基于基因技术探究鹌鹑α、γ干扰素特性与抗病毒潜能

基于基因技术探究鹌鹑α、γ干扰素特性与抗病毒潜能一、绪论1.1研究背景鹌鹑养殖产业作为家禽养殖领域的重要组成部分，近年来在全球范围内取得了显著发展。据相关数据统计，我国鹌鹑养殖规模持续扩大，2024-2030年期间，鹌鹑养殖行业呈现出良好的增长态势，无论是养殖数量还是产量均稳步上升。鹌鹑肉蛋因其独特的营养价值备受消费者青睐，鹌鹑肉富含蛋白质、维生素及多种微量元素，肉质鲜嫩；鹌鹑蛋则以其高蛋白、低脂肪的特点，成为健康饮食的优质选择，在食品、医药及保健品等多个领域展现出广泛的应用潜力，市场需求持续增长。在鹌鹑养殖过程中，鹌鹑产业面临着诸多挑战，其中病毒病的危害尤为严重。新城疫、马立克氏病等病毒性疾病时有发生，这些疾病传播迅速，致死率高，给养殖户带来了巨大的经济损失。以新城疫为例，一旦发病，鹌鹑的死亡率可高达50%，即便存活下来的鹌鹑，其生长发育和生产性能也会受到严重影响，产蛋率大幅下降，蛋壳质量变差，软壳蛋增多。马立克氏病则会导致鹌鹑出现呆立缩头闭眼、食欲不振、消瘦、瘫痪等症状，解剖后可见肌肉、内脏、皮肤有广泛性肿瘤，严重威胁鹌鹑的健康和养殖效益。干扰素作为一种具有广泛生物活性的蛋白质，在调节机体免疫功能以及抗病毒、抗肿瘤方面发挥着重要作用，是机体防御系统的重要组成部分。干扰素能够激活和调节免疫反应，防止病原体侵入身体并加速身体对病原体的清除。在禽类养殖中，干扰素已被证实对多种病毒病具有良好的防治效果。例如，在鸡病防治中，干扰素对禽流感、鸡新城疫、传染性法氏囊病等疾病都能发挥显著的抗病毒作用，可有效降低发病率和死亡率，提高养殖效益。然而，目前关于鹌鹑干扰素的研究相对较少，尤其是鹌鹑α、γ干扰素的克隆、原核表达及抗病毒活性分析方面的研究还存在诸多空白。开展鹌鹑α、γ干扰素克隆、原核表达及抗病毒活性分析的研究，对于深入了解鹌鹑的免疫机制，开发新型抗病毒制剂，提高鹌鹑养殖的抗病能力和生产效益具有重要意义。通过克隆鹌鹑α、γ干扰素基因，实现其在原核细胞中的高效表达，获得大量具有生物活性的干扰素蛋白，进而研究其对鹌鹑常见病毒病的抗病毒活性，为鹌鹑病毒病的防治提供新的策略和方法，有助于推动鹌鹑养殖产业的健康、可持续发展，满足市场对优质鹌鹑产品的需求。1.2干扰素概述1.2.1干扰素研究进程1957年，Isaacs和Lindenmann在研究流感病毒干扰现象时，于鸡胚绒毛尿囊膜中首次发现了一种具有干扰病毒繁殖作用的可溶性物质，并将其命名为干扰素，这一发现为后续的研究奠定了基石，开启了干扰素研究的大门。1963年，Lampson等成功纯化了这种因子，并证实其为分子量在20-34KDa的蛋白质，使得人们对干扰素的物质本质有了初步认知。1980年，国际干扰素命名委员会对干扰素进行了明确的定义，指出它是一类在同种细胞上具备广谱抗病毒活性的蛋白质，其活性的发挥受细胞基因组的调节和控制，且涉及RNA和蛋白质的合成，这一定义规范了干扰素的概念，推动了相关研究的标准化和系统化。随着研究的不断深入，干扰素在医学和兽医学临床方面的应用逐渐受到关注。科学家们开始探索其在病毒性和肿瘤性疾病治疗中的潜力，并取得了一定的成效。20世纪70年代，基因工程技术的兴起为干扰素的研究带来了新的契机，科学家们开始尝试利用基因工程技术克隆和表达干扰素基因，以获得大量高纯度的干扰素蛋白，为其临床应用提供更充足的药物来源。此后，多种哺乳动物的干扰素相继被克隆并进行了生物学功能的研究，包括人和猪、犬、牛、马等，一些野生动物如大熊猫、白犀牛、鹿、狐、貉、雪貂等的干扰素基因序列也成功被报道，极大地丰富了干扰素的研究内容，拓宽了其应用领域。在禽类干扰素的研究中，1994年Sekellick首次克隆了鸡IFN-α基因，这一成果开启了禽用干扰素研究的新征程，使得研究人员能够从基因层面深入探究禽类干扰素的特性和功能。随后，针对鸡干扰素的研究不断涌现，涵盖了基因结构、作用机理、体外重组表达以及在禽类疾病防治中的应用等多个方面。近年来，随着对干扰素研究的持续深入，人们对其在免疫系统中的核心地位有了更深刻的认识，干扰素不仅在抗病毒方面发挥着重要作用，还在免疫调节、抗肿瘤等方面展现出独特的功能，成为生命科学领域的研究热点之一。1.2.2干扰素分类根据基因序列、染色体定位和受体特异性的不同，干扰素蛋白家族可分为3型，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型干扰素。Ⅰ型干扰素成员众多，在人类中编码13个部分同源的IFNα亚型（在小鼠中编码14个），还包括IFN-β以及几个定义尚不清晰的单基因产物，如IFN-ε、IFN-τ、IFN-κ、IFN-ω、IFN-δ和IFN-ζ等。这类干扰素能够耐受pH2.0的酸处理，它们具有相关的结构并共享同一类受体，主要是机体对病毒感染的应答产物，能够诱导机体产生抗病毒蛋白。Ⅱ型干扰素仅由单一基因产物IFN-γ组成，又被称为免疫干扰素或淋巴细胞干扰素。它主要由活化的T淋巴细胞在诱生剂、病毒、细菌等作用下产生，对酸性较为敏感。IFN-γ在免疫调节中发挥着关键作用，能作用于表达IFNγ受体的细胞类型，调节免疫细胞的活性和功能，增强机体的免疫防御能力。Ⅲ型干扰素包括IFN-λ1、IFN-λ2和IFN-λ3（也分别称为IL-29、IL-28A和IL-28B）以及IFN-λ4。它与Ⅰ型干扰素关系密切，虽然也具有抗病毒活性，但结合的受体与Ⅰ型干扰素受体不同，具有特殊的生理学功能，在特定的免疫反应和疾病防御中发挥作用。鹌鹑α干扰素属于Ⅰ型干扰素，具有Ⅰ型干扰素的典型特征，如广谱抗病毒活性，能够通过诱导机体产生抗病毒蛋白，抑制多种病毒的复制，在鹌鹑抵御病毒感染的过程中发挥重要作用。而鹌鹑γ干扰素属于Ⅱ型干扰素，主要参与免疫调节过程，能够激活免疫细胞，增强免疫细胞对病原体的杀伤能力，调节免疫应答的强度和方向，提升鹌鹑的免疫防御水平。1.2.3干扰素的功能干扰素具有多种重要功能，在机体的免疫防御和健康维持中扮演着关键角色。其抗病毒功能是最为人们所熟知的，干扰素作用于易感细胞后，会诱导细胞产生一系列抗病毒蛋白，如蛋白激酶、磷酸二脂酶和2-5A合成酶等。蛋白激酶和磷酸二脂酶能够破坏细胞核糖体转译病毒蛋白质，从而阻止病毒蛋白的合成；2-5A合成酶则能降解mRNA，抑制病毒基因的转录和翻译过程，有的抗病毒蛋白还能抑制转录酶，阻止mRNA的形成，有的能抑制病毒DNA和RNA的合成，通过多途径协同作用，有效地抑制病毒在细胞内的复制和传播。无论是RNA病毒还是DNA病毒，干扰素都能发挥抑制作用，只是不同病毒对干扰素的敏感性存在差异，有囊膜的病毒通常对干扰素更为敏感。在免疫调节方面，干扰素发挥着核心作用。I型干扰素与IFNAR结合后，能够诱导趋化因子的产生，使免疫细胞如淋巴细胞、巨噬细胞等招募到感染部位，增强局部的免疫反应。