铕配合物荧光探针及其应用

摘要绪论1.1稀土配合物荧光探针概述荧光寿命更长；发射谱峰更窄；斯托克斯更大，是稀土配合物荧光探针较于小分子荧光染料的三个明显的优点，这三个优点赋予其对特定离子的高度选择性、在时间分辨技术中极高的灵敏度以及较好的成像[1]。作为近年来的研究热点，越来越多的注重开发的研究人员将注意力投入到发展能够识别各种不同离子的探针上。且因为人体中的各种离子也影响着人本身的健康，因此此技术也可应用于医学中的病理检测等方面，于人类社会的发展有着促进作用[2]。1.1.1稀土元素稀土元素包含有元素周期表中第三副族的镧系元素和钪（Sc）、钇（Y），一共有17种[3]。稀土离子（Sc3+、Y3+、La3+、Lu3+除外）均具有未充满的4f电子层结构，所以具有多种多样的多重态能级，稀土离子发光的原因是未充满的4f层之间的电子产生跃迁，根据稀土离子在可见光区的发光强度可以将其分为三类[4]，如表1.1所示。表1.1稀土离子分类发光强度稀土离子非荧光性稀土离子Sc3+、Y3+、La3+、Lu3+、Gd3+荧光发光较弱的稀土离子Pr3+、Nd3+、Ho3+、Er3+荧光发光较强的稀土离子Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+因为Eu3+、Tb3+的优异的荧光发光性能，它不仅寿命长且激发能低，这与新兴时间分辨荧光分析技术相辅相成，所以Eu3+和Tb3+的配合物荧光探针能够持续引起关注。1.1.2稀土配合物荧光探针原理探针的发光原理如图1.1所示。图1.1稀土配合物荧光分子探针的荧光发光原理我们以铕配合物作为例子，其发光有两种机理，一种是配体三线态高于铕离子激发态（如图1.2a），另一种是配体三线态接近铕离子激发态（如图1.2b）。除一些特殊的情况外，绝大多数的铕（Ⅲ）配合物遵循的都是三线态发光机理[5]。1.2时间分辨荧光分析技术1.2.1时间分辨荧光原理稀土配合物的发光特性与时间分辨荧光分析技术及其匹配，这是其所能够应用的一大根本优势。在捕捉荧光信号的前一段时间，引入一定的延迟时间，等到短寿命的背景荧光和散乱光衰减至完全消失后，再对长寿命的荧光进行捕捉采集。因此，可以解决来自试剂或样品中产生的短寿命荧光问题，提高检测的灵敏度和准确度。图1.3为测定原理示意图[6]。1.2.2稀土配合物荧光探针在时间分辨荧光分析技术中的应用稀土配合物由于其具有Stokes位移大、荧光寿命长等突出的特点，这有了把其设计成为细胞内活性分子的生物传感器的可能，再结合时间分辨荧光分析技术来实现对细胞活性分子实时原位的检测[7]。1.3本论文研究意义及内容 通过对现有的关于铕配合物荧光探针文献的查阅和整理，得到不同类型不同配位体的铕配合物荧光探针与所对应的特定的离子的高敏感性与选择性。根据荧光探针对特定的的离子的高敏感性，可将其应用于生物科学与医学等相关领域。本论文主要是将不同类型的铕配合物荧光探针以及与其对应的特定离子进行总结，并对其反应的机理进行基本的描述，来表达铕配合物荧光探针特异性选择的原理。详细的区分不同类型的铕配合物荧光探针对不同离子的选择性，以便于铕配合物荧光探针应用在实际生活中。2识别铜离子和硫离子的β-二酮类铕（Ⅲ）配合物荧光探针2.1引言 铜离子与硫离子等元素十分常见，但缺少与过量均会对生物有不同的影响。过量的铜离子会致使细胞死亡且会进一步诱发帕金森氏等多种疾病，过量的硫离子会造成生物永久性的脑损伤，而缺少硫离子则会使人体中毒。所以，设计与合成高灵敏度的针对Cu2+和S2-的稀土配合物荧光探针是十分重要的，也是现在科研人员研究的重点。时间分辨荧光检测技术的优点是其荧光检测的高灵敏度与能在检测时有效的消除样本与试剂本身荧光的干扰，因此，近年来研究人员大多倾向于用分子识别理念来设计稀土配合物荧光探针。本章是介绍一种人工合成的强荧光性β-二酮类铕（Ⅲ）配合物荧光探针Eu3+-BHHCT-BPED，荧光探针Eu3+-BHHCT-BPED本身会发出很强的荧光，与Cu2+反应后几乎不发光，而将S2-加入探针溶液后，探针又会发出较强的荧光，且该探针有较宽的pH适用范围与较高的化学稳定性。