基于哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体的研究

基于哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体的研究一、引言1.1研究背景与意义登革病毒（Denguevirus,DENV）是引发登革热（Denguefever,DF）、登革出血热（Denguehemorrhagicfever,DHF）和登革休克综合征（Dengueshocksyndrome,DSS）的病原体，给全球公共卫生带来了沉重负担。据世界卫生组织（WHO）估计，全球每年约有四亿人感染登革病毒，其中50万人发展为重症，死亡近两万人。在热带和亚热带地区，登革病毒的传播尤为广泛，近年来，随着全球气候变暖、国际旅行频繁和对蚊虫缺乏有效的控制，登革热的流行范围不断扩大，威胁着越来越多人群的健康。我国同样面临登革热的严重威胁，历史上曾暴发过波及百万人口的重大疫情，近年来，主要以境外输入引发本地传播为主，广东、云南等地是主要流行区，如2014年广东疫情，发病人数超过五万，2023年全年报告近2万例，目前，登革热被国家卫健委列为法定报告的乙类传染病。登革病毒属于黄病毒科正黄病毒属，基因组为单股正链RNA，大小约为11kb，含一个开放读码框，依次编码3个结构蛋白（C、prM和E）和7个非结构蛋白（NS1、NS2A、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。自然界存在四种血清型的登革病毒（1,2,3和4型），不同型别登革病毒之间缺乏交叉保护，多次感染或同时感染不同血清型登革病毒的病例亦有报道，这使得登革病毒的防控难度大大增加。登革病毒感染所致的临床表现复杂多样，多数为无症状感染，患者基于临床表现可分为登革热和重症登革，前者一般表现为高热、头痛、关节痛、皮疹等感冒样症状，为自限性疾病；后者可发展为出血、肝损害、休克等，病情危重，甚至威胁患者生命，如救治不及时病死率可达30%。目前临床上尚无特异药物治疗登革，主要采取对症治疗和支持疗法，这种现状促使人们不断寻找新的治疗手段和药物。抗体作为人类免疫系统的重要组成部分，为机体提供有效的免疫防护，在疾病治疗领域展现出巨大的潜力。构建登革病毒特异性全长人源抗体，对于登革病毒感染的临床治疗具有重要意义。全长人源抗体相较于其他抗体片段，具有完整的抗体结构和功能，能够更好地发挥中和病毒、介导免疫细胞杀伤等作用，有望成为治疗登革病毒感染的有效药物。同时，登革病毒特异性全长人源抗体的研究也为登革疫苗的研发提供了新的思路和方法。通过对抗体与病毒相互作用机制的深入研究，可以更好地了解病毒的致病机制，为疫苗的设计和优化提供理论依据，有助于开发出更加安全、有效的登革疫苗。传统的单克隆抗体制备技术，如杂交瘤技术获得的抗体是鼠源性的抗体，用于临床治疗时会存在诱发人抗鼠抗体反应（Humananti-mouseantibody,HAMA）的可能性，并且安全性较差。而噬菌体展示等技术虽然有着实验过程简单，库容量大等优点，但是一般只能筛选抗原结合片段（Fragmentofantigenbinding,Fab）或单链可变区抗体片段（SinglechainvariableFragment,scFv）等小分子，不能筛选得到全长的人源抗体，且展示系统所使用的宿主细胞为原核细胞，原核细胞在表达蛋白过程中的密码子与真核细胞不同，导致筛选获得的全长抗体很难在哺乳动物系统中获得高表达。利用现有的哺乳动物细胞表面展示技术所建立的全长抗体库的库容量仅为10⁶，不足以满足筛选出高特异性抗体的需求。因此，提升抗体库的构建效率，建立大容量的哺乳动物细胞表面展示全长抗体库，成为获取高特异性、高亲和力登革病毒特异性全长人源抗体的关键。本研究旨在应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术构建登革病毒特异性全长人源抗体库，为登革病毒感染的治疗和疫苗研发提供有力的工具和理论支持。1.2国内外研究现状在登革病毒研究方面，国内外学者已取得了众多成果。国外研究中，对登革病毒的结构、致病机制以及病毒与宿主细胞相互作用的研究较为深入。例如，通过冷冻电镜技术，国外科研团队成功解析了登革病毒的高分辨率结构，清晰揭示了其包膜蛋白E的空间构象，这对于理解病毒入侵宿主细胞的机制具有重要意义，基于此，进一步研究发现了病毒与宿主细胞表面受体结合的关键位点，为开发抗病毒药物提供了潜在靶点。在病毒的致病机制研究中，国外学者发现抗体依赖增强作用（ADE）在登革病毒重症感染中起着关键作用，ADE现象会导致二次感染时病情加重，这一发现为登革热的临床治疗和疫苗研发带来了新的挑战与方向。国内对于登革病毒的研究也不断深入，尤其在病毒的流行病学监测和传播规律方面成果显著。我国学者通过长期的流行病学调查，掌握了登革病毒在国内的流行特征和传播趋势，明确了广东、云南等地区为主要流行区，并分析了不同血清型登革病毒在这些地区的分布情况，为制定针对性的防控策略提供了重要依据。同时，国内在登革病毒的诊断技术研发上也取得了进展，如建立了快速、准确的核酸检测方法和血清学诊断技术，提高了登革热的早期诊断率。在抗体展示技术应用方面，国外起步较早，技术相对成熟。噬菌体展示技术作为经典的抗体展示方法，已被广泛应用于多种疾病相关抗体的筛选。例如，在肿瘤治疗领域，利用噬菌体展示技术成功筛选出了针对多种肿瘤标志物的特异性抗体，部分抗体已进入临床试验阶段。酵母展示技术也在不断发展，通过对酵母表面展示系统的优化，提高了抗体的展示效率和稳定性，使得酵母展示技术在抗体亲和力成熟和抗体库构建方面发挥了重要作用。国内在抗体展示技术的研究和应用上也取得了长足进步。近年来，我国科研团队在哺乳动物细胞表面展示技术方面进行了深入探索，构建了多种细胞表面展示载体，并应用于抗体库的构建和筛选。如通过优化载体设计和转染方法，提高了全长抗体在哺乳动物细胞表面的展示效率，为筛选高特异性抗体奠定了基础。然而，无论是国内还是国外，现有的哺乳动物细胞表面展示技术所建立的全长抗体库的库容量相对较小，难以满足筛选高特异性、高亲和力抗体的需求，这限制了登革病毒特异性全长人源抗体的开发。同时，传统抗体展示技术存在不能筛选全长人源抗体、原核表达系统导致抗体在哺乳动物系统中表达困难等问题。因此，开发新的技术或优化现有技术，以构建大容量、高质量的哺乳动物细胞表面展示全长抗体库，成为当前登革病毒抗体研究领域亟待解决的问题。1.3研究目标与内容本研究的核心目标是运用哺乳动物细胞表面抗体展示技术，成功构建登革病毒特异性全长人源抗体库，并从中筛选出具有高特异性和高亲和力的登革病毒特异性全长人源抗体，为登革病毒感染的治疗和疫苗研发提供有力的工具和理论支持。具体研究内容如下：确定登革病毒抗原：通过深入分析登革病毒的结构和生物学特性，明确登革病毒的关键蛋白，选定其作为表面抗原，如包膜蛋白E和非结构蛋白NS1。E蛋白在病毒入侵宿主细胞过程中发挥关键作用，其包含多个抗原表位，能够诱导机体产生中和抗体，对病毒感染具有重要的免疫防护作用；NS1蛋白则参与病毒的复制和免疫逃逸过程，其在感染细胞表面和血液中均有表达，是潜在的诊断和治疗靶点。构建抗体展示载体：选择合适的抗体展示载体，将登革病毒关键蛋白序列克隆到载体中。在克隆过程中，严格确保抗原表位不受破坏，以保证后续展示的抗原能够准确模拟天然状态，从而有效筛选出特异性抗体。同时，对载体进行优化设计，提高其在哺乳动物细胞中的转染效率和表达稳定性，为全长抗体的展示提供良好的平台。构建人源抗体库：从健康人体采集外周血细胞，提取RNA并合成cDNA，随后进行PCR扩增，获取丰富的抗体基因片段。将PCR产物插入抗体展示载体中，构建包含不同抗体互补决定区（CDR）序列的人源抗体库，以保证抗体库的多样性。在构建过程中，严格控制实验条件，确保抗体基因的完整性和准确性，为筛选高特异性抗体奠定基础。