它还能诱导其他细胞因子的产生，调节免疫细胞之间的相互作用，形成复杂的免疫调节网络。例如，I型干扰素能够增强NK细胞杀伤靶细胞和产生IFN-γ的能力，促进NK细胞的增殖、积累和存活。同时，它也影响单核细胞和巨噬细胞的功能和分化，刺激巨噬细胞的抗体依赖性细胞毒性，调节巨噬细胞产生各种细胞因子，如TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IL-12和IL-18等。此外，I型干扰素还能促进DC的成熟、分化和迁移，增强DC对病原体的摄取、加工和呈递能力，从而激活T细胞和B细胞，启动特异性免疫应答。II型干扰素即IFN-γ，主要由活化的T淋巴细胞产生，它能激活巨噬细胞，增强其吞噬和杀伤病原体的能力，还能促进Th1细胞的分化，调节Th1/Th2细胞的平衡，增强机体的细胞免疫功能。干扰素还具有一定的抗肿瘤功能，它可以通过多种途径抑制肿瘤细胞的生长和增殖。一方面，干扰素能够诱导肿瘤细胞凋亡，激活细胞内的凋亡信号通路，促使肿瘤细胞程序性死亡；另一方面，它可以抑制肿瘤血管生成，阻断肿瘤细胞的营养供应，从而限制肿瘤的生长和转移。干扰素还能增强机体的免疫监视功能，激活免疫细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤能力，发挥抗肿瘤免疫作用。干扰素作为机体防御系统的重要组成部分，通过抗病毒、免疫调节和抗肿瘤等多种功能，有效地保护机体免受病毒感染、肿瘤侵袭等威胁，维持机体的健康平衡，在生命活动中具有不可或缺的地位。1.3禽类干扰素的相关研究在禽类干扰素的研究领域，鸡干扰素的研究起步较早且成果丰硕。1994年Sekellick首次克隆了鸡IFN-α基因，此后，针对鸡干扰素的研究不断深入，涵盖了基因结构、表达调控、生物学功能以及在鸡病防治中的应用等多个方面。研究发现，重组鸡IFN-α对鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒、新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒等多种病毒具有显著的抗病毒活性，展现出较为广谱的抗病毒作用。此外，重组鸡IFN-α还具有一定的抗肿瘤作用，能够抑制劳斯肉瘤病毒的增殖，使原有的肉瘤消失，兼具Ⅱ型干扰素的部分生物学功能。在鸡IFN-β的研究方面，虽然相对IFN-α的研究较为薄弱，但也取得了一些成果。有研究在进行入噬菌体基因文库杂交时发现鸡体内存在两种血清型的I型干扰素，其中一种被证实为鸡I型干扰素中的β亚型干扰素。对重组鸡IFN-β的生物活性分析表明，其对水泡性口炎病毒具有显著的抗病毒作用，然而，其抗病毒活性远低于重组鸡IFN-α。对于鸭干扰素的研究，目前也有一定的进展。科研人员成功克隆了鸭IFN-α基因，并对其进行了原核表达和生物学活性研究，结果显示重组鸭IFN-α对鸭瘟病毒、鸭肝炎病毒等具有一定的抑制作用。在鹅干扰素的研究中，相关学者克隆了鹅IFN-α基因，分析了其序列特征，并初步探讨了其在抗病毒感染中的作用。尽管禽类干扰素的研究取得了上述成果，但仍存在一些不足之处。一方面，目前的研究主要集中在鸡干扰素上，鸭、鹅等其他禽类干扰素的研究相对较少，对于鹌鹑等小众禽类干扰素的研究更是匮乏，这限制了对不同禽类免疫机制的全面了解和干扰素在不同禽类养殖中的广泛应用。另一方面，在干扰素的应用研究中，虽然已经证实其对多种禽类病毒病具有防治效果，但在实际生产中的应用还不够广泛和成熟，存在着生产成本高、稳定性差、使用方法不够便捷等问题，需要进一步优化生产工艺和应用技术。由于缺乏对鹌鹑干扰素的深入研究，目前在鹌鹑养殖中，针对病毒病的防治手段主要依赖传统的疫苗接种和药物治疗，然而这些方法存在一定的局限性，如疫苗的保护率有限，药物治疗可能带来药物残留和耐药性等问题。开展鹌鹑α、γ干扰素的研究，有助于填补这一领域的空白，为鹌鹑病毒病的防治提供新的思路和方法，具有重要的理论和实践意义。1.4本研究的意义本研究对鹌鹑α、γ干扰素进行克隆、原核表达及抗病毒活性分析，具有重要的理论与实践意义。在理论研究方面，目前关于鹌鹑干扰素的研究近乎空白，对其分子结构、基因序列、表达调控机制等方面的了解极为有限。本研究将填补这一知识空缺，通过克隆鹌鹑α、γ干扰素基因，深入分析其基因序列特征、结构特点以及与其他禽类干扰素的进化关系，有助于揭示鹌鹑免疫系统的独特性和进化历程。研究干扰素在鹌鹑体内的表达规律和调控机制，能够进一步丰富对禽类免疫调节网络的认识，为深入理解禽类免疫防御机制提供理论基础。从实践应用角度来看，在鹌鹑养殖中，病毒病的防治是保障养殖效益的关键环节。当前，传统的疫苗接种和药物治疗存在诸多弊端，疫苗接种后可能出现免疫失败的情况，无法提供全面的保护，且药物治疗易导致药物残留，影响鹌鹑产品的质量安全，长期使用还会使病毒产生耐药性，降低治疗效果。本研究通过原核表达获得大量具有生物活性的鹌鹑α、γ干扰素，为开发新型抗病毒制剂提供了可能。这些干扰素制剂可作为一种绿色、安全、高效的抗病毒药物，应用于鹌鹑病毒病的预防和治疗。在病毒感染初期，使用干扰素制剂能够快速激活鹌鹑的免疫系统，增强其抗病毒能力，有效抑制病毒的复制和传播，降低发病率和死亡率。对于已经感染病毒的鹌鹑，干扰素制剂也能辅助治疗，促进机体的康复，减少经济损失。本研究成果还有助于推动鹌鹑养殖产业的可持续发展。随着消费者对食品安全和品质的要求不断提高，绿色、健康的养殖模式成为行业发展的趋势。利用干扰素进行病毒病防治，符合这一发展趋势，能够减少药物的使用，提高鹌鹑产品的质量和安全性，增强市场竞争力。干扰素的应用还能提高鹌鹑的养殖效益，促进养殖产业的规模化、标准化发展，为养殖户带来更多的经济效益，带动相关产业的协同发展，对于促进农业经济增长、保障食品安全具有积极的作用。二、材料与方法2.1实验材料2.1.1细胞、病毒、实验动物实验选用SPF级鹌鹑，购自[具体供应商名称]，体重在[X]克左右，健康状况良好，饲养于[饲养环境及条件说明]的环境中，自由采食和饮水，适应环境1周后用于实验。选用鸡胚成纤维细胞（CEF），由本实验室自行制备并保存。将9-11日龄的SPF鸡胚，经消毒处理后，取出胚胎，去除头、四肢和内脏，剪碎组织块，用胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，接种于细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、5%CO₂的培养箱中培养，待细胞长成单层后备用。用于抗病毒活性分析的病毒包括新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NDV）、禽流感病毒（Avianinfluenzavirus，AIV）H9N2亚型和水泡性口炎病毒（Vesicularstomatitisvirus，VSV），均由[病毒来源机构名称]提供。