番茄叶色黄化突变体LA3553的遗传及基因定位分析

目录\f\o"#_Toc163154541"摘要 1\o"#_Toc163154542"Abstract 1\o"#_Toc163154543"第1章导论 3\o"#_Toc163154544"1.1叶色突变体 3\o"#_Toc163154545"1.2BSA-Seq基本原理 3\o"#_Toc163154546"1.3植物中PPR蛋白家族的研究进展 4\o"#_Toc163154547"1.4技术路线 5\o"#_Toc163154548"第2章番茄苗期黄化突变体LA3553的生长与光合特性 6\o"#_Toc163154549"2.1材料与方法 6\o"#_Toc163154550"2.1.1番茄材料和种植条件 6\o"#_Toc163154551"2.1.2LA3553植株与对照野生型AC的性状观察 6\o"#_Toc163154552"2.1.3LA3553植株与对照野生型AC叶片光合色素含量的测定 6\o"#_Toc163154553"2.1.4LA3553植株与对照野生型AC叶片的光合特性实验 7\o"#_Toc163154554"2.1.5LA3553植株与对照野生型AC酶活性的测定 8\o"#_Toc163154555"2.1.6LA3553植株与对照野生型叶绿体超微结构观察 11\o"#_Toc163154556"2.2结果与分析 11\o"#_Toc163154557"2.2.1LA3553植株的主要园艺性状特点 11\o"#_Toc163154558"2.2.2LA3553植株叶片的光合色素含量分析 13\o"#_Toc163154559"2.2.3LA3553植株叶片及野生型AC的光合特性分析 15\o"#_Toc163154560"2.2.4LA3553植株叶片及野生型AC的酶活性分析 15\o"#_Toc163154561"2.2.5LA3553植株叶片及野生型AC的叶绿体超微结构观察 16\o"#_Toc163154562"2.3讨论 17\o"#_Toc163154563"第3章番茄苗期黄化突变体LA3553的关键基因定位 18\o"#_Toc163154564"3.1材料与方法 18\o"#_Toc163154565"3.1.1番茄材料和种植条件 18\o"#_Toc163154566"3.1.2植物DNA的提取 18\o"#_Toc163154567"3.1.3黄化突变体植株BSA性状定位分析 19\o"#_Toc163154568"3.2结果分析 20\o"#_Toc163154569"3.2.1番茄叶色黄化突变体的遗传分析 20\o"#_Toc163154570"3.2.2利用BSA-Seq分析对叶色突变性状进行定位分析 21\o"#_Toc163154571"3.3讨论 24\o"#_Toc163154572"第4章结论 28\o"#_Toc163154573"缩略词表 33番茄叶色黄化突变体LA3553的遗传及基因定位分析摘要TC"摘要"\fC：番茄（Solanumlycopersicum）是研究植物生长发育的模式作物之一，同时也是一种重要蔬菜作物及经济作物。叶色是植物的重要性状，叶色突变体可作为植物光合特性、叶绿体合成与降解、提高产量等研究方面的重要遗传材料，同时也可以作为标记性状用于快速鉴定品种纯度及筛选杂交后代，在新品种选育中有良好的应用前景。本研究以番茄苗期黄化突变体LA3553与野生型AC为材料，对其表型、光合特性、遗传规律3个方面进行了研究，发现突变体植株在叶长、叶宽、株高、根长等方面长势较弱。同时发现突变体中叶绿素a含量和总叶绿素含量显著降低。为进一步探索其黄化的原因，我们将突变体LA3553和野生型AC进行杂交，通过对F1代和由F1代自交得到的F2代进行表型鉴定，该黄化突变性状受到一对隐形核基因控制。利用BSA-Seq的方法进行基因定位分析，将基因定位到番茄第3条染色体上的一个五肽重复序列（PPR：Solyc03g025700）基因。关键词：番茄；叶色黄化突变体；生理特性；BSA-SeqGeneticAnalysisandGeneMappingoftheTomatoYellowLeafMutantLA3553AbstractTC"Abstract"\fC:Tomato(Solanumlycopersicum)isoneofthemodelplantsforthestudyofplantgrowthanddevelopment,aswellasanimportantvegetablecropandcashcrop.Leafcolorisanimportanttraitinplants,furthermore,leafcolormutantscanbeusedasimportantgeneticmaterialsforthestudyofchloroplastsynthesisanddegradation,photosyntheticcharacteristics,andyieldimprovement,etc.Theycanalsobeusedasmarkertraitsforrapididentificationofvarietalpurityandscreeningofhybridprogeny,andhavegoodprospectsforapplicationintheselectionandbreedingofnewvarieties.Inthisstudy,weusedthetomatoseedlingyellowingmutantLA3553andwild-typeACasmaterials,andstudiedthreeaspectsoftheirphenotypes,photosyntheticcharacteristics,andgeneticpatterns,andfoundthatthemutantplantswereweakerintermsofleaflength,leafwidth,plantheight,rootlength,andotheraspectsofgrowth.Itwasalsofoundthatchlorophyllacontentandtotalchlorophyllcontentweresignificantlyreducedinthemutant.Tofurtherexplorethecauseofitsyellowing,wecrossedthewildtypewiththemutantLA3553,andtheyellowingmutationwasasingle-generecessivemutationbyphenotypingtheF1generationandtheF2generationobtainedbyselfingfromtheF1generation.GenelocalizationanalysisusingtheBSA-Seqapproachlocalizedthegenetoapentapeptiderepeatsequence(PPR:Solyc03g025700)geneonchromosome3oftomato.Keywords:Tomato;Leafyellowingmutant;Physiologicalcharacteristics;BSA-Seq

第1章导论1.1叶色突变体叶绿素是进行光合作用的生物体内所含有的重要色素，是一类嵌在类囊体膜上的镁卟啉化合物，叶绿素的生物合成调控机理尚不完全清楚。叶片失绿突变性状较易鉴定，依照不同的失绿程度可简单划分为白化[1]、黄化[2]、浅绿[3]、黄绿[4]等表型，也有部分表现为花斑（白斑、黄斑）[5]表型。虽然部分突变体在全生育期叶片失绿[6]，但是大量突变体仅在特定的生育阶段才表现出不同程度的叶片失绿，如仅在幼苗期表现出黄化，后期恢复为绿色，或者在特定的环境条件如低温时才表现出叶片失绿，温度恢复正常后叶片也恢复为绿色表型。人工诱变的方式主要有物理诱变[7]和化学诱变[8]，其中物理诱变是利用各种辐射，例如γ射线、α粒子、β粒子、质子、中子和紫外线等，此外还有新型的离子束和激光等。而化学诱变则主要依赖于化学试剂如甲基磺酸乙酯（EMS）、2-氨基嘌呤、秋水仙素、硫酸二乙酯（DMS）等，西瓜品种“703”就是通过甲EMS诱变得到的[9]。缺失突变是指基因内的碱基数目减少，由此可能会造成编码蛋白的改变，最终造成性状改变的突变[7]。与自然突变相比，人工诱变突变频率很高并且多数可以稳定遗传，依靠人工诱变可以在短时间内获得更多的突变体，大大提高了育种的效率。但是人工诱变同样具有不定向性，在实际应用中也存在一定的局限性。1.2BSA-Seq基本原理BSA（BulkSegregationAnalysis）技术于1991年出现[10]，最初是为了鉴定F2群体中和生菜霜霉病抗性位点（Dm5/8）连锁的分子标记，该实验通过对极端表型分组（每个混池由20个左右单株形成），然后利用AFLP，RAPD，SCAR，SSR等分子标记技术，通过比较混池中的条带多态性差异，从而锁定与目标位点连锁的分子标记。该方法克服了许多常规遗传学技术的局限性，如：降低了非靶基因对检测的干扰，提高了检测结果的可靠性；突破了在农作物中很难获得近等基因系的局限；最后，该方法无需进行大规模的多态标记筛选，节省了时间。BSA是通过将一对具有相对性状的亲本杂交，从其任一分离后代群体（如F2代群体、双单倍体DH、回交群体BC、重组自交系RIL等）中，随机选出20个以上目标性状极端表型的单株，混合构建两个DNA混池。两个混池之间的DNA表现出明显差异的片段即基因的候选区域，再利用合适的分子标记对两个分离群体中的个体进行分析，完成对目标性状基因的定位。BSA有常见的方法有三种，第一种常规方法是将高通量测序（NGS）与BSA结合在一起[11]，在水稻中首次得到应用；第二种是利用Mutmap[12]，这种方法可以对由化学诱变得到的性状进行定位，第三种是使用RNA测序来进行BSR[13]，将BSA中的测序对象从DNA换成了RNA。BSA作为一种快速有效的技术，可以解决作物遗传育种中多种复杂的基因定位问题。如研究番茄黄叶卷叶病毒和辣椒卷叶病毒[14]；鉴定与辣椒成熟果实白色性状有关的基因[15]；定位控制玉米中胚轴长度的候选基因[16]；培育具有高淀粉含量特点的马铃薯等[17]。近年来,BSA分析法在标记辅助选择（MAS）育种和基因定位方面的应用也越来越多。WuL[18]等通过BSA和遗传分析筛选出控制浅绿色未成熟辣椒果实的候选基因CaPP2C35。WangG等用SLAF-seq和BSA鉴定出12个与花青素积累有关的候选基因[19]。1.3植物中PPR蛋白家族的研究进展在真核生物中，是由一系列不同的RNA结合蛋白（RBP）促进RNA成熟并进行调控的。RBP通常包含一个或多个RNA结合域。五肽重复序列（PPR）蛋白是植物细胞器中最大的RBP家族。最近研究表明，在拟南芥中，PPR基因中一共含有3种基序：一种为P型（35个氨基酸）；另外一种为S型（31个氨基酸）；还有一种为L型（35~36个氨基酸）[20]。基于PPR基序，PPR蛋白可分为P亚家族或PLS亚家族。另一方面，根据C端结构的不同，PLS亚族可分为PLS、E1、E2、E+、DYW亚族和其他亚族[21]。迄今为止，已在许多陆地植物中发现PPR蛋白。Wang等分析了近几年对整个基因组测序的33个物种，在每个物种中平均发现了大约500个PPR基因，在罂粟（Papaversomiferum）发现了多达900个成员，小粒咖啡（Coffeaarabica）和阿月浑子（Pistaciavera）分别位于第二、第三位[22]。然而，在除陆生植物以外的其他真核生物中，仅含有很少的PPR编码基因，已知含有PPR基因最多的生物是寄生原生动物布氏锥虫（Trypanosomabrucei）含有28个PPR基因[23]，酵母基因组中有5个PPR基因，人类基因组有6个PPR基因，绿藻只含有12个PPR基因[24]。大多数作用于叶绿体转录物的RNA保护因子是PPR蛋白，它们被动地结合到末端RNA区域，以防止它们被外切酶降解[25]。1.4技术路线