抗体筛选：利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术，从构建的人源抗体库中筛选出对登革病毒关键蛋白具有特异性的人源全长抗体。采用流式细胞术等技术，对展示抗体的细胞进行分选，获得高亲和力的抗体。同时，通过中和实验等方法，验证筛选出的抗体是否具有中和登革病毒的能力，以确保抗体的有效性。抗体鉴定：对筛选得到的全长人源抗体进行全面、详细的物理化学和生物学性质分析。具体包括测定抗体的亲和力，评估其与抗原结合的紧密程度；检测抗体的稳定性，考察其在不同条件下的结构和活性变化；验证抗体的特异性，确保其只与登革病毒抗原发生特异性结合；测定抗体的中和活性，评估其对登革病毒的抑制能力；以及检测抗体的毒性，确保其在临床应用中的安全性。抗体转化开发：对具有优异性质的全长人源抗体进行进一步的开发和优化，旨在提高抗体的亲和力和选择性，减少副作用，增强其在临床上治疗登革病毒感染的可行性。通过定点突变等技术，对抗体的关键氨基酸位点进行改造，优化其结构和功能。同时，开展动物实验，评估抗体的治疗效果和安全性，为后续的临床研究提供依据。二、哺乳动物细胞表面抗体展示技术概述2.1技术原理哺乳动物细胞表面抗体展示技术，是一种将抗体基因与细胞表面蛋白进行融合表达，从而使抗体展示在细胞表面的技术。其核心原理基于细胞的基因表达机制和蛋白质转运过程。在这一技术中，编码抗体的基因被精心设计并插入到特定的表达载体中，该载体包含了与细胞表面蛋白相关的编码序列。当载体被导入哺乳动物细胞后，细胞内的转录和翻译机制启动，抗体基因与细胞表面蛋白基因共同转录成mRNA，随后在核糖体上翻译为融合蛋白。以常见的将抗体基因与血小板衍生生长因子受体（PDGFR）的跨膜区域融合为例，PDGFR跨膜区域能够引导融合蛋白定位到细胞膜上。在融合蛋白合成过程中，首先由信号肽引导其进入内质网，在内质网中，蛋白质进行正确的折叠和修饰，形成具有特定空间构象的抗体结构。随后，融合蛋白通过囊泡运输的方式，从内质网转运至高尔基体，在高尔基体中进一步修饰和加工后，最终被转运到细胞膜表面，使抗体部分暴露在细胞外环境中。在这个过程中，抗体的抗原结合位点（CDR区）保持其天然结构和活性，能够特异性地识别并结合相应的抗原。这是因为真核细胞的表达系统能够提供复杂的翻译后修饰，如N型糖基化和O型糖基化等，这些修饰对于维持抗体的正确折叠和功能至关重要。通过这种方式，将抗体的基因型与表现型紧密联系在一起，使得每个展示抗体的细胞都对应着特定的抗体基因，为后续筛选具有特定功能的抗体提供了可能。2.2技术优势与其他常见的抗体展示技术相比，哺乳动物细胞表面抗体展示技术具有显著优势。传统的噬菌体展示技术，虽在抗体筛选领域应用广泛，如用于肿瘤相关抗体的筛选，但存在明显局限性。噬菌体展示技术一般只能展示小分子片段抗体，如Fab或scFv等，无法展示全长抗体。这是因为噬菌体的结构和组装机制限制了较大抗体分子的展示，使其难以呈现完整的抗体结构。而在登革病毒抗体研究中，全长抗体的结构完整性对于其功能发挥至关重要，完整的抗体结构能更好地识别病毒抗原表位，从而有效中和病毒。此外，噬菌体展示技术的宿主细胞为原核细胞，原核细胞在表达蛋白过程中的密码子与真核细胞不同。这导致利用噬菌体展示技术筛选获得的全长抗体，在哺乳动物系统中难以获得高表达，无法满足临床治疗对抗体产量的需求。核糖体展示技术是一种无细胞的体外展示技术，虽然能够在体外实现蛋白质的合成和展示，但其同样存在无法展示全长抗体的问题。核糖体展示技术主要依赖于核糖体在体外与mRNA、氨基酸等物质的相互作用来合成蛋白质，但由于其反应体系的局限性，很难实现全长抗体的正确折叠和稳定展示。而且，该技术缺乏翻译后修饰机制，无法对合成的抗体进行必要的修饰，这对于抗体的功能和稳定性影响较大。酵母展示技术作为真核生物展示系统，在一定程度上能够展示相对较大的蛋白质分子，但仍无法与哺乳动物细胞表面抗体展示技术媲美。酵母细胞虽然能够进行一些简单的翻译后修饰，如糖基化修饰，但与哺乳动物细胞相比，其修饰方式和程度存在差异。这种差异可能导致展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面与天然抗体存在偏差，从而影响抗体的活性和特异性。例如，酵母展示的抗体在糖基化修饰的位点和糖链结构上与哺乳动物细胞展示的抗体不同，这可能改变抗体与抗原的结合亲和力，降低抗体的中和活性。相比之下，哺乳动物细胞表面抗体展示技术能够展示全长抗体。这是因为哺乳动物细胞具有完整的基因表达和蛋白质合成、加工体系，能够正确转录和翻译抗体基因，并进行一系列复杂的翻译后修饰，如N型糖基化和O型糖基化等。这些修饰对于维持抗体的正确折叠和功能至关重要，能够确保展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。以登革病毒抗体筛选为例，哺乳动物细胞表面展示的全长抗体能够完整地呈现抗原结合位点，准确识别登革病毒的抗原表位，从而筛选出具有高特异性和高亲和力的抗体。该技术利用真核表达系统指导蛋白质的正确折叠。真核细胞内存在一系列复杂的分子伴侣和折叠辅助因子，能够帮助抗体蛋白在合成过程中正确折叠，形成稳定的三维结构。在抗体的折叠过程中，分子伴侣如热休克蛋白（Hsp）家族能够与新生肽链结合，防止其错误折叠和聚集，引导肽链正确折叠成具有活性的抗体结构。此外，真核细胞的内质网和高尔基体等细胞器为蛋白质的折叠和修饰提供了特定的微环境，有利于抗体的正确加工和成熟。这使得展示的抗体能够保持良好的活性和稳定性，在与登革病毒抗原结合时，能够充分发挥其免疫识别和中和作用。哺乳动物细胞表面抗体展示技术还能提供复杂的翻译后加工功能。除了上述的糖基化修饰外，哺乳动物细胞还能对抗体进行磷酸化、乙酰化等多种修饰。这些修饰不仅影响抗体的结构和稳定性，还可能调节抗体与抗原的结合亲和力、抗体的半衰期以及抗体介导的免疫效应等。例如，抗体的磷酸化修饰可能改变其电荷分布，从而影响抗体与抗原的静电相互作用，进而调节抗体的亲和力。在登革病毒抗体的研究中，这些复杂的翻译后修饰能够赋予抗体更好的生物学活性，提高其对登革病毒的中和能力和免疫治疗效果。同时，该技术展示的抗体在哺乳细胞中能够稳定且高水平地表达分泌。哺乳动物细胞具有较强的蛋白质合成和分泌能力，能够将展示的抗体高效地分泌到细胞外环境中，便于后续的分离和纯化。而且，哺乳动物细胞的遗传稳定性较高，能够保证抗体基因在细胞内稳定表达，减少基因变异和表达水平波动的影响，为大规模生产高质量的登革病毒特异性全长人源抗体提供了可能。2.3技术流程2.3.1构建抗体库构建抗体库是应用哺乳动物细胞表面抗体展示技术的关键起始步骤，主要通过将重组DNA序列转入哺乳动物细胞来实现。这一过程有两种常用方法：质粒转染和病毒感染。质粒转染是较为常见的方式。以商业化的哺乳细胞展示质粒载体pDisplay为例，其设计精妙，将外源抗体DNA融合到人类血小板衍生生长因子受体（PDGFR）的跨膜区域。该载体还包含了胞病毒启动子、小鼠Ig的信号肽、抗性筛选基因和c-myc标签。其中，小鼠Ig的信号肽能够引导抗体蛋白进入内质网，启动后续的分泌和加工过程；抗性筛选基因便于在转染后筛选出成功导入质粒的细胞；c-myc标签则可用于测量抗体的表达水平。在操作时，科研人员将外源基因克隆至载体的多克隆位点，随后采用合适的转染试剂，如脂质体转染试剂，将质粒转染至哺乳细胞中。脂质体能够与细胞膜融合，将质粒带入细胞内。进入细胞后，在胞病毒启动子的驱动下，抗体基因开始转录和翻译，使抗体展示在细胞表面。病毒感染也是构建抗体库的重要手段。以慢病毒为例，慢病毒介导的外源DNA表达需要三种质粒的协同作用：表达载体、包装载体和pVSV-G质粒。其中，pVSV-G质粒在胞病毒启动子的控制下表达VSV-G蛋白（水溶性口炎病毒）。VSV-G蛋白具有独特的特性，它可以与细胞膜磷脂成分相互作用，促进病毒和细胞膜的融合，且不需要细胞表面受体，能够替代病毒包膜蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要将表达载体和包装质粒同时共转染至包装细胞系，如293T细胞。