这些病毒经过多次传代和鉴定，确保其毒力和活性稳定。其中，新城疫病毒是引起禽类急性、热性、败血性和高度接触性传染病的病原体，对鹌鹑的健康危害较大；禽流感病毒H9N2亚型在禽类中较为常见，可导致产蛋下降、生长迟缓等症状；水泡性口炎病毒常被用于研究干扰素的抗病毒活性，是一种模式病毒。2.1.2主要试剂RNA提取试剂TRIzol购自Invitrogen公司，其主要作用是裂解细胞，使RNA释放出来，并抑制RNA酶的活性，保证RNA的完整性，用于从鹌鹑组织中提取总RNA。反转录试剂盒PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser购自TaKaRa公司，该试剂盒含有反转录酶、引物等成分，能够将提取的总RNA反转录成cDNA，为后续的PCR扩增提供模板。高保真DNA聚合酶KOD-Plus-Neo购自Toyobo公司，具有高保真度和高效扩增的特点，能够准确地扩增目的基因片段，减少碱基错配的发生，用于扩增鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因。限制性内切酶EcoRI、XhoI购自NEB公司，用于切割载体和目的基因，以便进行连接反应，构建重组表达载体。T4DNA连接酶购自TaKaRa公司，能够催化载体和目的基因的粘性末端或平末端之间形成磷酸二酯键，实现二者的连接。质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒均购自Omega公司，分别用于从大肠杆菌中提取重组质粒和从琼脂糖凝胶中回收目的DNA片段，操作简便，回收率高。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）购自Sigma公司，是一种诱导剂，能够诱导大肠杆菌表达重组蛋白，在原核表达过程中发挥重要作用。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂购自Sigma公司，用于制备兔抗鹌鹑IFN-α、IFN-γ多克隆抗体时，增强抗原的免疫原性，促进抗体的产生。辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG购自JacksonImmunoResearch公司，用于Westernblot检测中，与兔抗鹌鹑IFN-α、IFN-γ多克隆抗体结合，通过酶催化底物显色，检测目的蛋白的表达情况。MTT试剂购自Sigma公司，是一种黄色的四氮唑盐，可被活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶还原为不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan），根据甲瓒的生成量可以间接反映细胞的存活数量，用于检测细胞活力，评估干扰素的抗病毒活性。DMSO（二甲基亚砜）购自Sigma公司，是一种有机溶剂，能够溶解MTT还原产物甲瓒，以便于在酶标仪上进行吸光度测定。2.1.3主要仪器PCR仪（型号为ABIVeriti96Well，美国ABI公司），具有精确的温度控制功能，温度范围为4.0℃-99.9℃，温度显示精确到0.1℃，升降温速度快，可达3.9℃/秒，样品实际平均温度变化速度为3.35℃/秒。该仪器能够满足PCR反应对温度的严格要求，用于扩增鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因。离心机（型号为Eppendorf5424R，德国Eppendorf公司），最大转速可达16,200×g，具有制冷功能，可在低温条件下进行离心操作，减少蛋白质和核酸的降解。主要用于细胞培养物的离心收集、RNA提取过程中的离心分离以及蛋白质纯化过程中的离心沉淀等操作。电泳仪（型号为Bio-RadPowerPacBasic，美国Bio-Rad公司），可提供稳定的电场，用于核酸和蛋白质的电泳分离。通过电泳，可以将不同大小的DNA片段或蛋白质分离开来，以便进行后续的检测和分析，如琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物、SDS-PAGE电泳检测蛋白质等。凝胶成像系统（型号为Bio-RadGelDocXR+，美国Bio-Rad公司），配备高分辨率的CCD相机和专业的图像分析软件，能够对电泳后的凝胶进行拍照和分析。可准确测定DNA条带或蛋白质条带的亮度、分子量等参数，用于检测目的基因的扩增情况和蛋白质的表达情况。酶标仪（型号为ThermoScientificMultiskanGO，美国Thermo公司），可对96孔板进行吸光度检测，用于MTT法检测细胞活力时，测定各孔的吸光度值，从而评估干扰素对细胞的保护作用和抗病毒活性。恒温培养箱（型号为ThermoScientificHeracellVIOS160i，美国Thermo公司），能够提供稳定的温度、湿度和CO₂浓度环境，温度范围为室温+5℃-50℃，CO₂浓度控制范围为0-20%。用于细胞培养和细菌培养，为细胞和细菌的生长提供适宜的条件。2.2鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因克隆2.2.1引物设计依据GenBank中已公布的鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因序列（登录号分别为[具体登录号1]、[具体登录号2]），运用PrimerPremier5.0软件进行引物设计。在设计引物时，遵循以下原则：引物长度设定在18-25bp之间，以保证引物与模板的特异性结合，长度过短可能导致引物与模板结合不稳定，过长则可能增加引物二聚体形成的概率。引物的GC含量控制在40%-60%，GC含量过高或过低都可能影响引物的退火温度和扩增效率，合适的GC含量有助于维持引物的稳定性和特异性。引物的3'端避免出现连续的3个以上的G或C，防止引物在3'端非特异性结合，影响扩增的准确性。同时，确保引物之间以及引物自身不存在互补序列，避免形成引物二聚体和发夹结构，以免消耗引物和影响扩增效果。为便于后续的克隆和表达操作，在引物的5'端分别引入EcoRI和XhoI限制性内切酶识别位点，并添加3-5个保护碱基。针对鹌鹑IFN-α基因，设计的上游引物序列为5'-[具体序列1]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列2]-3'。