医院制剂妇血宁胶囊的标准研究

第第页共14页医院制剂妇血宁胶囊的标准研究摘要：设计医院制剂妇血宁胶囊标准的研究方法。医院制剂妇血宁胶囊中三七药材采用薄层色谱（TLC）法鉴别，活性成分人参皂苷Rg1（C42H72O14）使用高效液相色谱（HPLC）法对进行定量测定。经由薄层色谱鉴别方法可观察到各成分能够有效分离，经显色处理后能看到清晰明亮的斑点，且阴性对照实验结果表明无干扰；高效液相色谱法测定人参皂苷Rg1质量浓度线性范围为0.1273mg/ml～1.0185mg/ml（R2=0.9998,R=0.9999，n=5）。通过运用薄层色谱法及高效液相色谱法，二者专属性好，皆可为医院制剂妇血宁胶囊的标准制定提高合理提供有效的依据，以保障药品的安全、有效、可控与稳定。关键词：妇血宁胶囊；质量标准；人参皂苷Rg1；薄层色谱法；高效液相色谱法StudyonthestandardofFuxueningcapsule,ahospitalpreparationAbstract:DesignaqualitycontrolmethodforFuxueningcapsulesbyusingThinlayerchromatographyandHighPerformanceLiquidChromatographywasusedtoidentifypanaxnotoginsenginFuxueningcapsulesanddeterminethecontentofginsenosideRg1（C42H72O14）,theactivecomponentofpanaxnotoginsenginprescription.Chromatographicconditions:chromatographiccolumn:CAPCELLPAKC18MGⅡ（5um4.6×250mm）,mobilephase:acetonitrile-water(19:81),flowrate:1ml/min,columntemperature:30℃,detectionwavelength:203nm.Wecangettheresultfromthemethod,whichcanprovidetechnicalsupportforthequalitycontrolofthepreparation..Keywords:Fuxueningcapsule;Qualitystandard;GinsenosideRg1;Thinlayerchromatography;Highperformanceliquidchromatography.前言医院制剂妇血宁胶囊是由三七与头顶一颗珠两味中药经前处理后由湿法制粒工艺制备成颗粒装填于硬质胶囊壳而制得。具有活血止血、镇静安神、消肿止痛等功效。用于治疗功能性子宫出血、月经过多等病症。经现代药理学研究证实，三七可对血液系统、神经系统、代谢、免疫调节系统等产生明显效益[1-3]，并对肿瘤有一定程度的抑制作用[4]。头顶一颗珠为少常用中药，历代本草中鲜有记载，主要在我国的少数民族地区民间应用广泛。全方无十八反十九畏，无毒性药材，具有抗肿瘤、抗衰老、抗炎镇痛、免疫调节、改善心功能和降压等药理活性[5-7]。头顶一颗珠中国食品药品检定研究院无相关对照品或对照药材，因此无法开展研究，本次试验主要考察三七薄层色谱鉴别，且采用高效液相色谱法（HPLC）法对制剂中的活性成分人参皂苷Rg1（C42H72O14）[8]进行含量测定。本文旨在通过上述两种研究方法控制制剂质量，并对完善医院制剂妇血宁胶囊质量研究具有一定参考价值。1主要仪器与试剂1.1仪器Agilent1100高效液相色谱仪（安捷伦）；SB-800DTD超声清洗器（宁波新芝）；SQP型电子分析天平（赛多利斯）；FD115型恒温干燥箱（BINDER）；TDL-408型离心机（上海安亭仪器厂）；ZF1-I多功能紫外分析仪（上海嘉鹏科技有限公司）。1.2试药乙腈（色谱纯）；甲醇、氨试液、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇（分析纯）；10%硫酸乙醇溶液；人参皂苷Rg1对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110703-201832）；妇血宁胶囊样品由云南中医药大学提供（批号：190701、190702、190703）。2实验方法2.1薄层色谱鉴别[8-11]2.1.1溶液制备供试品溶液：取内容物经研磨处理后的粉末（约1g），与水1ml混溶，再加以水饱和的正丁醇5ml，密塞，大力振摇10min促有效成分溶出同时保证分散均匀，25℃±2℃下放置2h，直至密度不同的两重液体明显分层，取上层，加3倍量用正丁醇饱和的水，使液体充分混合，离心，取正丁醇层，70℃±5℃加热至无流动，取出沿壁滴加甲醇1ml，使残余物溶解，在甲醇挥发前迅速将所得溶液收集于干燥洁净的容器中密闭保存，即得。阴性对照品溶液：同供试品溶液制备。（阴性对照品：按本品种处方，缺少三七，其他药材组成不变，按药品生产工艺生产阴性对照品。）对照品溶液制备：使用电子分析天平称取人参皂苷Rg1对照品，保证称取重量应准确至所称取重量的千分之一，以甲醇为溶剂，制成人参皂苷Rg1对照品（1mg/ml）的对照品溶液。展开剂：以CHCl3-CH3COOC2H5-CH3OH-H2O（15：10：22：40）在10℃以下放置分层后的下层溶液，作为展开剂。2.1.2鉴别操作取2.2.1配制溶液各2ul，使用点样针点样于同一硅胶薄层G板。将硅胶板放入已使用展开剂饱和的展开缸中，注意观察并记录薄层展开情况。