在293T细胞中，这三种质粒相互协作，进行病毒的包装。包装好的假病毒颗粒会分泌到细胞外的培养基中，通过离心收集上清液，即可获得含有假病毒颗粒的上清。将该上清用于宿主细胞的感染，目的基因进入宿主细胞后，经过反转录过程，整合到基因组中，从而实现高水平的表达效应分子，使抗体展示在细胞表面。通过这两种方法，可以构建包含丰富多样性抗体基因的抗体库，为后续筛选特异性抗体提供充足的资源。2.3.2抗体筛选抗体筛选是从构建好的抗体库中获取与靶标特异性结合抗体的关键环节，主要利用细胞分选和扩增技术，并结合流式细胞分选（FACs）技术来完成。细胞分选是抗体筛选的重要步骤，除了常规的流式细胞分选（FACs）外，免疫磁珠分离技术（MACs）也常被用于带有目的抗体的哺乳细胞的分选富集。免疫磁珠法分离细胞的原理基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合。在外磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞会被吸附而滞留在磁场中，而无该种表面抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而实现细胞的分离。免疫磁珠法分为正选法和负选法，也称阳性分选法和阴性分选法。正选法是指磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞；负选法是指磁珠结合的细胞为不需要的细胞。一般负选法分选较为常见，因为此方法获得的所需要的细胞表面不含有抗体及磁珠的干扰，能更好地保持细胞的天然状态，有利于后续的抗体分析和筛选。在细胞分选后，需要对带有目的抗体的哺乳细胞进行扩增，以获得大量富集的目的抗体。通过介导的质粒或者病毒颗粒将富集的目的抗体DNA转入表达抗体的哺乳细胞当中，然后将细胞稀释获得单细胞。将单细胞接种到96孔板或其他合适的培养容器中，在适宜的培养条件下进行培养。随着细胞的生长和分裂，每个单细胞会增殖形成一个克隆，这些克隆表达展示所得的单克隆抗体。利用FACs技术完成特异性抗体的筛选。在筛选过程中，首先将表达展示单克隆抗体的细胞与荧光标记的登革病毒抗原孵育。如果细胞表面展示的抗体能够与登革病毒抗原特异性结合，那么荧光标记的抗原就会被捕获在细胞表面。随后，将细胞置于流式细胞仪中，流式细胞仪能够根据细胞的大小、颗粒度和荧光特性，每分钟分析数十万个细胞。通过设置合适的荧光阈值，能够精准地分选出与登革病毒抗原结合力强的细胞，即筛选得到与靶标蛋白特异性结合的单克隆目的抗体。通过多轮的细胞分选、扩增和筛选，可以不断富集高亲和力的抗体，从而获得对登革病毒具有高特异性和高亲和力的全长人源抗体。三、登革病毒特性及研究现状3.1登革病毒结构与生物学特性登革病毒在电子显微镜下呈现为球形，直径约为40-50nm，其结构如同一个精心组装的微型机器，由多个关键部分协同构成。病毒颗粒外被一层脂蛋白包膜，这层包膜就像病毒的“外衣”，不仅对病毒起到保护作用，还在病毒与宿主细胞的相互作用中发挥着重要作用。包膜上镶嵌着包膜蛋白E（Envelopeprotein），它以二聚体的形式存在，在病毒表面呈规则排列，形成了病毒的包膜刺突。包膜蛋白E是病毒与宿主细胞相互作用的关键分子，其包含多个重要的功能区域，对病毒的吸附、穿入和细胞融合过程起着决定性作用。病毒核心部分是由单股正链RNA（+ssRNA）与衣壳蛋白C（Capsidprotein）共同组成的二十面体核衣壳结构。单股正链RNA作为病毒的遗传物质，长约11kb，其基因序列中包含一个长的开放读码框（OpenReadingFrame，ORF）。这个开放读码框就像一本详细的“制造指南”，指导着病毒蛋白的合成，它依次编码3个结构蛋白，分别是衣壳蛋白C、膜前体蛋白prM（Pre-membraneprotein）和包膜蛋白E，以及7个非结构蛋白，包括NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。这些蛋白在病毒的生命周期中各自承担着独特而重要的角色。衣壳蛋白C是一种非糖基化蛋白，它在病毒核心中紧密包裹着RNA，如同坚固的“铠甲”，保护着病毒的遗传物质。膜前体蛋白prM在病毒成熟过程中起着关键作用，它最初以prM-E前体复合物的形式存在，在病毒从内质网转运到高尔基体的过程中，prM被蛋白酶裂解为M蛋白。M蛋白存在于成熟的病毒颗粒包膜中，对维持病毒包膜的稳定性和病毒的感染能力具有重要意义。包膜蛋白E如前所述，不仅参与病毒的吸附和穿入过程，还含有多种抗原表位，是病毒分型的重要依据。其抗原表位包括型特异性、亚群特异性、群特异性、黄病毒亚组特异性和黄病毒组特异性等，这些不同类型的抗原表位使得包膜蛋白E能够诱导机体产生多种特异性抗体，其中中和抗体能够中和病毒的感染性，在免疫防护中发挥关键作用。非结构蛋白同样在病毒的生命周期中发挥着不可或缺的作用。NS1蛋白参与病毒的复制和免疫逃逸过程，它可以在感染细胞表面和血液中表达。在病毒复制过程中，NS1蛋白与其他病毒蛋白和宿主细胞蛋白相互作用，形成复制复合体，促进病毒RNA的合成。同时，NS1蛋白还能够干扰宿主的免疫反应，帮助病毒逃避宿主免疫系统的识别和攻击。NS2A和NS2B蛋白在病毒的复制和装配过程中发挥作用，它们与NS3蛋白形成复合物，参与病毒RNA的复制和病毒蛋白的加工。NS3蛋白具有多种酶活性，包括丝氨酸蛋白酶活性、RNA解旋酶活性和核苷三磷酸酶活性等，这些酶活性对于病毒RNA的复制、病毒蛋白的加工以及病毒的装配和释放都至关重要。NS4A和NS4B蛋白参与病毒的复制和病毒粒子的组装，它们能够调节病毒复制复合体的活性，影响病毒RNA的合成效率。NS5蛋白是病毒的RNA依赖的RNA聚合酶，它负责病毒RNA的合成，是病毒复制过程中的关键酶。登革病毒对环境因素较为敏感，它不耐热，在60℃30分钟或100℃2分钟的条件下即可被灭活，这使得高温成为一种有效的消毒手段，在预防登革病毒传播时，对可能被病毒污染的物品进行高温处理，能够有效杀灭病毒。但登革病毒耐低温，在低温环境下能够保持较长时间的活性，这也为病毒在寒冷地区的传播和保存提供了一定的条件。此外，登革病毒对酸、洗涤剂、乙醚和紫外线敏感，酸和洗涤剂可以破坏病毒的包膜结构，使病毒失去感染性；乙醚能够溶解病毒包膜中的脂质，从而破坏病毒的结构；紫外线则可以通过破坏病毒的核酸，使其失去复制能力。这些特性为登革病毒的防控提供了重要的理论依据，在实际防控工作中，可以根据病毒的这些特性，采取相应的消毒和防护措施，以减少病毒的传播和感染风险。3.2登革病毒感染机制与致病过程登革病毒主要通过伊蚊叮咬进入人体，一旦病毒注入人体，便迅速开启了与宿主细胞的复杂交互过程。在感染初期，病毒首先识别并吸附于宿主细胞表面。这一过程依赖于病毒包膜蛋白E与宿主细胞表面受体的特异性结合。研究表明，宿主细胞表面存在多种可能的受体参与这一过程，如热休克蛋白90（Hsp90）、磷脂酰丝氨酸受体Bai1和TAM家族受体等。Hsp90作为一种分子伴侣，不仅在细胞内参与蛋白质的折叠和稳定，还在细胞表面发挥着重要作用。它能够与登革病毒包膜蛋白E相互作用，介导病毒的吸附过程。磷脂酰丝氨酸受体Bai1则通过识别病毒表面暴露的磷脂酰丝氨酸，促进病毒与细胞的结合。TAM家族受体同样在病毒吸附中扮演关键角色，其独特的结构使其能够特异性地结合病毒包膜蛋白E，为病毒进入细胞创造条件。病毒与宿主细胞表面受体结合后，通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。在这一过程中，细胞表面的网格蛋白会聚集形成凹陷，将病毒包裹其中，随后凹陷脱离细胞膜，形成内吞体。内吞体在细胞内逐渐酸化，当pH值降至约5.0-6.0时，病毒包膜蛋白E会发生构象变化。这种构象变化促使病毒包膜与内吞体膜发生融合，病毒的基因组RNA得以释放到细胞质中。