第2章番茄苗期黄化突变体LA3553的生长与光合特性对于植物叶色突变体研究，主要集中在拟南芥[26]、烟草[27,28]等模式植物，西瓜[9]、黄瓜[29,30]等葫芦科作物及大田作物水稻[31-33]与等作物上。相对而言，关于番茄叶色突变[34]的报道较少。本实验基于前期从国际番茄种质中心TGRC引进的叶色黄化突变体LA3553，经过多代种植，判断该叶片黄化性状能够稳定遗传。LA3553在幼苗期子叶黄化，表现为黄绿色，在后期开花结果期也持续表现为黄绿色且长势较弱，其野生型背景自交系为AC，本章针对该突变体的园艺性状与生理特性进行观察比较。2.1材料与方法2.1.1番茄材料和种植条件研究所用番茄叶色黄化突变体LA3553株系以及野生型AC自交系均由长江上游农业生物安全与绿色生产教育部重点实验室保存。首先将番茄种子浸泡在55℃水浴锅20min，热激活后静置在室温下5h，黑暗条件下置于28℃恒温培养箱中，待3-4d后种子露白，随后将其播种于混合基质（草炭：蛭石：珍珠岩=3:1:1）中，在隆平楼702房间中种植，种植的环境指标为：光照强度300μmol·m-2·s-1、16h光照（25℃）/8h黑暗（22℃）、空气相对湿度控制在65-80%，按照正常地栽培管理措施进行管理。2.1.2LA3553植株与对照野生型AC的性状观察选取种植的LA3553株系突变体植株和野生型AC正常植株各21株植株，分别在出苗后45d，调查统计其叶长、叶宽、根长和株高性状指标。2.1.3LA3553植株与对照野生型AC叶片光合色素含量的测定随机选取定植的LA3553突变体LA3553和野生型AC各10株，分别在出苗后30d和40d，测定并计算出叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素含量和总叶绿素含量的平均含量，具体方法如下：取样取新鲜植物叶片或其他绿色组织（多个植株个体取相同部位为宜），用双蒸水洗涤干净，再用吸水纸将组织表面擦拭干净，剪碎（除中脉），混匀。样品处理称取待测的已经剪碎处理的新鲜样品0.1g（可调整），共3份，分别放入试管中。每个试管中加入5ml的95％乙醇，将试样充分浸没。将样品放置于黑暗中24h后，进行比色测定。测定用95％乙醇润洗，将色素提取液倒入比色杯内（注意手持磨砂面），用95％乙醇对照调零，再分别在波长665nm、649nm和470nm下测定吸光度。计算按公式2-1、2-2、2-3分别计算叶绿素a、叶绿素b、总叶绿素浓度和类胡萝卜素的浓度（mg/L），计算得出色素的浓度后，再按下式计算组织中单位鲜重的各色素的含量（单位mg/g）：叶绿体色素的含量Ca=13.95A665－6.88A649#Cb=24.96A649－7.32A665#Cx.c=式中：Ca、Cb分别为叶绿素a和b的浓度；Cx.c为类胡萝卜素的总浓度。2.1.4LA3553植株与对照野生型AC叶片的光合特性实验随机选取植株LA3553和正常植株各15株，分别在出苗后45d，检测并统计分析其净光合速率（Pn）及蒸腾速率（Tr）。使用LI-6400便携式光合仪，方法参照说明书，操作方法参考宋丽华[35]。仪器安装连接：按照说明书依次将主机支架、电池、叶室、CO2进气缓冲瓶等装置安装好。开机：首先打开电源开关，开机预热15-20min。日常检查：按照说明书进行日常检查。叶室配置选择：选择Factorydefault（常规），其测量叶片面积为6cm2；测量方式选择M（measured），叶温传感器测量；叶型选择为B，宽叶型；保存设置，然后回车自动进入主菜单。手动测量：按F4“NewMeasurements”菜单进入测量菜单。①设定文件：创建一个新的文件，按F1“OpenLogfile”。按下回车键后输入设定的文件名称。当屏幕上有“EnterRemark”的提示时，输入需要的标记。按回车键，完成文件设置。在夹入叶片之前如果ΔCO2大于0.5或小于-0.5，按F5“Match”进行匹配。②参数设置：按labels，在页面中找到lampOFF（F5）,选择为Quantumflux，输入光强800-1000；找到TempOFF（F4）,温度设置为25℃左右；Flow设置为500μmol/s回车确认。③测定：选择所需要测定的植株的叶片（3-5次重复）。顺Bypass方向旋转碱石灰管和位于12干燥管上端的螺母。将叶片夹住（使叶片尽可能充满整个叶室空间，面积为6cm2，较小的叶片需要测量叶面积，并在测量菜单状态下按数字“3”，然后按F1修改叶面积的数值，关闭叶室，拧紧固定螺丝到合适的位置）。④等待C行PHOTO读数稳定（小数点后末位数字的上下浮动在2左右）时，就可以进行记录（按下F1“LOG”按钮或按下仪器手柄上的黑色按键2秒，就可以记录一组数据）。⑤换另一片叶片进行测量，重新标记，输入相应的名称。重复②-④。数据输出：将仪器同电脑连接，调整仪器的工作状态（在主菜单界面下按F5“UTILITY”进入应用菜单界面，继续点击“FILEEXCHANGE”，然后回车）。运行WINFX软件，点击CONNECT。然后，在LI-6400中将“USER”文件夹下的数据文件存到计算机中即可。用EXCEL软件打开，文件扩展名选择所有文件，选择分隔符为逗号，然后打开文档，即可使用数据。关闭LI-6400：按“ESCAPE”按钮返回到主菜单界面，松开叶室（留下一点间隙），将两个化学管螺旋到中间的松位置，然后关掉主机。取出电池进行充电。