2.2合成方法2.2.1合成路线合成步骤如图2.1所示。图2.1探针的合成步骤2.2.2配位体的合成2.2.3探针Eu3+-BHHCT-BPED的合成将633mg，0.5mmol的BPED-BHHCT与92mg，0.25mmol的EuCl3·6H2O加入10mL的CH3CN中，再一边搅拌一边加入1.0M，0.75mL的NaOH。然后在85℃回流1h，冷却到室温后过滤收集沉淀。最后用含有10%C2H5OH的水溶液洗涤沉淀，得到淡黄色固体Eu3+-BHHCT-BPED，产率大概有九成。2.3结果与讨论2.31探针对Cu2+检测性能的评价由图2.2A可看出，在不同浓度的Cu2+下，浓度越高，探针发光强度越小，也可根据此表示出探针发光强度与铜离子浓度的关系，如图2.2B。2.3.2探针对S2-检测性能的评价由于硫离子和铜离子会相互反应结合成CuS，所以Eu3+-BHHCT-BPED-Cu2+中的Cu2+与S2-会结合形成沉淀CuS，使得因为检测Cu2+而猝灭的探针荧光能够恢复。在此依据上，Eu3+-BHHCT-BPED-Cu2+即可以作为一个新型的探针用来检测S2-。由图2.3A可看出探针的荧光强度与S2-有着明显的关系，随着硫离子浓度的增加而变大。也可根据此得出它们之间的线性关系，如图2.3B。关系式可表示为I-I0=3.10[S2-]+12.2，I0是Eu3+-BHHCT-BPED-Cu2+加入S2-前的发光强度，I是加入后的发光强度。因此可以看出该探针具有对硫离子高度的选择性。2.4小结本章主要介绍了，（1）铕（Ⅲ）配合物荧光探针Eu3+-BHHCT-BPED的合成方法;（2）铕（Ⅲ）配合物荧光探针Eu3+-BHHCT-BPED对Cu2+与S2-的特异性识别。可以利用该探针进行活体生物体内的Cu2+与S2-时间分辨荧光成像，以推动医学、材料学等领域的发展。3识别单线态氧的铕(Ⅲ)配合物荧光探针3.1引言1O2属于活性氧，广泛的存在我们的生活中，也能在生物免疫系统中作为杀菌剂存在。它是一种处于激发态的氧气分子，因为其氧化性极强，化学性质活泼，所以在生物及环境中都起着重要作用[9]。因此，近年来科研工作者也将越来越多的注意力投入到如何检测生物体内单线态氧方面[10]。本章将介绍1O2特异性识别铕（Ⅲ）配合物荧光探针Eu3+(BHH)3(ATPD)，这种探针在单线态氧溶液中反应后有较强的荧光放出，且适用的酸碱度很广。可利用其特性来建立单线态氧时间分辨荧光分析技术，来对单线态氧进行特异性选择。3.2合成方法3.2.1探针的合成路线图3.1探针的合成路线3.2.2探针的合成3.2.3探针与1O2的反应3.3结果与讨论3.3.1探针对1O2检测性能的评价由图3.2A可看出，探针Eu(BHH)3(ATPD)的发光强度与氧离子的浓度有着密不可分的关系，随着H2O2的浓度增加而增加。为了进一步了解它们具体的关系又做了图3.2B，来具体的用线性方程的方式来描述。其线性方程为I-I0=0.92[H2O2]+40.1，I表示荧光探针在加入H2O2前的发光强度,I0表示加入后的发光强度，线性范围在5-200μM之间。3.3.2探针对各种活性氧的选择性测定为了检测荧光探针对单线态氧的特异性选择，应选择在不同的溶液中用探针来进行单独的检测。图3.3是1O2和另加的活性氧与Eu(BHH)3(ATPD)（1μM）在pH为7.4的0.05M硼酸缓冲溶液中反应过后的荧光强度。图中可以看出该探针除了对单线态氧有着特异性选择外，对其他的离子均无特殊的反应。这表明了该探针的可实用性，可将其与时间分辨荧光分析技术结合，来特异性的检测生物体中的单线态氧，也可检测环境中的单线态氧。3.4小结本章介绍了β-二酮类铕（Ⅲ）配合物荧光探针Eu(BHH)3(ATPD)。该探针能够在特异性识别1O2的同时还就有较宽的pH适用范围。4.识别次氯酸的可见光激发铕（III）配合物荧光探针4.1引言次氯酸（HClO）是一种典型的活性氧。因此，在生物体中HClO能消灭多种病原体，加强宿主的机体防御。