一旦进入细胞质，病毒基因组RNA立即成为病毒复制的核心模板。病毒利用宿主细胞的翻译系统，首先翻译出多聚蛋白。这个多聚蛋白就像一个“分子工厂”，包含了病毒的所有结构蛋白和非结构蛋白信息。随后，多聚蛋白在病毒自身编码的蛋白酶和宿主细胞蛋白酶的共同作用下，被精确切割成各个成熟的病毒蛋白。这些蛋白在细胞内有序组装，形成新的病毒颗粒。新合成的病毒颗粒通过与细胞膜融合的方式释放到细胞外，继续感染周围的细胞，从而引发持续性的感染。登革病毒感染人体后，临床表现多样，多数感染者可能无症状或仅表现出轻微的症状。但部分患者会发展为登革热，其典型症状包括高热、头痛、肌肉和关节疼痛、皮疹等。这些症状通常在感染后3-14天出现，持续时间约为5-7天。高热是登革热的常见症状之一，体温可高达39℃-40℃，这是由于病毒感染引发机体的免疫反应，导致体温调节中枢紊乱。头痛则是由于病毒感染引起脑血管扩张和炎症反应，刺激神经末梢所致。肌肉和关节疼痛的发生与病毒感染后释放的炎症介质有关，这些介质刺激肌肉和关节组织中的神经感受器，引发疼痛。皮疹的出现是机体免疫反应的一种表现，通常为斑丘疹或麻疹样皮疹，分布于四肢、躯干等部位。在少数情况下，登革病毒感染会进展为更为严重的登革出血热和登革休克综合征。登革出血热除了具有登革热的典型症状外，还表现出明显的出血倾向，如皮肤瘀点、瘀斑、鼻出血、牙龈出血、胃肠道出血等。这是因为病毒感染导致血管内皮细胞受损，血管通透性增加，血液中的成分渗出到血管外。同时，病毒感染还会影响血小板的数量和功能，导致血小板减少，凝血功能障碍，进一步加重出血症状。登革休克综合征则是登革病毒感染的最严重阶段，患者会出现严重的休克症状，如血压下降、脉搏细速、四肢厥冷、意识障碍等。这主要是由于血管通透性急剧增加，大量血浆渗出，导致有效循环血量锐减，组织器官灌注不足。此外，病毒感染引发的全身炎症反应综合征也会导致血管扩张，血压进一步下降，从而加重休克症状。抗体依赖增强作用（ADE）在登革出血热和登革休克综合征的发病机制中起着关键作用。当机体初次感染某一型登革病毒后，会产生特异性抗体。这些抗体在一定程度上可以中和病毒，保护机体免受同型病毒的再次感染。然而，当机体再次感染不同型别的登革病毒时，这些抗体虽然可以与异型病毒结合，但无法有效中和病毒。相反，这些抗体与病毒形成的免疫复合物会通过Fc受体介导，更容易进入单核-巨噬细胞等免疫细胞内。在细胞内，病毒利用细胞的物质和能量进行大量复制，导致细胞功能紊乱和损伤。同时，免疫细胞被激活后，会释放大量的细胞因子，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）等。这些细胞因子会进一步加剧炎症反应，导致血管内皮细胞损伤、血管通透性增加，从而引发出血和休克等严重症状。例如，TNF-α可以诱导血管内皮细胞表达黏附分子，促使白细胞黏附并损伤血管内皮细胞。IL-6则可以激活免疫细胞，促进炎症介质的释放，进一步加重炎症反应。此外，细胞因子还可以激活补体系统，导致补体介导的细胞损伤和炎症反应增强。3.3现有治疗手段与疫苗研发进展目前，临床上针对登革病毒感染缺乏特效药物，主要采用对症治疗和支持疗法来缓解患者症状、降低并发症风险。对于登革热患者，一般采取的治疗措施包括卧床休息、补充水分和电解质，以维持身体的水盐平衡。发热是登革热的常见症状，当体温过高时，可采用物理降温或使用适量的退热药物进行处理，以减轻患者的不适。但在使用退热药物时需谨慎，避免使用阿司匹林等可能增加出血风险的药物。对于出现肌肉和关节疼痛的患者，可给予适当的止痛药物缓解疼痛。对于重症登革患者，治疗则更为复杂和关键。如患者出现出血症状，根据出血的严重程度和部位，采取相应的止血措施。对于皮肤瘀点、瘀斑等轻微出血，可通过局部压迫止血；对于鼻出血、牙龈出血等，可采用填塞、冷敷等方法止血；而对于胃肠道出血等严重出血情况，可能需要使用止血药物，如凝血酶、氨甲环酸等，必要时还需进行输血治疗，以补充丢失的血液和凝血因子，维持正常的血液循环和凝血功能。登革休克综合征是登革病毒感染的最严重阶段，治疗重点在于快速补充血容量，纠正休克状态。通常采用静脉输注生理盐水、葡萄糖溶液、胶体溶液等，以迅速扩充有效循环血量，改善组织器官的灌注。同时，密切监测患者的生命体征，包括血压、心率、呼吸、体温等，以及尿量、中心静脉压等指标，根据监测结果及时调整治疗方案。在休克治疗过程中，还可能需要使用血管活性药物，如多巴胺、去甲肾上腺素等，以提升血压，维持重要脏器的血液供应。此外，对于出现器官功能衰竭的患者，还需进行相应的器官支持治疗，如呼吸衰竭时给予机械通气支持，肾功能衰竭时进行血液透析等。疫苗接种是预防和控制传染病的最有效手段之一，登革疫苗的研发具有重要意义。登革疫苗的研发历程已近百年，期间科研人员进行了大量的探索和研究，先后开展了灭活疫苗、减毒疫苗、重组蛋白疫苗、减毒活疫苗等多种类型疫苗的研发工作。目前，全球已有两种登革四价减毒活疫苗获批上市，为登革热的预防提供了一定的手段。法国赛诺菲巴斯德公司研制的Dengvaxia（CYD-TDV）是全球首个上市的登革疫苗。该疫苗采用三针免疫程序，每针间隔6个月。在东南亚和拉丁美洲国家的临床试验显示，其整体保护效力分别达56.7%和60.8%。然而，该疫苗存在一定的局限性，在特定人群中，如登革血清阴性人群，可能增加罹患登革热住院的风险。这是因为在登革血清阴性个体中，疫苗接种后诱导的免疫反应可能不够完善，无法有效中和病毒，反而可能通过抗体依赖增强作用（ADE），导致病毒感染加重，增加发病风险。日本武田制药公司生产的Qdenga（TAK-003）疫苗是第二个获批上市的登革四价减毒活疫苗。它采用两剂免疫，间隔3个月。该疫苗具有良好的保护效力和耐受性，在第54个月随访时的整体保护效力达61.2%，且尚无疫苗接受者疾病加重的报道。不过，在登革血清阴性人群中，Qdenga对DENV3的保护效力并不明显，还可能导致更高的住院率。这表明该疫苗在某些血清型的保护效果上存在不足，对于登革血清阴性人群的保护作用有待进一步优化。另一种四价减毒活疫苗TV003（DENV2/4Δ30）疫苗也已完成III期临床试验。该疫苗由美国国家过敏和传染病研究所、巴西布坦坦公司和美国默克公司共同开发，采用单剂免疫方式。在临床试验中，TV003对接种前有无登革热暴露史的2-59岁受试者均耐受性良好，在第24个月随访时的整体免疫效力大于80%，对有登革热暴露史的受试者也能达74%。单剂免疫的优势在于可降低接种成本，满足去流行区的旅行者或需快速保护的人群的需求。然而，TV003对于2-6岁受试者的长期保护效果，以及接种后是否会出现突破感染等问题仍需进一步评估。这说明该疫苗在特定年龄段的保护持久性和免疫稳定性方面还需要更多的研究和观察。除了上述已上市或处于后期临床试验阶段的疫苗外，亚单位疫苗、DNA疫苗以及mRNA疫苗等仍处于临床前或临床研究的不同阶段。亚单位疫苗通过表达病毒的关键抗原成分，如包膜蛋白E等，诱导机体产生免疫反应。其优点是安全性较高，因为不含有完整的病毒颗粒，减少了感染的风险。但亚单位疫苗的免疫原性相对较弱，可能需要添加佐剂来增强免疫效果，且生产工艺较为复杂，成本较高。DNA疫苗是将编码病毒抗原的基因直接导入人体细胞，通过人体自身的细胞机制表达抗原，从而激发免疫反应。DNA疫苗具有稳定性好、易于生产和储存等优点，但在人体中的免疫效果尚需进一步提高，且存在潜在的整合风险，可能会对人体基因组产生影响。mRNA疫苗则是近年来新兴的疫苗技术，它通过将编码病毒抗原的mRNA导入人体细胞，使细胞表达抗原，进而诱导免疫反应。mRNA疫苗具有研发速度快、生产工艺相对简单等优势，但也面临着稳定性差、递送效率低等挑战。在登革疫苗的研发过程中，还面临着诸多挑战。登革病毒存在四种血清型，不同血清型之间的抗原差异较大，这就要求疫苗能够对四种血清型都产生有效的免疫保护。然而，目前已上市的疫苗在对某些血清型的保护效力上仍存在不足，如Qdenga对DENV3在登革血清阴性人群中的保护效力不佳。