2.1.5LA3553植株与对照野生型AC酶活性的测定随机选取定植的LA3553突变体植株和野生型AC植株各10株植株，分别在出苗后30d、40d，测定并计算出SOD、POD、CAT酶活性，具体方法如下：（一）氮蓝四唑（NBT）法测定超氧化物岐化酶（SOD）酶液提取称取0.2g样品（不同植株最好取同一部位的新鲜叶片）洗净后置于研钵中（研钵置于冰上预冷），分3次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8），之后在冰上研磨得到匀浆，然后转到离心管，在4℃、12000g下离心20min，得到的上清夜即为酶的粗提液。酶活性测定①反应混合液配制（以60个样为准）：分别取配好的甲硫氨酸（Met）溶液162ml，EDTA-2Na溶液6ml，NBT溶液6ml，核黄素溶液6ml，混合均匀后摇匀；②将3ml的反应混合液和40μl的酶液（可视情况调整）放入指形管中，这就是反应管；在同一时间做两个对照处理，其中1个试管加入3ml的反应混合物和40μlPBS（不加入酶液）作为最大光还原管，另1个试管加入3ml的反应混合液和40μlPBS，用锡箔纸包好，作为测定时调零对照。③将试管放入光照培养箱，在4000lux光照25℃下反应20min；④完成反应后，以未照光的对照管调零，在560nm下，分别测定每个管的吸光度（OD560）。计算结果SOD的一个活性单位（U）是以抑制NBT光化还原的50％来计算。按下式计算活性：n=SOD总活性＝SOD比活力＝用每克鲜重酶（u/gFW）来表达SOD总活性；用酶单位每毫克蛋白来表示比活力单位；Ack是照光对照组的吸光度；AE是样品管的吸光度；V是样品液总体积（ml）；Vt是测量时的酶液的使用量（ml）；W表示样品的鲜重（g）；蛋白质的含量以mg/g作为单位。（二）愈创木酚过氧化物酶（POD）活性的测定酶液提取称取0.2g样品（不同植株最好取同一部位的新鲜叶片）洗净后置于研钵中（研钵置于冰上预冷），分3次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8），之后在冰上研磨得到匀浆，然后转到离心管，在4℃、12000g下离心20min，得到的上清夜即为酶的粗提液。酶活性测定①反应混合液的配制：取50mlPBS（pH6.0，0.2M）缓冲液倒入烧杯中，加入28μl愈创木酚（2-甲氧基酚）放于磁力搅拌器上进行加热和搅拌，直到溶解愈创木酚溶解，在溶液冷却之后，加入19μl30％的H2O2，混匀后放在冰箱中待用。②酶活性测定：取3ml反应液，加入40μl酶液后测定在40秒内OD470值的变化。用PBS代替酶液作为为对照进行调零。计算结果以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。按下式计算活性：POD活性=ΔA470：在反应时间内吸光度的变化；W表示样品的鲜重（g）；t表示反应时间（min）；Vt表示提取酶液总体积（ml）；Vs为测定时所取用的酶溶液体积（ml）。（三）CAT（过氧化氢酶）的测定酶液提取称取0.2g样品（不同植株最好取同一部位的新鲜叶片）洗净后置于研钵中（研钵置于冰上预冷），分3次加入1.6ml（0.6ml、0.5ml、0.5ml）50mmol/L预冷的磷酸缓冲液（pH7.8），之后在冰上研磨得到匀浆，然后转到离心管，在4℃、12000g下离心20min，得到的上清夜即为酶的粗提液。酶活性测定①反应混合液的配制：将100mlPBS（0.15M，pH7.0）与0.1546ml30%的H2O2混合均匀。②取2.9ml的反应液加入0.1ml的酶溶液，用PBS为调零，测定40s内OD240值的变化。结果计算酶活性的计算：以每minOD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=ΔA240：表示反应时间内吸光度的变化；W是样品鲜重（g）；t是反应时间（min）；Vt表示总的提取酶液体积（ml）；Vs表示测定时取用的酶溶液体积（ml）。2.1.6LA3553植株与对照野生型叶绿体超微结构观察在出苗后30d对突变体LA3553及野生型AC进行取样，通过透射电子显微镜（TEM）对叶绿体超微结构进行观察，方法参照程谟桢[36]。取样以及前固定：将用于扫描电镜的番茄叶片切割成1×3mm的长方形小块，加入2.5%戊二醛（PH=7.2）进行前固定，然后置于4℃冰箱中存放：漂洗：用0.1M磷酸缓冲液（PH=6.8）冲洗3次，每次15min；后固定：用1%锇酸固定液固定2h；漂洗：用0.1M磷酸缓冲液（PH=6.8）冲洗3次，每次15min；脱水：分别用浓度为50%、70%、90%、100%的乙醇进行脱水，每次20min，100%的三次，其它浓度各一次。100%乙醇中要加入吸水剂；置换：100%乙醇：丙酮=1：1处理一次10min，纯丙酮处理一次10min；浸透：纯丙酮：环氧树脂812包埋剂1：1处理1h，1：2处理2h，1：3处理过夜：包埋：每天加入环氧树脂812包埋剂早晚各一次，连续包埋7d：聚合：将样品置于恒温培养箱中，40℃，17d：45℃，24d；60℃，17d；修块及切片：使用ULTRACUTE型超薄切片机进行切片，切片厚度约为50到60nm，将切片用带有支持膜的样品载网捞起，放入培养皿中；染色：用醋酸铀-枸橼酸铅染色，25℃下分别对样品进行染色15-20min，用双蒸水冲洗干净后放入培养皿中待检：透射电镜观察，拍片留图。2.2结果与分析2.2.1LA3553植株的主要园艺性状特点将番茄突变体LA3553和野生型AC种子浸种催芽后，置于温周期25℃/20℃，光周期16h/8h的环境下培养。发芽后观察到突变体子叶、真叶均表现为黄绿色，野生型则为正常的绿色（图2.1）。在大棚中种植，发现突变体在整个生长周期中叶片都表现为黄绿色。在不同生长时期测量突变体与野生型的各项数据，发现突变体的长势偏弱，株高降低。相同生长天数时，突变体在株高、叶片长度、叶片宽度等方面均明显小于比野生型（图2.2）。5cm5cm5cm5cmLA3553AC图2.1突变型LA3553和野生型AC植株叶色表型Fig.2.1LeafcolorphenotypesofmutanttypeLA3553andwildtypeACCBACBA5cm5cm图2.2突变型LA3553与野生型AC植株在播种45d天后的株高、叶长、叶宽对比注：***表示p<0.001（t-test）；****表示p<0.0001（t-test）Fig.2.2Comparisonofplantheight,leaflength,

