地方玄参药材的收集药材的具体信息见表1。2016年至2017年期间共收集玄参药材30批次，将各批次玄参药材按照“七十六种药材商品规格标准”进行初步的等级划分为一等品、二等品、三等品。表1收集的玄参药材的具体信息编号产地收集时间编号产地收集时间S1浙江磐安-12016-12S16湖北来凤2016-12S2浙江磐安-22017-12S17贵州六盘水2016-12S3浙江磐安-32016-06S18四川雅安2016-12S4浙江磐安-42017-09S19四川绵阳三台2017-04S5湖南龙山-12016-12S20湖北蕲春市场2017-12S6湖南龙山-22016-12S21湖南廉桥市场2017-12S7湖北恩施2016-12S22河南南阳-12017-12S8湖南邵东2016-12S23河南南阳-22016-12S9湖南新邵-12016-12S24浙江磐安仁川2017-12S10湖南新邵-22016-12S25浙江磐安盘峰2017-12S11四川北川2016-12S26湖南新邵-32017-12S12安徽亳州-12016-12S27湖南龙溪铺2017-12S13安徽亳州-22016-12S28湖南新邵-42017-12S14安徽亳州-32017-09S29湖南邵东-22017-12S15安徽亳州-42017-12S30云南大理2017-122.方法与结果2.1不同产地玄参的性状分析及等级的划分结果6~20cm，直径1~3cm。表面灰黄色或灰褐色，有不规则的纵沟、横长皮孔样突起及稀疏的横裂纹和凹点状须根痕。质坚实，不易折断，断面黑色，微有光泽。气特异似焦糖，味甘，微苦。以水浸泡，水呈墨黑色。药材性状：本品呈圆锥形，中间略粗或上粗下细，有的微弯似羊角状，长84年部颁布《七十六种药材商品规格标准》【国药联材字（84）第72号文附件】对玄参药材进行初步等级划分，标准如下：一等干货。呈类纺锤形或长条形。表面灰褐色，有纵纹及抽沟。质坚韧。断面黑褐色或黄褐色。味甘、微苦成。每1000g36支以内，支头均匀。无芦头、空泡、杂质、虫蛀、霉变。二等干货。呈类纺锤形或长条形。表面灰褐色，有纵纹及抽沟。质坚韧。断面黑褐色或黄褐色。味甘、微苦成。每1000g72支以内，支头均匀。无芦头、空泡、杂质、虫蛀、霉变。三等干货。呈类纺锤形或长条形。表面灰褐色，有纵纹及抽沟。质坚韧。断面黑褐色或黄褐色。味甘、微苦咸。每1000g72支以外，个体最小在5g以上。间有破块。无芦头、杂质、虫蛀、霉变。根据该标准，将收集的所有批次玄参药材分为一等、二等、三等，部分分级结果如图1所示，药材的长度、断面直径等信息见表2。从中可以看出，根据传统分级标准，药材的重量、长度及断面直径的大小均服从一等品优于二等品、二等品优于三等品的规律。四川三台四川三台安徽亳州安徽亳州磐安一号磐安一号磐安二号磐安二号安徽安徽湖北湖北云南大理云南大理图1不同批次不同等级玄参药材的性状、长度及断面直径图（标尺长14cm）表2不同批次不同等级玄参药材的长度及断面直径（n=3，x±s）产地信息等级长度（cm）直径（cm）四川三台县一等二等三等16±1.213±0.85±0.62.2±0.22.0±0.31.5±0.3亳州一等二等三等20±0.816±1.112±0.52.0±0.31.5±0.31.5±0.2磐安一号一等二等三等10±0.79±0.97±0.42.8±0.32.2±0.41.8±0.1磐安二号一等二等三等16±0.615±0.410±0.72.0±0.21.8±0.31.5±0.2安徽一等二等三等15±0.610±0.58±0.52.0±0.31.8±0.31.5±0.2河南二等三等12±0.711±0.51.6±0.40.9±0.2湖北一等二等三等13±0.212±0.410±0.52.5±0.52.0±0.31.5±0.3云南大理一等二等三等12±0.410±0.46±0.22.8±0.31.8±0.21.5±0.32.2供试品溶液的制备分别考察了30%甲醇、50%甲醇和80%甲醇三种超声提取方法，结果显示50%甲醇提取液中，色谱峰数量最多，且哈巴苷与哈巴俄苷的色谱峰信号最强，故特征图谱实验沿用药典中哈巴苷和哈巴俄苷含量测定中的样品提取方法[3]。具体操作为：取不同批次、不同等级的玄参药材，打粉，过3号筛，精密称定玄参粉末约1.0g于具塞锥形瓶，加50%甲醇50mL，浸泡1h，超声45min，精密称重，用50%甲醇补足损失重量，摇匀，过0.45μm有机滤膜即得。2.3色谱条件的确定2.3.1流动相洗脱梯度的优化首先以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）为流动相，采用线性梯度洗脱（A：0min，5%；50min，70%），结果如图2所示。采用手动积分方法，将最小峰面积设为100，共积分出29个色谱峰，且25min之后采集的信号较少，说明提取液中极性小的成分较少，考虑将图2中前25min的洗脱时间条件延长时间，故色谱条件设为梯度洗脱，以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）为流动（A：0min，5%；25min，35%；35min，70%；40min，5%），结果见图3，共积分38个色谱峰，除了3min前有3个明显的溶剂峰外，其余色谱峰基本能达到基线分离，且峰型好，说明该梯度洗脱条件较佳。图2浙江一等玄参样品在207nm波长下的特征图谱（线性梯度）图3浙江一等玄参样品在207nm波长下的特征图谱（非线性梯度）2.3.2.测定波长的选择采用DAD检测器，同时获取8种不同波长下玄参的特征图谱，结果发现，相比于其他波长，207nm下玄参药材的特征图谱峰数量最多，且锋形较佳，故采用选择207nm作为获取特征图谱的测定波长[4]。