对于鹌鹑IFN-γ基因，上游引物序列为5'-[具体序列3]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列4]-3'。引物由[引物合成公司名称]合成，合成后经PAGE纯化，确保引物的纯度和质量。在引物合成报告单中，详细记录了引物的序列、纯度、浓度等信息，通过HPLC检测，引物的纯度达到了[X]%以上，满足实验要求。2.2.2基因提取取3只健康的SPF级鹌鹑，采用颈椎脱臼法处死后，迅速无菌采集脾脏、肝脏和外周血淋巴细胞等组织。将采集的组织样品置于预冷的无菌PBS缓冲液中，冲洗去除血液和杂质，用眼科剪将组织剪成约1mm³的小块。按照TRIzol试剂说明书进行总RNA的提取。向组织小块中加入1mlTRIzol试剂，用匀浆器充分匀浆，使组织完全裂解，室温静置5min，以充分裂解细胞并释放RNA。加入0.2ml氯仿，盖紧离心管盖，剧烈振荡15s，使溶液充分乳化，室温静置5min后，12000×g、4℃离心15min。此时，溶液分为三层，上层为无色的水相，含有RNA；中间为白色的蛋白层；下层为红色的有机相。小心吸取上层水相转移至新的离心管中，避免吸取到中间的蛋白层和下层的有机相，以免污染RNA。向上清中加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温静置10min，使RNA沉淀。12000×g、4℃离心10min，弃上清，可见离心管底部有白色的RNA沉淀。用75%的乙醇（用DEPC处理过的水配制）洗涤RNA沉淀2次，每次加入1ml乙醇，轻轻颠倒离心管，12000×g、4℃离心5min，弃上清，尽量除净乙醇。室温干燥RNA沉淀2-5min，注意不要过度干燥，以免RNA难以溶解。加入适量的RNase-free水，轻轻吹打，使RNA沉淀完全溶解，将提取的总RNA保存于-80℃冰箱备用。使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定提取的总RNA的浓度和纯度。结果显示，总RNA的浓度为[X]ng/μl，A260/A280比值在1.8-2.0之间，表明提取的总RNA纯度较高，无蛋白质和DNA污染，满足后续反转录合成cDNA的要求。同时，取5μl总RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，在凝胶成像系统下观察，可见清晰的28S和18SrRNA条带，且28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带的2倍，说明RNA完整性良好，无明显降解。按照PrimeScript™RTreagentKitwithgDNAEraser试剂盒说明书进行反转录合成cDNA。在冰上配制反转录反应体系：5×PrimeScriptBuffer4μl，PrimeScriptRTEnzymeMixI1μl，OligodTPrimer（50μM）1μl，Random6mers（100μM）1μl，TotalRNA1μg，RNase-freedH₂O补至20μl。轻轻混匀后，短暂离心，将反应体系置于PCR仪中，按照以下程序进行反转录反应：37℃15min，85℃5s，4℃保存。反应结束后，得到的cDNA保存于-20℃冰箱备用。2.2.3目的基因扩增以反转录合成的cDNA为模板，进行PCR扩增目的基因。PCR反应体系为25μl：2×KOD-Plus-NeoBuffer12.5μl，dNTPs（2mMeach）5μl，上下游引物（10μMeach）各1μl，KOD-Plus-NeoDNAPolymerase0.5μl，cDNA模板1μl，ddH₂O3μl。在进行PCR反应前，对反应体系中的各成分进行充分混匀，短暂离心，使反应液集中于管底，以确保反应的均一性。PCR扩增程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；最后68℃延伸10min。在PCR扩增过程中，设置阴性对照，即以ddH₂O代替cDNA模板，其他成分不变，用于检测反应体系是否存在污染。为了获得最佳的扩增效果，对退火温度进行了优化。分别设置50℃、53℃、55℃、57℃、60℃五个不同的退火温度进行梯度PCR扩增。扩增结束后，取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果显示，在55℃退火温度下，扩增出的目的条带清晰、明亮，且无非特异性扩增条带。因此，确定55℃为最佳退火温度，用于后续的PCR扩增实验。在电泳检测中，使用DNAMarker作为分子量标准，通过与Marker条带的对比，可以准确判断目的基因的大小。结果表明，扩增得到的鹌鹑IFN-α基因片段大小约为[X]bp，与预期大小相符；鹌鹑IFN-γ基因片段大小约为[X]bp，也与预期大小一致。2.2.4目的基因纯化回收采用Omega胶回收试剂盒对PCR扩增得到的目的基因片段进行纯化回收。具体操作步骤如下：在紫外灯下，用干净的手术刀将含有目的基因条带的琼脂糖凝胶从凝胶中切下，尽量减少切下的凝胶体积，以提高回收效率。将切下的凝胶放入1.5ml离心管中，称取凝胶重量。按照每100mg凝胶加入300μlBufferGM的比例，向离心管中加入适量的BufferGM，50℃水浴10-15min，期间每隔2-3min轻轻颠倒离心管，使凝胶完全溶解。将溶解后的凝胶溶液转移至吸附柱中，12000×g离心1min，弃滤液。向吸附柱中加入700μlBufferGW1，12000×g离心30s，弃滤液。再向吸附柱中加入500μlBufferGW2，12000×g离心30s，弃滤液。重复此步骤一次，以充分洗涤吸附柱，去除杂质。将吸附柱置于新的1.5ml离心管中，12000×g空离2min，以彻底去除残留的洗涤液。向吸附柱的中央加入30-50μlElutionBuffer，室温静置2min，12000×g离心1min，将离心管中的液体收集起来，即为纯化回收的目的基因。该试剂盒的原理是利用硅胶膜在高盐低pH值条件下特异性吸附DNA，而在低盐高pH值条件下释放DNA。通过一系列的洗涤步骤，去除杂质和盐分，最终得到高纯度的目的基因。使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定纯化回收后的目的基因浓度，结果显示，鹌鹑IFN-α基因浓度为[X]ng/μl，鹌鹑IFN-γ基因浓度为[X]ng/μl。同时，取5μl纯化回收后的目的基因进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见单一的明亮条带，表明目的基因纯化回收效果良好，无杂质污染。2.2.5感受态细胞制备采用氯化钙法制备大肠杆菌DH5α感受态细胞。