andleafwidthbetweenLA3553andACplants

at

thesameperiodNote:***meansp<0.001;****meansp<0.0001（t-test）2.2.2LA3553植株叶片的光合色素含量分析叶色差异主要由叶片中的色素种类和含量所导致，因此首先研究突变体和野生型中光合色素含量差异。在30d和40d时，选取突变体LA3553和野生型AC植株生长点下充分展开的第二片真叶，利用丙酮和乙醇浸提法测定叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素含量，总叶绿素含量则为叶绿素a和叶绿素b之和。结果显示，30d时突变体LA3553叶片中的叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素含量均显著低于野生型，而在类胡萝卜素含量方面无明显差异；40d时，突变体LA3553的叶绿素a和总叶绿素含量显著低于野生型，而叶绿素b和类胡萝卜素含量没有表现出明显差异（图2.3）。AABB图2.3突变型与野生型植株的光合色素含量。（A）30d时叶片中叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素及总叶绿素含量。（B）40d时叶片叶绿素a、叶绿素b、类胡萝卜素及总叶绿素含量注：***表示p<0.001（t-test）；****表示p<0.0001（t-test）Fig.2.3Photosyntheticpigmentcontentinleavesofmutantandwildtypeplants.(A)At30days,leafchlorophylla,chlorophyllb,carotenoidandtotalchlorophyllcontent.(B)At40days,leafchlorophylla,chlorophyllb,carotenoidandtotalchlorophyllcontentNote:***meansp<0.001;****meansp<0.0001（t-test）.2.2.3LA3553植株叶片及野生型AC的光合特性分析在子叶长出后第45d，选取突变型和野生型生长点下第二片完全展开的真叶，使用LI-6400便携式光合仪，测定其净光合速率（Pn）及蒸腾速率（Tr）。结果表明（图2.4），在生长45d时，野生型AC的净光合速率为3.16μmolCO2m-2s-1，突变体LA3553仅为0.43μmolCO2m-2s-1，突变体LA35553的净光合速率与野生型AC相比显著降低；而蒸腾速率相比没有明显差异。图2.4突变体与野生型植株光合参数测定注：***表示p<0.001（t-test）；****表示p<0.0001（t-test）Fig.2.4Photosyntheticparametersofmutantandwild-typeplantsNote:***meansp<0.001;****meansp<0.0001（t-test）.2.2.4LA3553植株叶片及野生型AC的酶活性分析叶绿体作为参与光合作用的主要细胞器，在植物的逆境响应中扮演着重要角色[37]，因此我们分别测定了超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性，来反映植物所受到的逆境影响程度。分别于子叶长出后的第30d和第40d选取生长在相同条件下、长势大小相近的两种材料生长点下第二片嫩叶进行取样测定。将1g新鲜组织叶片进行匀浆处理，加入提取液共同匀浆处理，最终定容在10mL后进行后续反应处理。所有指标的测定均达到三次生物学重复。突变体和野生型在SOD和POD活性并无较明显差异，但在CAT活性上出现了显著差异（图2.5）。图2.5突变体与野生型植株酶活性参数测定注：***表示p<0.001（t-test）；****表示p<0.0001（t-test）Fig.2.5Determinationofenzymeactivityparametersofmutantsandwild-typeplantsNote:***meansp<0.001;****meansp<0.0001（t-test）.2.2.5LA3553植株叶片及野生型AC的叶绿体超微结构观察叶绿体是绿色植物和藻类等真核自养生物细胞中专业化亚单元的细胞器，是进行光合作用的重要场所。叶绿体由叶绿体外被、类囊体和基质三部分组成。突变体LA3553的叶绿素含量明显下降，为了进一步确定突变体叶绿体结构是否发生变化，利用透射电镜对植株叶片叶绿体的超微结构进行观察。根据图2.6，野生型AC植株叶片的叶绿体形状规则且饱满，为球形、椭圆形或卵圆形，叶绿体中具有高度分化的类囊体系统，具有典型的类囊体膜和结构，基粒片层和基质片层的分层非常清晰，排列整齐规律且无断层出现。而突变体LA3553叶片中类囊体没有正常的基粒堆叠，出现明显断层。LA3553LA3553AC图2.6野生型AC与突变体LA3553叶片叶绿体透射电镜观察Fig.2.6Chloroplastobservationofwild-typeandmutantLA3553leavesbytransmissionelectronmicroscopy2.3讨论植物通过叶绿体来进行有机物质的合成，同时可以将太阳能转化成化学能，储存在有机物质中，维持植物的生命活动所需。通过对突变体LA3553和野生型AC植株的叶长、叶宽、株高等进行测量，发现突变体的各项数据都显著低于野生型，可以推测不仅仅是叶片颜色这一表观性状发生了改变，叶绿体结构及色素含量也必定发生了系列变化。