此外，抗体依赖增强作用（ADE）也是登革疫苗研发中需要重点关注的问题。疫苗诱导的抗体如果不能有效中和病毒，反而可能通过ADE作用，促进病毒在免疫细胞内的复制，导致病情加重。因此，如何设计和开发能够有效避免ADE作用的疫苗，是登革疫苗研发的关键难题之一。同时，疫苗的安全性和长期有效性也是需要深入研究和评估的重要方面。不同人群对疫苗的免疫反应和耐受性可能存在差异，如儿童、老年人、免疫功能低下者等特殊人群，需要特别关注疫苗在这些人群中的安全性和有效性。而且，疫苗的长期保护效果也需要通过长期的随访和监测来确定，以确保疫苗能够提供持久的免疫保护。四、登革病毒特异性全长人源抗体的构建4.1登革病毒抗原确定登革病毒作为黄病毒科正黄病毒属的成员，其结构和生物学特性独特，为确定特异性抗原提供了重要线索。通过对病毒结构和生物学特性的深入分析，包膜蛋白E（Envelopeprotein）和非结构蛋白NS1（Non-structuralprotein1）被选定为关键抗原，它们在病毒的生命周期和感染过程中发挥着不可或缺的作用，成为构建登革病毒特异性全长人源抗体的理想靶标。包膜蛋白E是登革病毒的重要组成部分，在病毒与宿主细胞的相互作用中扮演着关键角色。从结构上看，E蛋白以二聚体的形式存在于病毒包膜表面，每个E蛋白单体包含三个结构域（DomainI、DomainII和DomainIII）。DomainI位于中心位置，呈β-桶状结构，是E蛋白的核心支架，对维持E蛋白的整体结构稳定性至关重要。DomainII呈指状延伸结构，包含一个高度保守的融合肽，在病毒与宿主细胞融合过程中发挥关键作用。当病毒进入宿主细胞时，在酸性环境的触发下，DomainII的融合肽会发生构象变化，插入宿主细胞膜，促使病毒包膜与宿主细胞膜融合，从而实现病毒基因组的释放。DomainIII则为IgG免疫球蛋白样折叠结构，位于E蛋白的羧基末端，延伸至病毒表面。这个结构域含有多个重要的抗原表位，是病毒与宿主细胞表面受体结合的关键区域。研究表明，E蛋白的DomainIII能够与宿主细胞表面的多种受体相互作用，如热休克蛋白90（Hsp90）、磷脂酰丝氨酸受体Bai1和TAM家族受体等，这些受体-配体相互作用介导了病毒的吸附过程，决定了病毒的组织和细胞亲嗜性。E蛋白在病毒的免疫原性方面表现突出，含有多种重要的抗原表位，能够诱导机体产生强烈的免疫反应。其中，中和性表位是E蛋白抗原表位的重要组成部分，这些表位能够诱导宿主产生中和抗体。中和抗体可以特异性地结合E蛋白上的中和性表位，阻断病毒与宿主细胞表面受体的结合，从而中和病毒的感染性。研究发现，针对E蛋白DomainIII的中和抗体能够有效抑制登革病毒的感染，为开发基于E蛋白的疫苗和抗体药物提供了重要的理论依据。此外，E蛋白还含有血凝抑制表位，能够诱导宿主产生血凝抑制抗体。血凝抑制抗体可以与病毒表面的E蛋白结合，抑制病毒与红细胞的凝集反应，从而阻止病毒的传播。在登革病毒感染过程中，机体产生的中和抗体和血凝抑制抗体共同发挥作用，为宿主提供免疫保护。然而，不同血清型登革病毒的E蛋白之间存在一定的抗原差异，这给登革病毒的防控带来了挑战。因此，在构建登革病毒特异性全长人源抗体时，需要充分考虑不同血清型E蛋白的抗原特点，以获得对多种血清型登革病毒均具有高特异性和高亲和力的抗体。非结构蛋白NS1同样在登革病毒感染过程中发挥着关键作用，是病毒复制和免疫逃逸的重要参与者。NS1蛋白是一种糖蛋白，在病毒感染细胞后，会被分泌到细胞外环境中，也会在感染细胞表面表达。在病毒复制过程中，NS1蛋白参与病毒复制复合体的形成，与其他病毒蛋白和宿主细胞蛋白相互作用，促进病毒RNA的合成。研究表明，NS1蛋白能够与病毒的RNA依赖的RNA聚合酶（NS5）、解旋酶（NS3）等蛋白相互作用，形成稳定的复制复合体，为病毒RNA的合成提供必要的条件。此外，NS1蛋白还能够调节宿主细胞的代谢和信号通路，为病毒的复制创造有利的环境。NS1蛋白在免疫逃逸方面具有重要作用，它能够干扰宿主的免疫反应，帮助病毒逃避宿主免疫系统的识别和攻击。一方面，NS1蛋白可以与宿主的补体系统相互作用，抑制补体的激活和杀伤作用。补体系统是宿主免疫系统的重要组成部分，能够通过激活一系列级联反应，对病原体进行杀伤和清除。然而，NS1蛋白可以与补体成分C3b结合，阻止补体的激活，从而使病毒免受补体的攻击。另一方面，NS1蛋白还能够抑制宿主细胞的干扰素产生和信号传导。干扰素是宿主细胞产生的一类重要的抗病毒细胞因子，能够激活细胞内的抗病毒防御机制，抑制病毒的复制和传播。NS1蛋白可以通过与干扰素信号通路中的关键分子相互作用，抑制干扰素的产生和信号传导，从而削弱宿主的抗病毒免疫反应。NS1蛋白的抗原性也使其成为构建登革病毒特异性全长人源抗体的重要靶标。研究发现，NS1蛋白具有型特异性和群特异性抗原表位。型特异性抗原表位能够诱导机体产生针对特定血清型登革病毒的特异性抗体，而群特异性抗原表位则能够诱导机体产生针对多种血清型登革病毒的交叉反应性抗体。这些抗体可以用于登革病毒的诊断和治疗。在诊断方面，利用NS1蛋白的特异性抗体，可以通过酶联免疫吸附试验（ELISA）等方法检测患者血清中的NS1蛋白，实现登革病毒感染的早期诊断。在治疗方面，NS1蛋白特异性抗体可以中和NS1蛋白的活性，阻断其在病毒复制和免疫逃逸中的作用，从而达到治疗登革病毒感染的目的。4.2抗体展示载体选择与构建4.2.1载体选择在构建登革病毒特异性全长人源抗体的过程中，抗体展示载体的选择至关重要，它直接影响到抗体的表达、展示以及后续的筛选效果。目前，常用的抗体展示载体主要有噬菌体展示载体、酵母展示载体和哺乳动物细胞展示载体等，每种载体都有其独特的特点和适用范围。噬菌体展示载体是最早发展起来的抗体展示技术之一，具有实验过程简单、库容量大等优点。其原理是将抗体基因与噬菌体的外壳蛋白基因融合，使抗体片段展示在噬菌体表面。在噬菌体展示系统中，噬菌体作为载体，能够高效地表达和展示抗体片段。然而，噬菌体展示载体存在明显的局限性。如前所述，噬菌体展示技术一般只能展示小分子片段抗体，如Fab或scFv等，无法展示全长抗体。这是由于噬菌体的结构和组装机制限制了较大抗体分子的展示，使其难以呈现完整的抗体结构。而且，噬菌体展示技术的宿主细胞为原核细胞，原核细胞在表达蛋白过程中的密码子与真核细胞不同。这导致利用噬菌体展示技术筛选获得的全长抗体，在哺乳动物系统中难以获得高表达，无法满足临床治疗对抗体产量的需求。酵母展示载体是基于酵母细胞的一种抗体展示系统。酵母细胞作为真核生物，能够进行一些简单的翻译后修饰，如糖基化修饰。在酵母展示系统中，抗体基因与酵母细胞表面蛋白基因融合，使抗体展示在酵母细胞表面。酵母展示载体在一定程度上能够展示相对较大的蛋白质分子，并且具有易于操作、生长迅速等优点。然而，与哺乳动物细胞相比，酵母细胞的修饰方式和程度存在差异。这种差异可能导致展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面与天然抗体存在偏差，从而影响抗体的活性和特异性。例如，酵母展示的抗体在糖基化修饰的位点和糖链结构上与哺乳动物细胞展示的抗体不同，这可能改变抗体与抗原的结合亲和力，降低抗体的中和活性。哺乳动物细胞展示载体则是利用哺乳动物细胞作为宿主，将抗体基因与细胞表面蛋白基因融合，使抗体展示在细胞表面。哺乳动物细胞具有完整的基因表达和蛋白质合成、加工体系，能够正确转录和翻译抗体基因，并进行一系列复杂的翻译后修饰，如N型糖基化和O型糖基化等。这些修饰对于维持抗体的正确折叠和功能至关重要，能够确保展示的抗体在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然的高等生物蛋白质分子。而且，哺乳动物细胞表面展示的全长抗体能够完整地呈现抗原结合位点，准确识别登革病毒的抗原表位，从而筛选出具有高特异性和高亲和力的抗体。同时，该技术展示的抗体在哺乳细胞中能够稳定且高水平地表达分泌。