在这之外，HClO过多积累在吞噬细胞中会引发组织损伤或重塑，而且对肾病、心血管疾病、炎症、癌症和神经退行性疾病等病症有着深远的影响。体内与体外过多或过少的HClO会造成生物体内溶酶体的破裂从而使细胞凋亡，故许多慢性疾病都与被HClO破坏的溶酶体有关。所以，检测细胞中的HClO含量与分布显得十分重要，这可以使我们更好的了解到HClO的起源、活动和功能[11]。在这几年，稀土配合物荧光探针由于其特殊的与独特的性能在检测生理小分子、离子等方面取得了很好的成绩。但这类探针也有一定的缺点，即探针激发窗口受限于紫外光区，容易造成不可逆转的光损伤与光毒性。而本章介绍的是一种能检测溶酶体内HClO的可见光区激发的时间分辨荧光探针，即[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]（CDHH：5-（4”-氯磺酰基-1’,1”-二苯基-4’-基）-1,1,1,2,2,3,3-七氟-4,6-己二酮；DPBT：2-（N,N-二乙基苯胺-4-基）-4,6-二（3,5-二甲基吡唑-1-基）-1,3,5-三嗪）[12]，且实现了在RAW264.7细胞中外、内源性HClO的时间分辨荧光成像分析。4.2合成方法4.2.1探针的合成路线配合物及配体的合成路线如图4.1所示4.2.2配合物的合成先在50mL圆底烧瓶中加入20mL干燥的N,N-二甲基甲酰胺（DMF），再将882mg的CDHH（1.8mmol）、260mg的N-（3-氨丙基）吗啉（1.8mmol）与21.8mg的二甲氨基吡啶（DMAP）（0.18mmol）分别加入到烧瓶中，然后缓慢滴加364mg的三乙胺（3.6mmol），并在室温下避光搅拌24h。待溶剂旋干后，加入50mL的稀盐酸（1.0M），最后在磁力搅拌器上搅拌10min，抽滤出产物，用蒸馏水洗涤多次后再真空干燥得到乳白色固体Lyso-CDHH，产率为47%。4.2.3探针[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]的合成先将59.8mg的Lyso-CDHH（0.1mmol）与12.21mg的EuCl3·6H2O（0.03mmol）溶于5mL干燥的四氢呋喃（THF）溶液中，轻微搅拌后加入100μL的氢氧化钠（1.0M）水溶液，然后再加入12.48mg的DPBT（0.03mmol），在氩气保护下回流3h，冷却到室温加入一定量的水，会有大量的沉淀析出，用离心机离心收集固体，最后在真空条件下干燥得到黄色固体[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]，产率为61％。4.3结果与讨论4.3.1探针对次氯酸检测性能的评价为了了解[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探针对次氯酸（HClO）的特异性选择，在室温的实验条件下，将相同浓度的探针溶液加入到pH为5.5的含有0.25%TritonX-100的0.05M硼酸缓冲溶液中，在充分震荡后加入不同浓度的次氯酸钠水溶液，然后对不同浓度的反应液的发射和时间分辨激发光谱进行测定。其结果如图4.2，可以看出随着次氯酸浓度的增加探针的荧光强度不断下降，最大可降至155倍。上图4.3是[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探针测定HClO的工作曲线。可以看出探针荧光强度与其浓度呈良好的线性关系，因此，该探针可以选择性检测HClO。4.3.2探针对次氯酸的选择性测定这次采用了硝酸根NO3‒，亚硝酸根NO2‒[13]，过氧化氢H2O2，超氧负离子自由基O2·‒，一氧化氮NO，单线态氧1O2，羟基自由基·OH[14]和过氧亚硝酸阴离子ONOO‒分别与[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探针反应，观察其反应前后荧光强度的变化，且反应环境均为pH5.5含有0.25%TritonX-100的0.05M硼酸缓冲溶液中。