综上，色谱条件确定为：C18(250mmx4.6mm,5µm)色谱柱，柱温为室温，以乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）为流动相进行梯度洗脱（A：0min，5%；25min，35%；35min，70%；40min，5%），流速1.0mL·min-1；检测波长为207nm。理论塔板数按哈巴俄苷峰计应不低于5000。2.3.3方法学考察（1）精密度实验取浙江磐安（批号S1）的玄参供试液1份，照“色谱条件”下方法连续进样5次获取特征图谱[5]，采用“中药色谱特征图谱相似度分析”软件进行分析，结果显示5次分析获得的特征图谱相似度达到0.9995，特征图谱见图5，主要色谱峰的保留时间RSD值小于2.0%，而主要色谱峰峰面积RSD值在3.0%左右，具体信息见表3。说明该方法精密度较好。表3玄参方法学考察精密度实验（n=5）1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰样品tAtAtAtAtAtA15.5516856.91163318.03118520.14204824.63318528.6792725.6017696.97167017.73120719.78213224.83323128.84101735.5917226.94176217.61117919.74209824.37325928.39101445.6117496.93173517.25116519.31214424.01332828.17101655.5717536.86172717.16110919.19207423.94312228.07994RSD%0.431.890.593.082.033.151.951.901.5802.401.1461.40图4精密度实验特征图谱（2）重复性实验取浙江磐安（批号S1）的玄参5份，照“供试品溶液的制备”项下方法制备待测液，照“色谱条件”下方法获取特征图谱，采用“中药色谱特征图谱相似度分析”软件进行分析，结果显示5份玄参样品的相似度达到0.9591，特征图谱见图5，主要色谱峰的保留时间均小于2.0%，主要色谱峰峰面积RSD值在4.0%以内，具体信息见表4。说明该方法重复性较好。表4玄参方法学考察重复性实验（n=5）1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰样品tAtAtAtAtAtA15.74217266.818185216.76121318.88217523.76332627.94102225.68618396.922181317.19123219.19220224.09345728.14102335.56317036.872195217.17117919.36222223.91331428.07100645.68416716.959191117.32117919.26211723.97322628.2498255.70816816.956189117.39115019.33209723.90317128.22959RSD%1.193.920.872.841.432.681.012.490.493.310.432.76图5重复性实验特征图谱（3）稳定性实验取浙江磐安（批号S1）的玄参供试液1份，照“色谱条件”下方法进行日间稳定性实验和日内稳定性实验，日间分别在0h、2h、4h、6h、8h、12h获取特征图谱，日内分别于第1、2、3、4、5天获取特征图谱，采用“中药色谱特征图谱相似度分析”软件进行分析。日内稳定性实验结果显示12h内玄参特征图谱的相似度达到0.989，特征图谱见图6；主要色谱峰的保留时间RSD值均小于2.0%，主要色谱峰峰面积的RSD值均低于4.0%，具体信息见表5，说明该方法12h以内基本稳定。日间稳定性实验结果显示5d内玄参特征图谱的相似度达到0.993，特征图谱见图7；主要色谱峰的保留时间RSD值均小于2.0%，主要色谱峰峰面积RSD值与日内稳定性相比呈现增大趋势，3号峰的RSD值最大，达到5.48%，具体信息见表6，说明该方法5日内稳定性稍有下降。表5玄参方法学考察稳定性实验（n=6）日内稳定性1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰时间（h）tAtAtAtAtAtA05.6816517.099148718.37106220.58204825.36315229.2091925.6016337.025141218.35105320.59201325.41313929.2091745.6115947.026139518.29104220.51200325.29310629.1390365.6115827.02138618.27103520.50198625.28309329.1290085.6117307.019148818.26108720.49208525.27326029.11947125.617177.016148218.25108520.47208325.25325729.10945RSD%0.553.70.453.390.262.040.242.080.242.310.162.19图6日间稳定性实验特征图谱表6玄参方法学考察日间稳定性实验（n=6）日间稳定性1号峰2号峰3号峰4号峰5号峰6号峰时间（d）tAtAtAtAtAtA15.5117296.92151518.17106020.39205025.17320429.0196025.4816506.90142918.1599520.38192425.16299428.9989835.6218267.01152917.61115419.77211424.41334028.4593345.5717786.99149218.24105420.47201025.27327229.1097955.6216927.02147618.27103820.51195225.29324