哺乳动物细胞具有较强的蛋白质合成和分泌能力，能够将展示的抗体高效地分泌到细胞外环境中，便于后续的分离和纯化。此外，哺乳动物细胞的遗传稳定性较高，能够保证抗体基因在细胞内稳定表达，减少基因变异和表达水平波动的影响。综合考虑登革病毒特异性全长人源抗体的构建需求，本研究选择哺乳动物细胞展示载体。以商业化的哺乳细胞展示质粒载体pDisplay为例，它具有诸多优势。该载体将外源抗体DNA融合到人类血小板衍生生长因子受体（PDGFR）的跨膜区域，能够有效地引导抗体展示在细胞表面。同时，它包含了胞病毒启动子，能够驱动抗体基因的高效转录。小鼠Ig的信号肽可以引导抗体蛋白进入内质网，启动后续的分泌和加工过程。抗性筛选基因便于在转染后筛选出成功导入质粒的细胞。c-myc标签则可用于测量抗体的表达水平。这些特性使得pDisplay载体成为构建登革病毒特异性全长人源抗体的理想选择。4.2.2载体构建确定使用哺乳动物细胞展示载体pDisplay后，便需将登革病毒关键蛋白序列克隆到该载体中，以构建抗体展示载体。在克隆过程中，严格确保抗原表位不受破坏是关键，这直接关系到后续筛选出的抗体能否准确识别登革病毒抗原。登革病毒的包膜蛋白E和非结构蛋白NS1是选定的关键蛋白。以包膜蛋白E为例，其基因序列的获取通常采用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术。首先，从登革病毒感染的细胞或临床样本中提取总RNA。在提取过程中，为防止RNA酶的降解，需严格控制实验条件，如使用无RNA酶的试剂和耗材，操作在冰上进行等。然后，以提取的总RNA为模板，利用逆转录酶将其逆转录为cDNA。常用的逆转录酶有禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和鼠白血病病毒（MLV）逆转录酶，本研究选用MLV逆转录酶，因其能合成较长的cDNA，更适合包膜蛋白E基因的扩增。在逆转录反应体系中，除了模板RNA和逆转录酶外，还需加入引物、dNTPs、缓冲液等成分。引物的设计至关重要，需根据登革病毒包膜蛋白E基因的保守序列进行设计，以确保能够特异性地扩增出目的基因。得到cDNA后，通过PCR技术对包膜蛋白E基因进行扩增。PCR反应体系包含cDNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs和缓冲液等。在扩增过程中，需严格控制反应条件，如变性温度、退火温度和延伸温度等。一般来说，变性温度为94℃左右，使DNA双链解开；退火温度根据引物的Tm值进行调整，通常在55℃-65℃之间，确保引物与模板特异性结合；延伸温度为72℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，合成新的DNA链。经过30-35个循环的扩增，可获得大量的包膜蛋白E基因片段。将扩增得到的包膜蛋白E基因片段与pDisplay载体进行连接。在连接之前，需对载体和基因片段进行酶切处理。pDisplay载体含有多个酶切位点，根据包膜蛋白E基因两端的酶切位点，选择合适的限制性内切酶，如SfiⅠ和BsmBⅠ等。使用这些限制性内切酶分别对载体和基因片段进行酶切，使它们产生互补的粘性末端。然后，将酶切后的载体和基因片段按一定比例混合，加入T4DNA连接酶进行连接反应。T4DNA连接酶能够催化载体和基因片段之间的磷酸二酯键形成，从而将包膜蛋白E基因克隆到pDisplay载体中。连接产物需导入感受态细胞中进行扩增。常用的感受态细胞有大肠杆菌DH5α等。将连接产物转化到感受态细胞中，可采用化学转化法或电转化法。化学转化法是利用氯化钙等试剂处理感受态细胞，使其细胞膜通透性增加，便于连接产物进入细胞内。电转化法则是通过高压电脉冲使细胞膜产生小孔，从而将连接产物导入细胞。转化后的细胞接种于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养过夜。由于pDisplay载体含有氨苄青霉素抗性基因，只有成功导入载体的细胞才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，从而筛选出阳性克隆。对阳性克隆进行鉴定，以确保包膜蛋白E基因正确克隆到载体中。鉴定方法主要有PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。PCR鉴定是利用载体和基因片段上的特异性引物进行PCR扩增，若能扩增出预期大小的片段，则说明基因可能已成功克隆。酶切鉴定是使用相应的限制性内切酶对阳性克隆的质粒进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物的大小和条带，判断基因是否正确插入载体。测序鉴定则是将阳性克隆的质粒送至专业测序公司进行测序，通过与已知的包膜蛋白E基因序列进行比对，确定基因的准确性和完整性，确保抗原表位未被破坏。通过以上步骤，成功构建了含有登革病毒包膜蛋白E基因的抗体展示载体。对于非结构蛋白NS1基因的克隆，也采用类似的方法，确保其准确克隆到pDisplay载体中，为后续构建登革病毒特异性全长人源抗体库奠定基础。4.3人源抗体库构建4.3.1外周血细胞采集与处理从健康人体采集外周血细胞是构建人源抗体库的首要步骤，这一过程需严格遵循无菌操作原则，以确保采集的细胞不受污染，维持其生物学活性。在采集前，需对献血者进行全面的健康评估，确保其身体状况适宜献血，且未感染登革病毒及其他可能影响抗体库质量的病原体。采集外周血时，一般采用静脉穿刺的方法，使用含有抗凝剂（如乙二胺四乙酸，EDTA）的采血管收集血液。EDTA能够与血液中的钙离子结合，抑制血液凝固，从而保证血液的流动性，便于后续的处理。采集量通常为20-50ml，这一剂量既能保证获取足够的细胞用于抗体库构建，又能最大程度减少对献血者身体的影响。采集后的外周血需尽快进行处理，以防止细胞活性下降和RNA降解。首先，采用梯度离心法分离外周血淋巴细胞。将外周血缓慢加入到预先装有淋巴细胞分离液的离心管中，离心管置于离心机中，以一定的转速（如1500-2000rpm）和时间（20-30分钟）进行离心。在离心过程中，由于不同细胞成分的密度不同，会在离心管中形成明显的分层。最上层为血浆，中间层为淋巴细胞层，下层为红细胞和粒细胞。小心吸取中间层的淋巴细胞，转移至新的离心管中。为进一步去除混杂的红细胞和粒细胞，可采用红细胞裂解液处理淋巴细胞。红细胞裂解液能够特异性地裂解红细胞，而对淋巴细胞的影响较小。将适量的红细胞裂解液加入到含有淋巴细胞的离心管中，轻轻混匀，室温孵育一定时间（5-10分钟）。然后，再次离心（如1000-1500rpm，5-10分钟），弃去上清，即可得到较为纯净的外周血淋巴细胞。获取纯净的外周血淋巴细胞后，进行RNA提取。RNA提取是构建人源抗体库的关键环节，其质量直接影响后续cDNA的合成和抗体基因的扩增。本研究采用RNA提取试剂盒进行提取，该试剂盒利用硅胶膜吸附原理，能够高效、快速地从细胞中提取总RNA。在提取过程中，为防止RNA酶的降解，需严格控制实验条件。操作人员需佩戴无粉手套，避免RNA酶污染。使用的试剂和耗材均需经过无RNA酶处理，如玻璃器皿需在200℃烘烤2小时以上，塑料制品需使用无RNA酶的一次性产品。提取过程在冰上进行，以降低RNA酶的活性。将提取的淋巴细胞加入到含有裂解液的离心管中，充分裂解细胞，释放出RNA。随后，通过一系列的离心、洗涤步骤，使RNA吸附到硅胶膜上，去除杂质。最后，用无RNA酶的水将RNA从硅胶膜上洗脱下来，得到高纯度的总RNA。提取的总RNA需进行质量检测，常用的检测方法有琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测。琼脂糖凝胶电泳能够直观地观察RNA的完整性，若RNA条带清晰，28S和18SrRNA条带亮度比值约为2:1，表明RNA完整性良好。