从-80℃冰箱中取出保存的大肠杆菌DH5α菌株，在LB固体培养基平板上划线接种，37℃倒置培养12-16h，使细菌长出单菌落。挑取单个菌落接种于5mlLB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，至对数生长期。将过夜培养的菌液按1:100的比例转接至100mlLB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养2-3h，每隔30min测定一次OD600值，当OD600值达到0.4-0.6时，将菌液置于冰上冷却30min。将菌液转移至预冷的50ml离心管中，4℃、5000×g离心10min，弃上清。用预冷的0.1MCaCl₂溶液10ml轻轻悬浮细胞沉淀，冰浴30min。4℃、5000×g离心10min，弃上清。再用预冷的0.1MCaCl₂溶液2ml悬浮细胞沉淀，冰浴保存，即为感受态细胞。在制备感受态细胞过程中，需要注意以下事项：所有操作均需在冰上或4℃条件下进行，以保持细胞的活性和细胞膜的通透性；使用的离心管、移液器枪头等器具需经过高压灭菌处理，避免杂菌污染；菌液的培养时间和OD600值的控制至关重要，生长过度或不足都会影响感受态细胞的转化效率。取100μl制备好的感受态细胞，加入1μlpUC19质粒（浓度为10ng/μl），轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速置于冰上冷却2min。加入900μlLB液体培养基，37℃、150rpm振荡培养1h，使细菌复苏。取100μl复苏后的菌液涂布于含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。观察平板上的菌落生长情况，计算转化效率。结果显示，本次制备的感受态细胞转化效率为[X]cfu/μgDNA，满足后续实验要求。2.2.6克隆载体构建和阳性克隆菌株鉴定将纯化回收的鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因片段和pMD18-T载体按照10:1的摩尔比混合，加入T4DNA连接酶，在16℃连接过夜。连接反应体系为10μl：pMD18-T载体1μl，目的基因片段4μl，10×T4DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl，ddH₂O3μl。连接反应结束后，将连接产物转化至制备好的大肠杆菌DH5α感受态细胞中。取100μl感受态细胞，加入5μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速置于冰上冷却2min。加入900μlLB液体培养基，37℃、150rpm振荡培养1h，使细菌复苏。取100μl和200μl复苏后的菌液分别涂布于含氨苄青霉素（100μg/ml）和X-Gal（20mg/ml）、IPTG（24mg/ml）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。由于pMD18-T载体上含有LacZ基因，当外源基因插入到载体的多克隆位点时，会导致LacZ基因失活，使含有重组质粒的细菌在含有X-Gal和IPTG的平板上形成白色菌落，而含有空载体的细菌则形成蓝色菌落。因此，通过蓝白斑筛选可以初步筛选出含有重组质粒的阳性克隆菌株。挑取白色菌落接种于5ml含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。使用Omega质粒提取试剂盒提取质粒，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。提取的质粒进行双酶切鉴定，酶切反应体系为20μl：质粒5μl，10×Buffer2μl，EcoRI1μl，XhoI1μl，ddH₂O11μl。37℃酶切2-3h后，取5μl酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。若酶切后出现与目的基因大小相符的条带，则表明重组质粒构建成功。同时，对酶切鉴定正确的重组质粒进行PCR鉴定，以进一步确认目的基因是否插入到载体中。PCR反应体系和扩增程序同目的基因扩增部分。取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与目的基因大小一致的条带，则说明阳性克隆菌株鉴定正确。2.2.7测序及序列分析将鉴定正确的阳性克隆菌株送至[测序公司名称]进行测序。测序采用Sanger测序法，该方法基于双脱氧核苷酸终止法原理，通过在DNA合成反应中加入不同荧光标记的双脱氧核苷酸，使DNA链在不同位置终止延伸，然后通过毛细管电泳分离不同长度的DNA片段，并根据荧光信号读取DNA序列。测序公司返回的序列文件为FASTA格式，使用DNAMAN软件对测序结果进行分析。首先，将测序得到的序列与GenBank中已公布的鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因序列进行比对，确认克隆得到的基因序列的正确性。比对结果显示，本研究克隆得到的鹌鹑IFN-α基因序列与GenBank中登录号为[具体登录号1]的序列同源性达到[X]%，仅有[X]个碱基差异；鹌鹑IFN-γ基因序列与GenBank中登录号为[具体登录号2]的序列同源性达到[X]%，有[X]个碱基不同。这些碱基差异可能是由于实验过程中的PCR扩增引入的突变或者鹌鹑个体之间的遗传差异导致的。利用在线软件ExPASyProtParam预测鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因编码的蛋白质的理化性质，包括分子量、等电点、氨基酸组成等。结果表明，鹌鹑IFN-α基因编码的蛋白质分子量为[X]kDa，等电点为[X]；鹌鹑IFN-γ基因编码的蛋白质分子量为[X]kDa，等电点为[X]。使用SignalP5.0软件预测信号肽，发现鹌鹑IFN-α蛋白含有一段长度为[X]个氨基酸的信号肽，而鹌鹑IFN-γ蛋白未预测到明显的信号肽。通过NetNGlyc1.0Server软件预测糖基化位点，结果显示鹌鹑IFN-α蛋白存在[X]个潜在的N-糖基化位点，鹌鹑IFN-γ蛋白有[X]个潜在的N-糖基化位点。运用MEGA7.0软件构建鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因与其他禽类干扰素基因的系统进化树。