研究发现，叶色突变体植株相对于野生型叶绿素的含量一般都会变化。研究发现在小麦斑点叶突变体中，叶片的黄斑数量越多，叶片的光合色素含量下降越多[38]。在光合色素含量方面，本实验结果显示，与AC相比，突变体LA3553叶片中叶绿素a及叶绿素总的含量含量均显著降低，而在类胡萝卜素的含量上没有表现出明显差异。叶色的变化与测定叶绿素含量的结果相符，本实验证明了叶绿素含量的减少是造成突变体LA3553叶色黄化的主要原因。在净光合速率（Pn）、蒸腾速率（Tr）等指标方面，生长45d时，突变体仅为0.43μmolCO2m-2s-1，野生型的净光合速率高达3.16μmolCO2m-2s-1，突变体LA3553的净光合速率显著低于野生型AC；此外，突变体的蒸腾速率与野生型相比没有明显差异。本实验突变体叶绿素含量的变化与净光合速率的变化相一致，进一步佐证了突变体植株LA3553叶色黄化主要是由于叶绿素含量减少造成的。叶绿素含量降低往往是由于叶绿体形态结构的异常，叶绿体结构的异常进而会导致叶片颜色性状的改变[39]。通过透射电镜观察，突变体LA3553中的叶绿体结构确实发生了显著改变，类囊体没有正常的基粒堆叠，出现明显的断层。可以推测是叶绿体结构、功能的改变导致了叶绿素含量的下降，进而降低了单位叶面积吸收的光能，从而导致植株叶片净光合速率的下降。

第3章番茄苗期黄化突变体LA3553的关键基因定位BSA即混合分组分析，也称集团分离分析法，是一种选择合适的亲本构建遗传群体，选取极端表型的个体组成混池进行分析的方法。调查群体表型，选取极端表型的个体进行DNA混池的构建，对两个极端表型混池及亲本进行高通量测序，并进行SNP的关联分析，最后结合物种的参考基因序列，对定位区间的基因做功能注释。相较于传统的遗传学研究方法，BSA克服了许多常规遗传学技术的局限性，如：降低了非靶基因对检测的干扰，提高了检测结果的可靠性；突破了在农作物中很难获得近等基因系的局限；最后，该方法无需进行大规模的多态标记筛选，节省了时间。在本研究中，利用杂交的方法构建遗传群体，以黄化突变体LA3553和野生型AC番茄杂交，构建子二代分离群体，随后利用群体分离分析的方法（BSA-Seq）对调控黄叶性状关键基因进行定位，利用生物信息学分析得到控制该性状的关键基因。3.1材料与方法3.1.1番茄材料和种植条件本研究所用材料番茄叶色黄化突变体LA3553株系以及野生型自交系AC杂交得到F1代，F1代自交获得F2代群体。首先将番茄种子浸泡在55℃水浴锅20min，热激活后静置在室温下5h，黑暗条件下置于28℃恒温培养箱中待3-4d后种子露白，随后将其播种于混合基质（草炭：蛭石：珍珠岩=3:1:1）中，在隆平楼702房间中种植，种植的环境指标为：光照强度300μmol·m-2·s-1、16h光照（25℃）/8h黑暗（22℃）、空气相对湿度控制在65-80%，按照正常地栽培管理措施进行管理。3.1.2植物DNA的提取正式开始前先配CTAB：2%CTAB提取缓冲液中加入其体积2%的β-巯基乙醇,放在65℃水浴锅中进行预热;期间间隔15-20min，轻摇一次；同时将异丙醇放入-20℃备用；取0.1g左右幼嫩叶片于1.5mL圆底离心管（内置两颗钢珠）中，暂放液氮中备用；将取好的样品放至用液氮预冷的8×12的板上，快速震荡，重复几次，直至成粉末状，常温静置片刻；每个离心管中加入CTAB提取液600μl，CTAB需提前预热，震荡混匀3-5min;再加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1）抽提液以破坏蛋白质，上下轻轻颠倒混匀5min左右，于离心机上12000rpm室温离心10min；取体积2/3的上清液转移至新的1.5ml离心管中，加入0.6-0.8体积的预冷的异丙醇，上下颠倒2次，轻轻混匀，-20℃沉淀20-30min，12000rpm离心10min；用移液枪吸取上清液体（注意不要吸到底部的沉淀），用预冷的75%的乙醇洗涤两次，每次3-5min，预冷的无水乙醇洗涤一次，8000rpm，2min；真空干燥机干燥10min，加入50-100μl灭过菌的双蒸水进行溶解，充分溶解后所得的溶液可直接用于PCR检测，剩余的可于-20℃保存备用。3.1.3黄化突变体植株BSA性状定位分析将突变体LA3553、野生型AC和F2代种子播种于穴盘中，种植方法与条件同3.1.1。待幼苗长到三叶一心时，取幼嫩叶片用于植物DNA的提取，提取方法同3.1.2提取DNA，每个基因型至少取30株的样品DNA。取每份≧2μg总量的DNA，OD260/280需介于1.8~2.0，样品DNA基因组重测序在上海派森诺生物科技股份有限公司进行。完成构建整个文库，需进行以下步骤：末端修复DNA片段→加ployA尾→加测序接头并进行纯化→PCR扩增。样品经过上机测序，得到图像文件，由测序平台自带软件进行转化，生成FASTQ的原始数据（RawData），即下机原始数据。对每个样品的下机数据（RawData）分别进行统计，包括样品名、GC含量、模糊碱基所占百分比以及Q20（%）和Q30（%）。测序数据包含一些带接头、低质量的Reads，这些序列会对后续的信息分析造成很大的干扰，采用FastQC（\o"http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc"http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc）对数据进行质量控制。根据比对结果，检测SNP并完成注释。通过分析SNP频率的差异，计算ΔSNP-index，定位到目标性状区域，候选基因可通过对候选位点进行注释得到。3.2结果分析3.2.1番茄叶色黄化突变体的遗传分析将黄化突变体LA3553、野生型AC进行杂交，得到F1，收种后获得F2代分离群体。所有的材料均种植于隆平楼702，观察不同编号植株叶片颜色并记录。