TRIZOL试剂提取RNA方法

TRIZOL试剂警告：接触皮肤或误吞将导致中毒或灼伤。接触皮肤之后立即用去垢剂和水冲洗。若感到不适，请遵医嘱（可能的话出示标签）。收到药品后，在室温下存储。以已证明TRIZOL在常温下可稳定储存12个月。说明：TRIZOL是一种从细胞和组织中提取总RNA的现用试剂。该试剂是一种苯酚异硫氰酸酯单相溶液，它发展自Chomczynski和Sacchi的RNA一步抽提法。在细胞破碎和溶解细胞组分时，TRIZOL可以保持细胞匀浆或抽提物中RNA的完整性。离心后加入氯仿，将溶液分为水相和有机相。RNA只留在水相中。转移水相后，用异丙醇沉淀回收RNA。除去水相后，样品中的DNA和蛋白质也可以用后续沉淀方法回收。用乙醇从相界面间沉淀DNA，异丙醇从有机相回收蛋白质。DNA的共纯化可能对样品间RNA产量的正常化有用。这项提取技术对人、动物、植物或细菌来源的各种量的组织（低至50-100mg，高至≥1g）和细胞（低至5×106，高至＞107）都有良好的效果。其简单的操作方法允许同时处理大量样品。整个过程可在1小时内完成。用TRIZOL提出的总RNA不含蛋白质和DNA污染，可用来做Northern电泳分析、斑点杂交、poly(A)+选择、体外翻译、RNA酶保护分析和分子克隆。在PCR和扩大DNA酶Ⅰ梯度分离中，建议使用一个内含子中的两个引物。TRIZOL简化了各种类型的大分子及小分子RNA的分离。例如，从鼠肝分离的RNA经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，显示出介于7到15kb的大分子RNA条带,（由mRNA和hnRNA组成的）两个约5kb（28S）和2kb（18S）核糖体RNA的条带，以及介于0.1到0.3kb（tRNA,5S）的小分子RNA的条带。所分离的RNA稀释于TE时A260/A280之比大于等于1.8。谨防RNase的污染：在提取中任何不正确的操作方法中都可能偶然引入RNase。由于其活性难以抑制，因此只能直接避免其引入。在处理RNA时需要注意以下规则。戴一次性手套。皮肤上往往沾有污染RNA的细菌或霉菌，并成为RNase的来源。训练良好的微生物学操作方法以避免微生物污染。使用无菌的一次性塑料实验用品和移液枪进行RNA操作，避免公共用具的Rnase交叉污染。例如，用RNA探针的实验室一般会用到RNaseA或T1以降低滤器背景，而任何不能丢弃的实验用品（如移液枪）可能沾有大量的RNaseA。TRIZOL可以有效防止RnaseA污染。下游样品的处理需要无RnaseA得玻璃或塑料器皿。玻璃器皿应该在150℃下烘烤4小时，塑料制品应用0.5M的NaOH浸泡10分钟，再用水充分冲洗，最后高压灭菌。其他注意事项：在装2ml体积的TRIZOL时，建议用透明的一次性聚丙烯管。用于更大体积时，用玻璃管或聚丙烯管，并试验其能否经受1200gTRIZOL的离心力以及氯仿的腐蚀。不要使用泄露或有裂缝的管子。离心前小心地称重平衡。离心前玻璃管需用石蜡膜封闭管口，聚丙烯管必需加盖。RNA分离技术指南警告：使用TRIZOL时一定要戴手套和护目镜。避免接触皮肤或衣服。在化学通风橱操作，避免吸入其蒸气。除特殊情况外，试验操作及试剂存储温度都要求在15-30℃。需要但无需补充的试剂：氯仿异丙醇75%乙醇（用于焦碳酸二乙酯处理水）不含RNase水或0.5%SDS溶液（不含RNase水的配制：将水加入不含Rnase玻璃瓶，添加焦碳酸二乙酯至0.01%(v/v)，静置过夜，高压灭菌；SDS溶液的配制要用焦碳酸二乙酯处理的无菌水。）匀浆化组织每50-100mg组织加入1mlTRIZOL在玻璃管中用电力匀浆机匀浆化。取样容积不能超过用于匀浆化的TRIZOL的体积的10%。单层培养细胞将1mlTRIZOL加入3.5cm培养皿，用移液枪吹打几次，直接将细胞消化。TRIZOL的加入量取决于培养皿的体积（每10cm2加1ml），而非细胞数。如果加入不足会造成提取RNA被DNA污染。悬浮培养细胞离心沉淀细胞。在TRIZOL中反复吹打使细胞消化。每5-10×106个动物、植物或酵母细胞或每LINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK1"\a\r1×107个细菌细胞加1ml消化剂。在加入LINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL之前先不要洗细胞，因为这会促进RNA的降解。如果需要破碎酵母或细菌细胞就要用到匀浆器。任选：当处理样品是一些含有大量蛋白、脂肪、多糖和胞外物质的材料如肌肉、脂肪组织、植物的块茎部分等时，还需要添加额外的分离步骤。均一化结束后，在2-8℃下以12000g离心10分钟从匀浆中除去不容部分。该部分含有细胞膜、多糖和大分子DNA，而RNA含在上清液中。脂肪组织样品需要将上层过剩的脂肪收集除去。每次都将清除过得匀浆液转移到新管中，加入氯仿，按前述步骤分离固液相。2．相分离将经过匀浆化处理的样品在15-30℃下孵育5分钟，使核蛋白复合体完全分离。每1mlLINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL加0.2ml氯仿，小心加盖。用手剧烈震管子15秒，然后在15-30℃孵育2-3分钟。在2-8℃下以最高12000g离心力离心15分钟，混合物分为成下层红色苯酚-氯仿相、相界面和上层无色水相。RNA只存在于水相。水相体积约占均一化LINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL试剂体积的60%。3．RNA沉淀将水相转到新管，如果需要分离DNA或蛋白质的话保存有机相。向水相加入异丙醇沉淀RNA，每1mlLINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL加0.5ml异丙醇。在15-30℃下孵化样品10分钟，在2-8℃下以最高12000g离心力离心10分钟。通常不可见的RNA在离心后在管底形成胶状沉淀。4．RNA洗涤弃去上清。用75%乙醇洗涤RNA一次，每1ml每1mlLINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL加1ml75%乙醇。涡旋混合样品，并在在2-8℃下以最高7500g离心力离心5分钟。5．再溶解RNA结束时简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5-10分钟）。不要用真空离心的方法干燥RNA。防止RNA完全干燥非常重要，因为那样会明显降低RNA的溶解性。部分溶解RNA样品使其A260/280比<1.6。加入无RNase水或0.5%的SDS溶液，用移液枪吹打几次，在55-60℃下孵育10分钟，溶解沉淀。（如果RNA要用于酶促反应，就要避免加入SDS。）RNA也可以溶于100%的甲酰胺（去离子），-70℃保存。RNA分离注意事项：从少量组织（1-10mg）或细胞(102-104)样品中分离RNA：向组织或细胞中加入800μlLINKWord.Document.8"C:\\DocumentsandSettings\\Administrator\\桌面\\px\\Trizol-RNA抽提.doc""OLE_LINK2"\a\rTRIZOL，用相同的方法加入氯仿按照相分离第二步操作。用异丙醇沉淀RNA之前，先加入5-10μg淀粉作为转入水相的载体。为降低粘度，在加入氯仿之前现用26计