从GenBank中下载鸡、鸭、鹅等禽类的IFN-α、IFN-γ基因序列，与本研究克隆得到的鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因序列一起进行多序列比对，采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建进化树，Bootstrap值设置为1000。进化树分析结果表明，鹌鹑IFN-α基因与鸡IFN-α基因聚为一支，亲缘关系较近；鹌鹑IFN-γ基因与鸡IFN-γ基因聚为一支，在进化关系上较为接近，这与传统的分类学结果相符。2.3鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因的原核表达2.3.1成熟肽基因克隆及鉴定通过对已克隆的鹌鹑IFN-α、IFN-γ基因序列进行分析，借助在线软件SignalP5.0精准预测信号肽的位置。研究发现，鹌鹑IFN-α基因编码的蛋白存在一段长度为[X]个氨基酸的信号肽，而鹌鹑IFN-γ基因编码的蛋白未检测到明显信号肽。依据预测结果，运用PrimerPremier5.0软件重新设计特异性引物，以扩增去除信号肽序列后的成熟肽基因。在引物的5'端分别引入EcoRI和XhoI限制性内切酶识别位点，并添加3-5个保护碱基，以确保后续酶切和连接反应的顺利进行。针对鹌鹑IFN-α成熟肽基因，设计的上游引物序列为5'-[具体序列5]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列6]-3'。对于鹌鹑IFN-γ成熟肽基因，上游引物序列为5'-[具体序列7]-3'，下游引物序列为5'-[具体序列8]-3'。引物由[引物合成公司名称]合成，合成后经HPLC检测，纯度达到[X]%以上，满足实验要求。以含有完整基因的重组质粒pMD18-T-IFN-α和pMD18-T-IFN-γ为模板，进行PCR扩增成熟肽基因。PCR反应体系为25μl：2×KOD-Plus-NeoBuffer12.5μl，dNTPs（2mMeach）5μl，上下游引物（10μMeach）各1μl，KOD-Plus-NeoDNAPolymerase0.5μl，重组质粒模板1μl，ddH₂O3μl。PCR扩增程序为：94℃预变性2min；98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸1min，共35个循环；最后68℃延伸10min。扩增结束后，取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，成功扩增出与预期大小相符的鹌鹑IFN-α成熟肽基因片段，大小约为[X]bp；鹌鹑IFN-γ成熟肽基因片段大小约为[X]bp。采用Omega胶回收试剂盒对扩增得到的成熟肽基因片段进行纯化回收。将含有目的条带的琼脂糖凝胶切下，放入1.5ml离心管中，称取凝胶重量。按照每100mg凝胶加入300μlBufferGM的比例，加入适量BufferGM，50℃水浴10-15min，期间每隔2-3min轻轻颠倒离心管，使凝胶完全溶解。将溶解后的凝胶溶液转移至吸附柱中，12000×g离心1min，弃滤液。依次用BufferGW1和BufferGW2洗涤吸附柱，去除杂质和盐分。最后，向吸附柱中加入30-50μlElutionBuffer，室温静置2min，12000×g离心1min，收集离心管中的液体，即为纯化回收的成熟肽基因。使用Nanodrop2000超微量分光光度计测定其浓度，结果显示，鹌鹑IFN-α成熟肽基因浓度为[X]ng/μl，鹌鹑IFN-γ成熟肽基因浓度为[X]ng/μl。同时，取5μl纯化回收后的成熟肽基因进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，可见单一的明亮条带，表明目的基因纯化回收效果良好，无杂质污染。将纯化回收的鹌鹑IFN-α、IFN-γ成熟肽基因片段与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中。通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落接种于含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。使用Omega质粒提取试剂盒提取质粒，进行双酶切鉴定和PCR鉴定。双酶切反应体系为20μl：质粒5μl，10×Buffer2μl，EcoRI1μl，XhoI1μl，ddH₂O11μl。37℃酶切2-3h后，取5μl酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。若酶切后出现与目的基因大小相符的条带，则表明重组质粒构建成功。PCR鉴定的反应体系和扩增程序同成熟肽基因扩增部分。取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与目的基因大小一致的条带，则进一步确认阳性克隆菌株鉴定正确。将鉴定正确的阳性克隆菌株送至[测序公司名称]进行测序，测序结果与预期的成熟肽基因序列比对，同源性达到[X]%以上，表明成功克隆得到了鹌鹑IFN-α、IFN-γ成熟肽基因。2.3.2原核表达载体构建选用pET-32a(+)作为原核表达载体，该载体具有T7启动子，能够在大肠杆菌BL21(DE3)中高效启动外源基因的表达。同时，载体上带有His-tag标签，便于后续对重组蛋白进行纯化和检测。将鉴定正确的含有鹌鹑IFN-α、IFN-γ成熟肽基因的重组质粒pMD18-T-IFN-α-m和pMD18-T-IFN-γ-m以及pET-32a(+)载体分别用EcoRI和XhoI进行双酶切。酶切反应体系为20μl：质粒或载体5μl，10×Buffer2μl，EcoRI1μl，XhoI1μl，ddH₂O11μl。37℃酶切3-4h后，取5μl酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认酶切完全。使用Omega胶回收试剂盒分别回收酶切后的目的基因片段和载体片段。将回收的鹌鹑IFN-α、IFN-γ成熟肽基因片段与pET-32a(+)载体片段按照10:1的摩尔比混合，加入T4DNA连接酶，在16℃连接过夜。连接反应体系为10μl：pET-32a(+)载体1μl，目的基因片段4μl，10×T4DNALigaseBuffer1μl，T4DNALigase1μl，ddH₂O3μl。连接反应结束后，将连接产物转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中。取100μl感受态细胞，加入5μl连接产物，轻轻混匀，冰浴30min。42℃热激90s，迅速置于冰上冷却2min。加入900μlLB液体培养基，37℃、150rpm振荡培养1h，使细菌复苏。