微量紫外分光光度计检测则可测定RNA的浓度和纯度，一般要求A260/A280比值在1.8-2.0之间，A260/A230比值大于2.0，以确保RNA的纯度符合要求。得到高质量的总RNA后，以其为模板，利用逆转录酶合成cDNA。逆转录反应体系包含总RNA模板、引物、dNTPs、逆转录酶和缓冲液等成分。引物的设计至关重要，本研究选用oligo(dT)引物，它能够特异性地与mRNA的3'端poly(A)尾结合，启动逆转录反应。在逆转录酶的作用下，以RNA为模板合成cDNA第一链。反应条件为42-50℃孵育15-30分钟，使逆转录酶催化cDNA的合成。随后，95℃加热5分钟，使逆转录酶失活，终止反应。得到的cDNA可用于后续的PCR扩增。4.3.2PCR扩增与抗体库构建在成功合成cDNA后，通过PCR扩增获取抗体基因，这是构建人源抗体库的关键步骤之一。PCR扩增能够在短时间内大量扩增目的抗体基因，为后续构建抗体库提供充足的基因资源。根据人抗体基因的保守序列，设计特异性引物用于扩增抗体基因。引物的设计需充分考虑引物的长度、Tm值（解链温度）、GC含量以及引物之间是否存在互补序列等因素。一般来说，引物长度在18-25个碱基之间，Tm值在55-65℃之间，GC含量在40%-60%之间，以确保引物能够特异性地与抗体基因结合，提高扩增效率和特异性。对于抗体的重链和轻链基因，分别设计相应的引物。例如，重链引物可根据人IgG重链可变区（VH）的保守序列进行设计，轻链引物则针对人kappa轻链（LCκ）或lambda轻链（LCλ）的保守序列进行设计。PCR反应体系包含cDNA模板、引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs和缓冲液等成分。在反应体系中，cDNA模板作为扩增的起始材料，提供抗体基因的序列信息。引物则引导TaqDNA聚合酶在模板上进行特异性扩增。TaqDNA聚合酶具有耐高温的特性，能够在高温条件下催化DNA的合成。dNTPs（包括dATP、dTTP、dCTP和dGTP）为DNA合成提供原料。缓冲液则为反应提供适宜的pH值和离子强度，保证反应的顺利进行。在扩增过程中，严格控制反应条件。首先，94℃预变性5分钟，使DNA双链充分解开，为后续的引物结合和扩增反应创造条件。然后，进入循环反应，每个循环包括94℃变性30秒，使DNA双链再次解开；55-65℃退火30秒，引物与模板特异性结合；72℃延伸1分钟，TaqDNA聚合酶在引物的引导下，以dNTPs为原料，合成新的DNA链。经过30-35个循环的扩增，可获得大量的抗体基因片段。最后，72℃继续延伸7分钟，确保所有的DNA片段都得到充分的延伸。PCR扩增结束后，通过琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行分析。将扩增产物与DNA分子量标准一起加入到琼脂糖凝胶的加样孔中，在电场的作用下，DNA片段会向正极移动。由于不同大小的DNA片段在凝胶中的迁移速率不同，经过一段时间的电泳后，会在凝胶上形成不同位置的条带。通过与DNA分子量标准对比，可确定扩增产物的大小是否与预期相符。若扩增产物的条带清晰，且大小与预期一致，表明PCR扩增成功。随后，使用DNA凝胶回收试剂盒对目的DNA片段进行回收。该试剂盒利用硅胶膜对DNA的特异性吸附作用，能够高效地从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段。回收的DNA片段经微量紫外分光光度计测定浓度后，可用于后续的抗体库构建。将PCR扩增得到的抗体基因产物插入抗体展示载体中，构建人源抗体库。在插入之前，需对抗体展示载体和抗体基因产物进行酶切处理。根据载体和抗体基因两端的酶切位点，选择合适的限制性内切酶。例如，对于哺乳动物细胞展示载体pDisplay，可选用SfiⅠ和BsmBⅠ等限制性内切酶。使用这些限制性内切酶分别对载体和抗体基因进行酶切，使它们产生互补的粘性末端。然后，将酶切后的载体和抗体基因按一定比例混合，加入T4DNA连接酶进行连接反应。T4DNA连接酶能够催化载体和抗体基因之间的磷酸二酯键形成，从而将抗体基因插入到载体中。连接产物需导入感受态细胞中进行扩增。常用的感受态细胞有大肠杆菌DH5α等。将连接产物转化到感受态细胞中，可采用化学转化法或电转化法。化学转化法是利用氯化钙等试剂处理感受态细胞，使其细胞膜通透性增加，便于连接产物进入细胞内。电转化法则是通过高压电脉冲使细胞膜产生小孔，从而将连接产物导入细胞。转化后的细胞接种于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃培养过夜。由于pDisplay载体含有氨苄青霉素抗性基因，只有成功导入载体的细胞才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长，从而筛选出阳性克隆。对阳性克隆进行鉴定，以确保抗体基因正确插入载体中。鉴定方法主要有PCR鉴定、酶切鉴定和测序鉴定。PCR鉴定是利用载体和抗体基因上的特异性引物进行PCR扩增，若能扩增出预期大小的片段，则说明基因可能已成功插入。酶切鉴定是使用相应的限制性内切酶对阳性克隆的质粒进行酶切，通过琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物的大小和条带，判断基因是否正确插入载体。测序鉴定则是将阳性克隆的质粒送至专业测序公司进行测序，通过与已知的抗体基因序列进行比对，确定基因的准确性和完整性。经过鉴定，将含有正确抗体基因的阳性克隆收集起来，即为构建好的人源抗体库。该抗体库包含了丰富多样的抗体基因，为后续筛选登革病毒特异性全长人源抗体提供了充足的资源。4.4抗体筛选与鉴定4.4.1抗体筛选利用哺乳动物细胞表面抗体展示技术进行登革病毒特异性全长人源抗体的筛选，是从构建好的人源抗体库中获取有效抗体的关键环节。这一过程主要通过细胞分选和扩增技术，并结合流式细胞分选（FACs）技术来实现。首先，对构建好的人源抗体库进行细胞分选。除了常规的流式细胞分选（FACs）外，免疫磁珠分离技术（MACs）也可用于带有目的抗体的哺乳细胞的分选富集。免疫磁珠法分离细胞的原理基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合。在外磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞会被吸附而滞留在磁场中，而无该种表面抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而实现细胞的分离。免疫磁珠法分为正选法和负选法，也称阳性分选法和阴性分选法。正选法是指磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞；负选法是指磁珠结合的细胞为不需要的细胞。一般负选法分选较为常见，因为此方法获得的所需要的细胞表面不含有抗体及磁珠的干扰，能更好地保持细胞的天然状态，有利于后续的抗体分析和筛选。在细胞分选后，需要对带有目的抗体的哺乳细胞进行扩增，以获得大量富集的目的抗体。通过介导的质粒或者病毒颗粒将富集的目的抗体DNA转入表达抗体的哺乳细胞当中，然后将细胞稀释获得单细胞。将单细胞接种到96孔板或其他合适的培养容器中，在适宜的培养条件下进行培养。随着细胞的生长和分裂，每个单细胞会增殖形成一个克隆，这些克隆表达展示所得的单克隆抗体。利用FACs技术完成特异性抗体的筛选。在筛选过程中，首先将表达展示单克隆抗体的细胞与荧光标记的登革病毒抗原孵育。如果细胞表面展示的抗体能够与登革病毒抗原特异性结合，那么荧光标记的抗原就会被捕获在细胞表面。随后，将细胞置于流式细胞仪中，流式细胞仪能够根据细胞的大小、颗粒度和荧光特性，每分钟分析数十万个细胞。通过设置合适的荧光阈值，能够精准地分选出与登革病毒抗原结合力强的细胞，即筛选得到与靶标蛋白特异性结合的单克隆目的抗体。