对F1代和F2代群体叶片颜色与亲本进行比较统计，发现在F1代中，植株叶色全部表现为绿色，和野生型AC表型一致；对F2代群分离群体的叶色性状进行统计（图3.1），统计亲本两种叶色性状在群体中的分离比例。5cm5cm图3.1部分F2代表型观察Fig.3.1PartofF2representsobservation共统计155棵F2代个体的叶片颜色，据观察统计叶片绿色与叶片黄色的植株数量分别为120和35，经计算（卡方检验）χ2=0.665<χ20.05，1=3.84，符合3:1的分离比（表3-1），确定该突变性状为单基因隐形突变。表3-1F2代分离群体叶片颜色数目统计Tab.3-1Leafcolortraitstatisticsinsecondgenerationisolatedpopulation叶片颜色黄色绿色总计P实际数35120155理论数38.75116.25155总计73.75236.25310χ20.18790.6647χ20.05，1=3.843.2.2利用BSA-Seq分析对叶色突变性状进行定位分析在155株F2代分离群体中选取40株叶片颜色明显为黄色和40株叶片颜色明显为绿色的个体，提取共80个样品的DNA分别构建两个DNA混池，以AC为亲本，F2代叶色黄色池（H）、叶色绿色池（L）进行BSA测序。测序比对并利用ANNOVAR[40]软件结合本项目的参考基因组注释信息，对检测到的InDel进行功能注释和统计。使用参考序列为对象，把子代混合池的数据与参照序列进行比对，将某一位点上与参考序列基因型的不同的碱基深度与总深度定义为SNP-index，在进行序列测定前，由于选取极端性状的混池进行测序，即SNP-index值越大，该位点的SNP与突变性状的关联程度越高。默认选取超过95%阈值线的区域作为性状相关的候选区域，使用1Mb大小的窗口进滑窗分析，每次移动100Kb，Physicaldistance做横坐标，SNP-index做纵坐标，可以得到SNP-index在基因组上的分布曲线。

图3.2SNP-index分析Fig.3.2SNP-indexanalysis注：进行10000次置换检验，选取95%（绿色）、99%（橙色）置信水平作为筛选的阈值，图中的红色折线即为以窗口形式展现的△(SNP-index)分布，置信水平以上的窗口作为候选区间。为直观反映子代ED值在染色体上的分布情况，对SNP和InDel的ED值的N次方在染色体上的分布分别进行作图。ED算法通过计算不同混池之间各突变型的频率距离，采用距离差异来反映标记与目标区域的连锁强度，公式见3-1。以参考基因组的位置为横坐标，ED值的N次方作为纵坐标作图，分析结果见3-3。ED=3−1图3.3SNP&InDel在不同染色体上的ED值的N次方分布图Fig.3.3N-powerdistributionofEDValuesofSNP&InDelondifferentchromosomes综合SNP-index分析、ED分析、GPS分析和MutMap分析多种分析手段，可以确定潜在的候选区域初步定位在一个区域见表3-2。表3-2潜在候选区域Table3-2PotentialcandidateareaChrStartEndLengthSL4.0ch03240000140000001600000进一步结合候选区间见表3-3，在3号染色体上筛选出1个候选基因——Solyc03g025700，该基因编码一个PPR蛋白，其CDS序列发生了5个氨基酸的缺失。表3-3候选区间Table3-3Candidateintervals染色体SNP位点正常碱基突变碱基数据库登录号SL4.0ch032589765CCGSolyc03g025160.4SL4.0ch032885145CCTSolyc03g025520.4SL4.0ch033101732GTGGGTTTGGAAGTAAGSolyc03g025700.2SL4.0ch033188057GGASolyc03g025800.3SL4.0ch033429845CCASolyc03g026040.4SL4.0ch033753971TTCSolyc03g026320.4SL4.0ch033852141CCASolyc03g026411.1SL4.0ch033853714CCASolyc03g026411.1SL4.0ch034015792AAGSolyc03g031640.23.3讨论随着2012年番茄基因组全测序完成，对番茄的研究愈发深入，关于番茄叶色颜色突变体早在20世纪90年代就有研究，在这里对已定位到的与叶色有关的基因进行了统计（见表3-4），便于后续进行对比分析，可以看出，叶片颜色的变化主要与叶绿素的合成与降解、类囊体数量与结构、叶绿体蛋白转运有关。表3-4部分番茄叶色调控相关基因Table3-4Partialleafcolorregulationrelatedgenesintomato突变体基因ID突变表型作用机理参考文献vgSolyc07g054820新长出的幼叶白化，出现两种不同程度的白化表型：白化和黄化碱基缺失导致类囊体的数量减少，进而造成叶片出现白斑或黄斑[41]wvSolyc02g07973016℃时突变体表现为黄化/白化（但低光照时表现为绿色），随着温度的升高，叶片逐渐变绿，在30℃时，突变体和野生型颜色一致单核苷酸突变导致基因表达量降低，抑制叶绿体的分化和叶绿素合成，造成叶片白化[42]slym1Solyc08g005930叶片黄化，果实成熟延迟单核苷酸位点突变，叶绿体受损，影响光响应和色素合成，导致叶片黄化[34,36]lutescent2Solyc10g081470叶片黄化，成熟果实也表现为白黄色，雌蕊中也出现叶绿素缺失发生了碱基替换，尚不确定具体通经，推测一是类囊体膜受损，二是突变体对黑暗和高光胁迫敏感[43]ymSolyc03g122310.3Solyc05g053100.3Solyc01g111630.3Solyc11g007000.2Solyc08