测定的结果如图4.4所示，可由图看出，探针除了与次氯酸反应后荧光明显减弱外，与其他活性物种反应均无明显变化。即可说明其他活性物种均不会对探针检测次氯酸造成干扰[15]。4.4小结在本章中，介绍了一种在配体β-二酮CDHH上加入氨基吗啉的对次氯酸有定向选择的[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探针。这个探针具有荧光寿命长、pH范围广、响应速度快、有良好的细胞膜穿透性等优点[16]。[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探针对细胞溶酶体内次氯酸的定位，为进一步开发出具有细胞器靶向功能的铕（III）配合物荧光探针提供了思路与方法。5结论因为时间分辨荧光技术的兴起，从而发展起来的稀土配合物荧光探针有着荧光寿命长、斯托克斯位移大等特有的优点[17]。种类繁多的探针与时间分辨荧光技术在检测、成像和诊断等多个领域有着广泛的应用，但为了满足更多体系与活性分子的检测要求，开发更多种类的稀土配合物荧光探针成了研究者所追求的重点[18]。本文主要是介绍了三种不同的铕配合物荧光探针，并得到以下总结：铕（Ⅲ）配合物荧光探针Eu3+-BHHCT-BPED对Cu2+与S2-的特异性识别。可以利用该探针进行活体生物体内的Cu2+与S2-时间分辨荧光成像，以推动医学、材料学等领域的发展。且铕（Ⅲ）配合物荧光探针Eu3+-BHHCT-BPED的合成方法是将含有Cu2+识别基团的N,N-二乙二胺共价键合到四齿β--二酮配位体4,4’-二氯磺酰基-邻二苯基苯上。由二齿β-二酮配位体BHH、铕离子与含有1O2识别基团的配位体ATPD共同配位合成的β-二酮类铕（Ⅲ）配合物荧光探针Eu(BHH)3(ATPD)。在针对其的在不同溶液中的实验反映出该探针能够在特异性识别1O2的同时还能拥有较宽的酸碱度适用范围。（3）在配体β-二酮CDHH上加入氨基吗啉的对次氯酸有定向选择的[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探针。这个探针具有荧光寿命长、pH范围广、响应速度快、有良好的细胞膜穿透性等优点。[Eu(Lyso-CDHH)3(DPBT)]探针对细胞溶酶体内次氯酸的定位，为进一步开发出具有细胞器靶向功能的铕（III）配合物荧光探针提供了思路与方法。参考文献韩明虎.稀土配合物荧光探针研究进展[J].陇东学院学报,2016,27(03):25-32.LingChen,CuiMengyuan,ChenJieru,XiaLili,DengDawei,GuYueqing,WangPeng.Anovelhighlyselectivefluorescentprobewithnewchalconefluorophoreformonitoringandimagingendogenousperoxynitriteinlivingcellsanddrug-damagedlivertissue.[J].Pubmed,2020,215.WenshuaiLi,Xiao-MingLiu.Mobilizationandpartitioningofrareearthelementsinthepresenceofhumicacidsandsiderophores[J].ElsevierLtd,2020,254王馨.新型铕配合物单线态氧荧光探针的合成与应用[D].大连:大连理工大学,2018.邢月.新型一氧化氮特异性识别铕（Ⅲ）配合物荧光探针的设计、合成及应用[D].大连:辽宁师范大学,2018.蒋丽娜.水溶性可见光激发铕荧光标记物的制备与应用[D].大连：大连理工大学,2010.何慧.新型荧光探针的合成及其在病原微生物监测中的应用研究[D].长沙:湖南大学,2011.王欢.三种铕（Ⅲ）配合物荧光探针的设计、合成及应用[D].大连:辽宁师范大学,2017.邢佩佩,张海燕,李娜,佟丽丽,徐克花,唐波.稀土配合物荧光探针在活细胞成像研究中的新进展[J].分析科学学报,2009,25(06):721-725.王馨.新型铕配合物单线态氧荧光探针