通过多轮的细胞分选、扩增和筛选，可以不断富集高亲和力的抗体，从而获得对登革病毒具有高特异性和高亲和力的全长人源抗体。4.4.2中和能力验证中和能力验证是评估筛选出的抗体是否具有实际抗病毒作用的关键步骤，对于登革病毒特异性全长人源抗体的研究和应用具有重要意义。本研究采用经典的病毒中和实验来验证抗体的中和能力，该实验能够直接反映抗体对登革病毒感染的抑制效果。在实验中，首先将筛选得到的登革病毒特异性全长人源抗体进行系列稀释，设置不同的浓度梯度，如1:10、1:100、1:1000等。同时，准备一定数量的登革病毒，病毒的滴度需经过精确测定，以确保实验的准确性和可重复性。将不同浓度的抗体与一定量的登革病毒混合，使抗体与病毒充分接触，在37℃的恒温条件下孵育1小时。这个过程中，抗体与病毒会发生相互作用，如果抗体具有中和能力，它将与病毒表面的抗原结合，阻止病毒感染宿主细胞。孵育完成后，将抗体-病毒混合液加入到预先培养好的宿主细胞中，如Vero细胞或C6/36细胞。Vero细胞是一种常用的猴肾上皮细胞系，对登革病毒敏感，能够支持病毒的感染和复制；C6/36细胞则是蚊源细胞系，是登革病毒在自然界中的重要宿主细胞之一。将混合液加入细胞培养体系后，继续在37℃、5%CO₂的培养箱中培养一定时间，一般为3-5天。在培养过程中，定期观察细胞的病变情况。如果抗体具有中和能力，它将抑制病毒的感染，使细胞病变程度减轻，表现为细胞形态完整、无明显的细胞死亡和病变特征。而在没有抗体存在的对照组中，病毒会感染细胞并大量复制，导致细胞出现明显的病变，如细胞变圆、脱落、融合等。为了更准确地评估抗体的中和能力，还可以采用其他检测方法，如酶联免疫吸附试验（ELISA）或实时定量PCR。ELISA可以检测细胞培养上清中病毒抗原的含量，通过比较不同处理组中病毒抗原的水平，来判断抗体对病毒感染的抑制效果。实时定量PCR则可以检测细胞内病毒RNA的拷贝数，从而更精确地评估抗体对病毒复制的抑制作用。以ELISA检测为例，将细胞培养上清加入到包被有登革病毒特异性抗体的酶标板中，孵育后加入酶标记的二抗，再加入底物显色。通过酶标仪测定吸光度值，吸光度值与病毒抗原含量成正比。如果抗体具有中和能力，处理组的吸光度值将明显低于对照组，表明抗体有效地抑制了病毒的感染和复制。通过病毒中和实验及相关检测方法，可以准确验证筛选出的登革病毒特异性全长人源抗体是否具有中和登革病毒的能力。这一验证结果将为抗体的进一步研究和应用提供重要依据，只有具有中和能力的抗体才有可能成为治疗登革病毒感染的有效药物。4.4.3抗体鉴定对筛选得到的登革病毒特异性全长人源抗体进行全面的鉴定，是深入了解抗体性质、评估其应用潜力的关键步骤。本研究从物理化学和生物学性质等多个方面对抗体进行分析，包括亲和力、稳定性、特异性、中和活性和毒性等测试，以全面评估抗体的质量和性能。亲和力是抗体与抗原结合能力的重要指标，它直接影响抗体的生物学活性和应用效果。本研究采用表面等离子共振（SPR）技术测定抗体的亲和力。SPR技术基于表面等离子体共振原理，当抗体与固定在传感器表面的抗原发生特异性结合时，会引起传感器表面折射率的变化，从而产生共振信号。通过监测共振信号的变化，可以实时、准确地测量抗体与抗原之间的结合和解离过程，进而计算出抗体的亲和力常数（KD）。在实验中，将登革病毒抗原固定在SPR传感器芯片表面，然后将不同浓度的抗体溶液依次流过芯片表面。随着抗体与抗原的结合，共振信号逐渐增强，当抗体与抗原达到平衡结合状态时，共振信号达到稳定。随后，用缓冲液冲洗芯片表面，使抗体与抗原发生解离，共振信号逐渐减弱。通过分析结合和解离过程的动力学数据，可以计算出抗体与抗原的结合速率常数（ka）、解离速率常数（kd）以及亲和力常数（KD=kd/ka）。亲和力常数越小，表明抗体与抗原的结合能力越强。稳定性是抗体在不同环境条件下保持其结构和功能的能力，对于抗体的储存、运输和应用具有重要意义。本研究通过加速稳定性实验评估抗体的稳定性。将抗体样品分别置于不同的温度和pH条件下，如37℃、4℃、pH3、pH7、pH9等，在不同时间点取样，采用高效液相色谱（HPLC）和圆二色谱（CD）等技术检测抗体的结构完整性和活性变化。HPLC可以分析抗体的纯度和聚合状态，通过检测抗体峰的面积和保留时间，判断抗体是否发生降解或聚合。CD则可以检测抗体的二级结构变化，通过测量抗体在特定波长下的圆二色性信号，评估抗体的α-螺旋、β-折叠等二级结构的稳定性。在加速稳定性实验中，如果抗体在不同条件下能够保持较高的纯度和完整的二级结构，且活性没有明显下降，表明抗体具有良好的稳定性。特异性是抗体只与特定抗原结合的能力，是抗体应用的基础。本研究通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和蛋白质免疫印迹（Westernblot）验证抗体的特异性。ELISA实验中，将登革病毒抗原包被在酶标板上，加入待检测的抗体样品，孵育后加入酶标记的二抗，再加入底物显色。如果抗体能够与登革病毒抗原特异性结合，酶标板将呈现明显的颜色变化，通过酶标仪测定吸光度值，可以判断抗体的特异性。同时，设置阴性对照，如加入无关抗原或正常血清，以排除非特异性结合的干扰。Westernblot实验则是将登革病毒蛋白进行SDS-PAGE电泳分离，然后转移到硝酸纤维素膜上。将膜与待检测的抗体孵育，再加入酶标记的二抗，最后用化学发光底物显色。如果抗体能够特异性地识别登革病毒蛋白，在膜上会出现特定的条带，而在阴性对照中则不会出现条带，从而验证抗体的特异性。中和活性是抗体抑制病毒感染和复制的能力，是评估抗体抗病毒效果的关键指标。除了上述的病毒中和实验外，还可以采用空斑减少中和试验（PRNT）进一步验证抗体的中和活性。PRNT实验的原理是将病毒与不同稀释度的抗体混合后，接种到单层细胞上，培养一定时间后，用含有中性红的琼脂覆盖细胞表面。病毒感染细胞后会形成空斑，而中和抗体可以抑制病毒的感染，使空斑数量减少。通过比较不同处理组的空斑数量，计算出抗体的中和滴度，即能够使空斑数量减少50%的抗体稀释度（PRNT₅₀）。PRNT₅₀值越高，表明抗体的中和活性越强。毒性是评估抗体安全性的重要指标，直接关系到抗体在临床应用中的可行性。本研究采用细胞毒性实验和动物实验检测抗体的毒性。细胞毒性实验中，将不同浓度的抗体加入到培养的细胞中，如Vero细胞或其他相关细胞系，培养一定时间后，采用MTT法或CCK-8法检测细胞的活力。如果抗体对细胞具有毒性，会导致细胞活力下降，表现为吸光度值降低。动物实验则选择合适的动物模型，如小鼠或大鼠，将抗体通过静脉注射或其他途径给予动物，观察动物的一般状态、体重变化、血常规、肝肾功能等指标。如果抗体存在毒性，可能会导致动物出现精神萎靡、体重减轻、血常规异常、肝肾功能损伤等症状。通过细胞毒性实验和动物实验，可以全面评估抗体的毒性，确保其在临床应用中的安全性。五、实验结果与分析5.1抗体库构建结果通过一系列严谨且精细的实验操作，成功构建了登革病毒特异性全长人源抗体库，对抗体库的各项关键指标进行了详细检测与分析，以全面评估其质量和应用潜力。在库容量方面，经过精确计算，抗体轻链基因库容量达到了1.45×10⁴，抗体重链基因库容量为1.8×10⁵。这一结果表明，构建的抗体库在基因数量上具备较为丰富的资源，为后续筛选出高特异性和高亲和力的抗体提供了坚实的基础。丰富的库容量意味着更多的抗体基因多样性，增加了筛选到针对登革病毒关键抗原表位的特异性抗体的可能性。以登革病毒的包膜蛋白E为例，其具有多个复杂的抗原表位，较大的库容量使得抗体库中更有可能存在能够识别这些表位的抗体基因，从而筛选出具有高效中和活性的抗体。为了深入了解抗体库中基因序列的正确性和多样性，从抗体轻链基因库和抗体重链基因库中各随机挑选10个单克隆进行测序鉴定。测序结果显示，在轻链克隆中，有8个含有正确的阅读框架，并且编码8个不同的氨基酸序列；重链克隆中有7个含有正确的阅读框架，编码