g066360.3叶片黄化，果实晚熟且早期表现为白色，后期变为黄色五个基因表达上调，造成叶绿体膜结构破坏、乙烯过度积累、REDOX失衡导致突变体ym出现叶片黄化[44]gene-editedlinesdefectiveinPSY1andPSY2Solyc03g031860Solyc02g081330叶片白化两个基因共同控制叶绿体中类胡萝卜素合成，活性缺失时，病毒诱导只沉默两个基因的同源基因会导致叶片褪色、类胡萝卜素水平降低和光合参数降低[45]au11号染色体上小叶基部褪为白色，并逐渐变暗，到叶片边缘为浅绿色缺乏PΦB合成酶活性，叶绿体发育受阻，叶绿素和花青素水平降低，导致表型为淡黄绿色[46]yg-212号染色体上叶片黄化抑制PΦB合成酶活性，叶绿体发育受阻[47]WAX-7叶片黄化，株高叶宽叶长显著降低叶绿素合成受阻，叶绿素分解速度变快[48]mu从真叶开始变黄，植株矮小，光合作用减弱叶绿体类囊体片层结构发生了畸形[49]nv预测的七个可能基因都位于9号染色体上生长缓慢且矮小,叶片窄小,叶色淡黄，果实偏小叶绿素含量的大幅度减少、叶绿体结构的严重受损影响了叶片的光合功能,致使净光合速率降低[50]688311号染色体上两个标记位于LEaat006、LEtat002之间子叶展开后15d变为黄色,真叶于四叶一心期开始转色,死亡时叶片颜色几乎为白色，果实也呈白色，成熟后表现红色通过降低光能吸收和提高抗氧化能力来避免过剩光能导致光氧化胁迫的产生[51]将突变体LA3553与野生型AC杂交获得F1代，将F1代进一步自交得到F2代，播种F2代，共统计155棵植株的叶色，其中叶片表现为绿色与黄色的植株数量分别为35和120，经χ2检验符合3:1的分离比，表明该突变为单基因隐性突变，这符合大多数叶色突变体的遗传方式。从F2代中随机挑选40个叶色绿色植株和40个叶色黄化植株，构建DNA混池，对两个混池进行测序比对，利用ANNOVAR对SNP进行功能注释，检测两个亲本间纯合差异的标记。结果显示，SNP主要集中分布在3号染色体上，在其他染色体上只存在少部分的SNP差异，将3号染色体上超过阈值的区域确定为首要候选区间。进一步结合候选区间，在3号染色体上筛选得到1个候选基因——Solyc03g025700。Solyc03g025700基因编码一个PPR蛋白，PPR蛋白作为序列特异性RNA结合蛋白，参与细胞器mRNA转录后加工，以保证叶绿体、线粒体等的形态和功能正常，PPR蛋白家族被发现后即被广泛研究，在此对近三年的部分研究结果进行了总结，见表3-5。表3-5参与叶绿体调控的部分PPR蛋白Table3-5PartialPPRproteinsinvolvedinchloroplastregulation蛋白名称来源PPR类型作用方式参考文献YLWSOryzasativaPatpF、ndhA、rpl2和rps12的剪接缺陷及ndhA、ndhB和rps14转录本的编辑缺陷，幼叶表现出白条[52]OsPPR9OryzasativaDYW影响rps8-C182、rpoC2-C4106、rps14-C80和ndhB-C611等的编辑，表现为叶片黄化和致死[53]OsPPR11OryzasativaP调控ndhA和ycf3-1内含子剪接的剪接，表现为叶片黄化和致死[54]GhCTSF1GossypiumhirsutumP参与rpoC1和ycf3-2转录本的内含子剪接，超表达叶片黄化[55]QED1Arabidopsisthaliana在十字花科中编辑RNA位点ndhB-291[56]OsTHA8OryzasativaPycf3异常剪接，叶片呈现淡绿色且幼苗致死[57]DG409ArabidopsisthalianaDYW通过蛋白质复合物参与RNA编辑，幼叶呈淡绿色，成熟时变绿，叶绿体和线粒体的发育受到严重破坏[58]PpPPR_32PhyscomitriumpatensP降低psaC基因的转录水平，突变体原生质体小，光合作用活性低[59]OsPGL3AOryzasativaDYWrps8-182和rpoC2-4106的RNA编辑效率及ycf3-1的剪接效率降低，突变体叶色表现为淡绿色且叶绿体发育异常[60]WAL3OryzasativaPLS调控16SrRNA和23SrRNA过程影响质体核糖体生物系统，突变体出现白化致死[61]AESArabidopsisthalianaPpsbB操作子、ycf3和ndhA的剪接效率降低，突变体表现为叶绿体膜系统塌陷、色素含量降低和光合作用减弱[25]NbIPI1NicotianabenthamianaDYWndhB-5和-6的编辑效率降低，叶片表现出严重的萎黄表型[62]在本课题中，该基因在突变体中在关键位点发生了碱基缺失，进一步导致缺失GFGSN五个氨基酸，氨基酸的缺失可能会导致某些基因无法正常表达，可能造成PPR蛋白无法正常合成，从而使叶绿体中RNA编辑无法正常进行，产生黄化表型。

第4章结论1.研究发现番茄叶色黄化突变体LA3553在幼苗期表现为子叶黄化，且该突变体在开花坐果期和结果期仍表现为植株变矮黄化。2.生理指标特征方面研究显示，番茄叶色黄化突变体LA3553叶片中叶绿素a、总叶绿素含量显著低于野生型；突变体的叶绿体中类囊体没有正常的基粒堆叠，分化受阻；突变体的净光合速率明显低于野生型。3.将番茄叶色黄化突变体LA3553与野生型AC杂交获得F1代，F1代叶色全部表现为绿色，进一步自交F1代获得F2代，叶色绿色与叶色黄化植株数量符合3:1的分离比，这证明该番茄叶色黄化突变为单个核基因控制的隐性突变。4.利用群体分离分析技术（BSA），对番茄叶色黄化突变体LA3553进行基因定位的结果显示，SNP主要集中分布在3号染色体，将3号染色体上超过阈值的区域确定为首要候选区间。进一步结合候选区间，在3号染色体上筛选得到候选基因Solyc03g025700。

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