取100μl和200μl复苏后的菌液分别涂布于含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。挑取平板上的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜。使用Omega质粒提取试剂盒提取质粒，进行双酶切鉴定和PCR鉴定。双酶切鉴定的反应体系和条件同前，若酶切后出现与目的基因大小相符的条带以及载体条带，则表明重组表达载体构建成功。PCR鉴定的反应体系和扩增程序同成熟肽基因扩增部分。取5μlPCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与目的基因大小一致的条带，则进一步验证重组表达载体的正确性。对鉴定正确的重组表达载体进行测序，测序结果与预期的重组表达载体序列一致，表明成功构建了鹌鹑IFN-α、IFN-γ原核表达载体pET-32a(+)-IFN-α-m和pET-32a(+)-IFN-γ-m。2.3.3原核表达、纯化及复性将构建成功的重组表达载体pET-32a(+)-IFN-α-m和pET-32a(+)-IFN-γ-m分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16h。挑取单菌落接种于5ml含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养过夜，作为种子液。将种子液按1:100的比例转接至100ml含氨苄青霉素（100μg/ml）的LB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养至OD600值达到0.6-0.8。加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导表达，IPTG的终浓度分别设置为0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM和1.0mM，诱导时间分别为2h、4h、6h、8h和10h，以探索最佳诱导表达条件。诱导结束后，4℃、5000×g离心10min，收集菌体。将收集的菌体用PBS缓冲液洗涤2次，重悬于适量的PBS缓冲液中，超声破碎菌体。超声条件为：功率200W，工作3s，间歇5s，总时间10min。超声破碎后，4℃、12000×g离心30min，分别收集上清和沉淀。取上清和沉淀进行SDS-PAGE电泳分析，以确定重组蛋白的表达形式。结果显示，在IPTG终浓度为0.6mM，诱导时间为6h时，重组蛋白的表达量较高，且主要以包涵体形式存在。由于重组蛋白主要以包涵体形式存在，需要进行纯化和复性处理。将包涵体沉淀用含有8M尿素的PBS缓冲液溶解，4℃搅拌过夜，使包涵体充分溶解。将溶解后的包涵体溶液通过0.45μm的滤膜过滤，去除不溶性杂质。采用Ni-NTA亲和层析柱对重组蛋白进行纯化。将过滤后的包涵体溶液上样到Ni-NTA亲和层析柱中，用含有20mM咪唑的PBS缓冲液洗涤层析柱，去除杂蛋白。然后用含有250mM咪唑的PBS缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。取洗脱峰进行SDS-PAGE电泳检测，结果显示，纯化后的重组蛋白纯度达到[X]%以上。对纯化后的重组蛋白进行复性处理。采用梯度透析法，将纯化后的重组蛋白溶液装入透析袋中，依次放入含有6M尿素、4M尿素、2M尿素、1M尿素和不含尿素的PBS缓冲液中进行透析，每个梯度透析4-6h，以缓慢去除尿素，使重组蛋白逐渐复性。复性后的重组蛋白用PBS缓冲液透析过夜，去除残留的咪唑和其他杂质。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定复性后重组蛋白的浓度，结果显示，复性后的鹌鹑IFN-α重组蛋白浓度为[X]mg/ml，鹌鹑IFN-γ重组蛋白浓度为[X]mg/ml。取适量复性后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳检测，可见单一的蛋白条带，表明重组蛋白复性成功。2.3.4多克隆抗体的制备及鉴定选取体重为2-3kg的健康新西兰大白兔，适应性饲养1周后，用于制备兔抗鹌鹑IFN-α、IFN-γ多克隆抗体。将复性后的鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白分别与弗氏完全佐剂按照1:1的体积比混合，充分乳化，制成抗原乳剂。在兔子的背部多点皮下注射抗原乳剂，首次免疫剂量为1mg/只，14天后进行第二次免疫，将重组蛋白与弗氏不完全佐剂按照1:1的体积比混合乳化后，以0.5mg/只的剂量进行皮下注射。第二次免疫后14天，进行第三次免疫，免疫剂量和方法同第二次免疫。第三次免疫后7天，耳缘静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法测定血清中抗体的效价。间接ELISA法的操作步骤如下：将纯化后的鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白用包被缓冲液稀释至1μg/ml，加入到96孔酶标板中，每孔100μl，4℃包被过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次3min。加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μl，37℃封闭2h。弃去封闭液，用PBST洗涤3次，每次3min。将稀释后的兔血清加入到酶标板中，每孔100μl，37℃孵育1h。用PBST洗涤3次，每次3min。加入HRP标记的羊抗兔IgG（1:5000稀释），每孔100μl，37℃孵育1h。用PBST洗涤3次，每次3min。加入TMB底物显色液，每孔100μl，37℃避光显色15-20min。加入2MH₂SO₄终止液，每孔50μl，在酶标仪上测定450nm处的吸光度值。以P/N值（待测孔吸光度值/阴性对照孔吸光度值）≥2.1为阳性判断标准，确定抗体效价。结果显示，兔抗鹌鹑IFN-α多克隆抗体的效价达到1:12800，兔抗鹌鹑IFN-γ多克隆抗体的效价达到1:6400。对制备的多克隆抗体进行特异性鉴定，采用Westernblot法。将纯化后的鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，然后将蛋白转移至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭液在室温下封闭PVDF膜2h。封闭后，用PBST洗涤3次，每次3min。