待展开剂距离薄层板上部1cm时取出，干燥后浸入10%硫酸乙醇，放入105℃恒温干燥箱，待斑点显色清晰，分别在日光及紫外光365nm下检视。结果见图1（A、B），得供试品色谱与对照药材色谱相应位置显相同颜色斑点。12SS’312SS’12SS’312SS’3AB(1.供试品1907012.供试品1907023.供试品190703S.对照药材S’.阴性对照)A.日光下检视图B.紫外365nm下检视图图1：妇血宁胶囊薄层色谱2.2人参皂苷Rg1含量测定（HPLC法）[8,11，12]2.2.1供试品溶液提取方法考察供试品溶液制备：通过收集查阅三七药材有效成分提取相关资料，筛选出4种供试品处理方法（①三七标准法、②超声法、③云南白药胶囊法、④三七伤药胶囊法）进行考察，HPLC法含量测定结果汇总如下(见表1)：表1：妇血宁胶囊人参皂苷Rg1含量测定（水分：5.16%）样品名称峰面积(A)平均值（A）样品浓度（mg/ml）取样量(g)稀释体积（mv）胶囊平均片重(g)含量(mg/粒)平均值(mg/粒)人参皂苷Rg11657.339111688.497010.5094/////1702.59497/////1700.34717/////1693.70679/////1692.53784/////三七标准法1-11795.09131/0.54161.0157500.499413.313713.6223三七标准法1-21884.77979/0.56861.0192500.499413.9309超声法1-11752.75500/0.52880.9833500.499413.428013.2342超声法1-21723.11194/0.51980.9954500.499413.0405云南白药胶囊法1-19001.11523/2.71551.0024100.499413.528913.4812云南白药胶囊法1-28952.76953/2.70091.0041100.499413.4335三七伤药胶囊法1-34411.16650/1.33081.0466200.499412.700212.9323三七伤药胶囊法1-44440.01807/1.33951.0163200.499413.1644对照品溶液制备：使用电子分析天平称取人参皂苷Rg1对照品，保证称取重量应准确至所称取重量的千分之一，以甲醇为溶剂，制成人参皂苷Rg1对照品（0.5mg/ml）的对照品溶液。阴性对照品溶液：同供试品溶液制备。（阴性对照品：按本品种处方，缺少三七，其他药材组成不变，按药品生产工艺生产阴性对照品。）2.2.2系统适用性试验（1）分离度考察：使用电子分析天平称取称取供试品（批号：190701）两次，保证称取重量应准确至所称取重量的千分之一①0.9918g，②1.0477g，依法操作。HPLC法测定数据见下表（表2，表3），结果显示人参皂苷Rg1与周围色谱峰分离度达到1.5以上，符合要求。表2：表3：（2）重复性考察：准备供试品6份，照试验所得方法测定。HPLC法测量含量数据汇总见表4，数据计算得人参皂苷Rg1的，符合要求。表4:对照品溶液重复性考察试验结果测定次数（次）含量（mg/g）平均值（mg/g）127.5227.62227.31327.88427.70527.75627.58专属性考察：准备对照品溶液，高效液相色谱仪中进样10μ1测定，样品溶液与阴性样品溶液同操作，得色谱图(见图2、图3、图4)。图2：对照品（人参皂苷Rg1）图谱图3：样品（妇血宁胶囊）图谱图4：阴性图谱2.2.3线性使用电子分析天平称取人参皂苷Rg1对照品（含量以92.4%计）保证称取重量应准确至所称取重量的千分之一，以甲醇为稀释剂，配制浓度为1.0185、0.7639、0.5093、0.2546、0.1273mg/ml的溶液。进样10ul，记录数据，汇总绘制标准曲线（横坐标：质量浓度；纵坐标：峰面积，见图5），同时通过标准曲线计算得回归方程:，于间线性良好，符合规定。图5：妇血宁胶囊线性关系考察图2.2.4精密度准备对照品溶液，重复进样6次，汇总HPLC法测定各次数对应峰面积数据如下表（见表5），计算得，结果表明符合要求。表5：对照品溶液精密度试验结果测定次数（次）峰面积（A）平均值（A）11689.772581681.1945821702.5949731700.3471741657.3391151692.5378461693.706792.2.5稳定性准备1份供试品溶液，25℃±2℃下放置0,2,4,6,8,10,12h后以10μL进样，汇总HPLC法各放置时间下测定峰面积数据如下表（见表6），计算得，结果表明供试品放置12h内溶液状态稳定。表6：供试品溶液稳定性试验结果时间（h）峰面积(A)平均值(A)01715.941771712.0006821724.4364041706.8713461731.8966181701.93652101705.92236121696.999762.2.6准确度（加样回收率试样）准备每份约0.50g的已知含量供试品9份，使用电子分析天平保证称取重量应准确至所称取重量的千分之一，移液管量取加入对照品溶液，配制试验梯度（50%、100%、150%）测定，汇总HPLC法测定数据如下表（见表7），回收率范围以本法测定得98.6%-103.1%，计算得平均100.7%，RSD=1.51%，结果表明符合要求。