DB12∕T 863-2019 水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌生产技术规程

水产微生态制剂解淀粉芽胞杆菌生产技术规程2019-02-15实施2019-02-15实施天津市市场监督管理委员会发布I本标准依据GB/T1.1—2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》的要求起草。本标准由天津市农业科学院提出并归口。本标准起草单位：天津市农业生物技术研究中心。本标准主要起草人：谢凤行、张峰峰、周可、赵琼、赵玉洁、孙海波、高宝山。1本标准规定了解淀粉芽胞杆菌生产中所涉及的生产环境和设备、生产技术流程、质量检测和储运。2规范性引用文件件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB3095环境空气质量标准GB3838地表水环境质量标准GB20287农用微生物菌剂GB/T26428饲用微生物制剂中枯草芽孢杆菌的检测3术语和定义属于芽胞杆菌科，芽胞杆菌属，杆状，有鞭毛，革兰氏阳性菌，芽胞椭圆形，中生或近中生。3.2原菌种在培养皿上活化，挑取单菌落接种至三角瓶中，振三角瓶中的菌种接种至种子罐中，在种子罐中放4.1生产环境4.1.1厂区空气质量符合大气环境质量标准GB3095中Ⅱ类要求。4.1.2发酵用水符合地表水环境质量标准GB3838中Ⅲ类水质要求，冷却水及其他用水符合该标准中4.1.3生产车间配备消毒灭菌设施，菌种储藏室和无菌操作间与生产车间分开。24.2生产设备5生产技术流程5.1生产流程5.2菌种质量5.2.1用于发酵的菌种应有菌种鉴定报告或菌株来源相关信息。5.2.2在发酵前应先检测菌种的纯度和性能，如不纯或退化，应先进行提纯复5.2.3菌种在上罐生产之前需检测种子罐中菌体的纯度和浓度，不能有杂菌污染，浓度达到每毫升亿5.3培养基5.3.1原菌种和一级菌种的培养基应保证菌种生长的延滞期短，生长旺盛，碳、氮源营养丰富。5.3.2二级菌种培养基原则上为发酵培养基或接近发酵培养基。5.3.3发酵培养基在保证菌体生长旺盛，利于芽胞形成的前提下，尽量利用来源充足、价格低廉的原5.4灭菌5.4.1液体发酵，发酵罐的装液量50%～70%,液体培养基、发酵设备、管道、补料罐等采用高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃~125℃,0.1MPa～0.15MPa,灭菌20min～30min。5.4.2固体物料含水率50%～60%,121℃~130℃,灭菌1.0h～2.0h。5.4.3灭菌后无菌操作取灭菌后的培养基，制片，染色，镜检，无微生物说明灭菌彻底，若有，需重复5.3的工作。5.5接种摇瓶种子到发酵罐种子接种量为1%～5%,种子罐到发酵罐接种量为5%～7%。接种保证无菌操作，调5.6.1芽胞杆菌的发酵温度为25℃~37℃。5.6.2液体发酵在发酵过程中通入无菌空气，通气量为10m³/ht～20m³/het,搅拌转数80r/min~5.6.3芽胞率达到80%以上终止发酵。5.6.5发酵过程加入天然油脂类或有机硅类消泡剂，可采用蠕动泵添加，也可在配置培养基时加入。5.7发酵后处理36质量检测6.1检测指标厂。6.2感官检测6.2.1取液体菌剂约250mL(固体菌剂约250g)于无色玻璃杯中，采用目测、鼻嗅的方法进行检验。6.2.2液体菌剂为淡黄色或棕黄色，存放过程中可能出现沉淀，具清淡的腥味；固体菌剂棕色或浅棕6.3.1样品稀释有效活菌测定直接用2～3个梯度稀释液(10⁶、10²、10)在含淀粉的培养基(参见附录B)上涂平6.3.3培养将涂好的平板在室温中放置15min,使接种物完全被琼脂吸收，倒置于培养箱中37℃培养48h。选取菌落数在30～300个之间的平板计数，典型的解淀粉芽胞杆菌菌落表面粗糙，不透明，边缘不规则，呈浅米黄色，消耗培养基中的淀粉在菌落周围产生透明圈。芽胞数除以菌数即为芽胞率。6.4杂菌率的测定(好氧或兼性厌氧杂菌)从用来测定有效活菌数且已经过10倍系列稀释的样品中，选取10⁶、10⁶、10~3个稀释度进行杂菌7储运7.1应贮存在通风、干燥、清洁的仓库，仓库内无有害气体、易燃易爆物品及有腐蚀性的化学物远离热源。7.2长途运输时，防止日晒、雨淋，避免长期受压和机械损伤。产品不应和易燃、易爆、易腐蚀的物品同车(或其他运输工具)装运。4(规范性附录)纯度和性能检查灭菌一级菌种接种发酵无菌空气发酵物检测不合格合格按规定处理发酵后处理质量检测不合格合格按规定处理出厂图A.1解淀粉芽胞杆菌生产技术流程图5(资料