表7：供试品溶液准确度试验结果试验梯度取样量（g）样品含人参皂苷Rg1（mg）对照品加量（mg）测得总量（mg）回收率（%）50%0.508613.924466.408920.5301587103.150%0.502213.750066.408920.2032067100.750%0.498013.635616.408920.2118374102.6100%0.505213.8332913.102926.885635699.6100%0.486913.3308813.102926.4284049100.0100%0.516514.1404813.102927.3498331100.8150%0.499313.6714819.944633.341475598.6150%0.517114.1577319.944633.83557798.7150%0.487613.349519.944633.6654683101.92.2.7耐用性（1）不同品牌的同类型色谱柱：控制其他变量，考察AgilentZORBAXSB-185um4.6×250mm、waterssymmetryshieldR185um4.6×250mm、SHISEIDOCAPCELLPAKC18MGⅡ5um4.6×250mm三种类型色谱柱对测定结果的影响。汇总HPLC法测定数据如下表（见表8），结果表明这三种色谱柱对测定结果无明显影响。表8：色谱柱对测定结果影响的考察结果色谱柱实验溶液保留时间（min）峰面积平均值峰面积比值（供试品/对照品）理论板数AgilentZORBAXSB-185um4.6×250mm对照品26.6931760.540771758.268741.0271176926.7681755.9967011772妇血宁供试品26.3461819.747311805.8128651207826.6621791.8784211612waterssymmetryshieldR185um4.6×250mm对照品34.6541689.772581696.1837751.018852934.4451702.594978684妇血宁供试品34.0821688.056401727.22626512934.4141775.498295312SHISEIDOCAPCELLPAKC18MGⅡ5um4.6×250mm对照品41.1581646.314581689.451541.002939041.0711732.588508744妇血宁供试品41.0211727.796261692.81766897440.7771690.0964410499（2）柱温：控制其他变量，考察柱温于25°C、30°C、35°C下对测定结果的影响。汇总HPLC法测定数据如下表（见表9），结果表明柱温对测定结果无明显影响。表9：柱温对测定结果影响的考察结果柱温（°C）实验溶液保留时间（min）峰面积（A）平均值（A）峰面积比值（供试品/对照品）理论板数25.0对照品35.3071668.862181718.11670677735.1091767.371227105妇血宁供试品34.9031749.697391745.677801.016041695234.7451741.65820614230.0对照品34.6541689.7725816964451702.594978684妇血宁供试品34.0821688.056401731.777351.020985512934.4141775.49829531235.0对照品33.9321741.7899217378451732.588506226妇血宁供试品34.2371690.708371698.139400.977521631134.0881705.570436257（3）流速：控制其他变量，考察流速分别在0.80、1.00、1.20（ml/min）下对测定结果的影响。汇总HPLC法测定数据如下表（见表10），结果表明流速对测定结果无明显影响。表10：流速对测定结果影响的考察结果流速（ml/min）实验溶液保留时（min）峰面积平均值峰面积比值（供试品/对照品）理论板数0.80对照品40.8322044.108402046.620491.04552040.8542049.132575466妇血宁供试品40.8592121.3918521230072124.8750051921.00对照品34.6541689.772581696.183781.02852934.4451702.594978684妇血宁供试品34.0821688.056401731.77735512934.4141775.4982953121.20对照品27.9051366.727291387.153811.04486727.8921407.580324715妇血宁供试品27.9311448.366211449.50116458729.2571450.6361168842.2.8供试品的含量测定及含量限度准备6份供试品溶液（使用电子分析天平称取本品三种不同批号的供试品，各2份，保证称取重量应准确至所称取重量的千分之一）测定含量。汇总HPLC法测定数据如下表（见表11），确定本品含量限度为：人参皂苷Rg1（C42H72O14）含量≥10.27mg/粒。表11：人参皂苷Rg1含量测定结果批号峰面积（A）取样量（g）含量（mg/g）平均值（mg/g）含量（mg/粒）平均值(mg/粒)201907011725.034911.011425.715525.636912.803012.83771718.885501.014025.5582201907021737.803341.018525.725325.777512.87331723.100101.005825.8297201907031702.944090.996825.758125.704212.83671727.633421.015525.65033讨论3.1三七薄层色谱（1）提取方法选择：在医院制剂妇血宁的标准研究实验中，薄层色谱实验考察过羊藿三七胶囊标