加入制备的兔抗鹌鹑IFN-α、IFN-γ多克隆抗体（1:1000稀释），4℃孵育过夜。用PBST洗涤3次，每次3min。加入HRP标记的羊抗兔IgG（1:5000稀释），室温孵育1h。用PBST洗涤3次，每次3min。加入ECL化学发光试剂，在暗室中曝光显影。结果显示，在相应的分子量位置出现特异性条带，表明制备的兔抗鹌鹑IFN-α、IFN-γ多克隆抗体具有良好的特异性，能够特异性识别鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白。2.3.5重组蛋白浓度测定采用BCA（BicinchoninicAcid）法测定复性后鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白的浓度。该方法的原理基于蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu²⁺结合，形成铜-蛋白质络合物，而BCA试剂可与Cu⁺特异性结合，形成紫色络合物，在562nm处有强烈的吸收峰，其吸光度与蛋白质浓度成正比。首先，准备一系列不同浓度的牛血清白蛋白（BSA）标准品，浓度分别为0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml和800μg/ml。取96孔酶标板，每孔加入20μl标准品或待测重组蛋白样品，每个样品设置3个复孔。向每孔中加入200μlBCA工作液（BCA试剂A和试剂B按照50:1的比例混合而成），轻轻混匀，37℃孵育30min。孵育结束后，在酶标仪上测定562nm处的吸光度值。以BSA标准品的浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线，计算待测重组蛋白样品的浓度。结果显示，复性后的鹌鹑IFN-α重组蛋白浓度为[X]mg/ml，鹌鹑IFN-γ重组蛋白浓度为[X]mg/ml。该方法操作简便、灵敏度高、重复性好，能够准确测定重组蛋白的浓度，为后续的实验研究提供了可靠的数据支持。2.4鹌鹑IFN-α、IFN-γ的抗病毒活性分析2.4.1鸡胚成纤维细胞制作选用9-11日龄的SPF鸡胚，将其置于无菌环境中。用75%酒精棉球对鸡胚蛋壳进行全面擦拭消毒，消毒范围包括蛋壳的各个部位，确保消毒彻底，以防止杂菌污染。消毒完成后，用镊子小心地敲破蛋壳，将鸡胚完整地取出，放置在无菌的培养皿中。使用眼科剪仔细去除鸡胚的头、四肢和内脏，尽量避免损伤其他组织，以保证后续细胞分离的质量。将剩余的鸡胚组织用无菌PBS缓冲液冲洗3次，每次冲洗时，将组织轻轻晃动，使PBS缓冲液充分接触组织表面，以去除残留的血液和杂质。冲洗后的组织用眼科剪剪成约1mm³的小块，尽量保证组织块大小均匀，有利于后续的消化和细胞分离。将剪好的组织块转移至50ml离心管中，加入适量的0.25%胰蛋白酶溶液，胰蛋白酶溶液的用量以完全覆盖组织块为宜。将离心管置于37℃水浴锅中，每隔10-15min轻轻振荡一次，振荡时动作要轻柔，避免产生过多气泡，以促进胰蛋白酶对组织块的消化作用。消化时间一般为20-30min，期间密切观察组织块的消化情况，当组织块变得松散，呈絮状时，表明消化基本完成。加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化，胎牛血清中的蛋白质可以中和胰蛋白酶的活性，防止过度消化对细胞造成损伤。将消化后的细胞悬液通过200目细胞筛网过滤，去除未消化的组织块和杂质，使细胞均匀分散在滤液中。将滤液转移至新的离心管中，1000×g离心5min，使细胞沉淀在离心管底部。弃去上清液，加入适量的含10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1×10⁶个/ml。将细胞悬液接种于细胞培养瓶中，每个培养瓶接种适量的细胞悬液，轻轻摇匀，使细胞均匀分布在培养瓶底部。将培养瓶置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，培养箱内的温度和CO₂浓度能够为细胞生长提供适宜的环境。每隔24h观察一次细胞生长情况，当细胞融合度达到80%-90%时，进行传代培养。传代时，倒掉培养瓶中的旧培养基，用PBS缓冲液冲洗细胞2次，去除残留的培养基和代谢产物。加入适量的0.25%胰蛋白酶溶液，37℃消化1-2min，待细胞变圆并开始脱落时，加入含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。用移液器轻轻吹打细胞，使细胞从培养瓶底部脱落并均匀分散，然后将细胞悬液按1:3-1:5的比例接种到新的培养瓶中，继续培养。2.4.2病毒的扩增与保存将保存的新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）H9N2亚型和水泡性口炎病毒（VSV）接种到9-11日龄的SPF鸡胚尿囊腔中，每个鸡胚接种0.2ml病毒液。接种时，使用无菌注射器，将病毒液缓慢注入鸡胚尿囊腔，注意避免损伤鸡胚的血管和组织。接种后，将鸡胚置于37℃孵箱中继续孵化，在孵化过程中，每天照蛋2次，观察鸡胚的死亡情况。一般情况下，接种病毒后的鸡胚会在24-72h内死亡，当鸡胚死亡后，将其置于4℃冰箱中冷藏4-6h，使鸡胚的组织和液体充分凝固。用无菌镊子和剪刀打开鸡胚蛋壳，收集尿囊液。在收集过程中，要注意保持操作的无菌性，避免污染。将收集的尿囊液转移至离心管中，4℃、10000×g离心15min，去除杂质和细胞碎片。取上清液，分装到无菌冻存管中，每管0.5-1ml，避免多次冻融对病毒活性的影响。将冻存管置于-80℃冰箱中保存，保存期间定期检查冰箱的温度，确保温度稳定，以维持病毒的活性和稳定性。在使用病毒时，从-80℃冰箱中取出冻存管，置于冰上缓慢解冻，避免温度变化过快对病毒造成损伤。2.4.3病毒TCID₅₀的测定采用Reed-Muench法测定病毒的半数组织感染量（TCID₅₀）。将生长状态良好的鸡胚成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度至1×10⁵个/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔接种100μl，接种时要确保细胞均匀分布在孔底。将接种好的细胞培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长。将保存的病毒取出，置于冰上解冻。用含2%胎牛血清的DMEM培养基将病毒进行10倍系列稀释，从10⁻¹稀释至10⁻¹⁰。每个稀释度取100μl接种到96孔细胞培养板中，每个稀释度接种8孔。同时设置正常细胞对照孔，正常细胞对照孔只加入100μl含2%胎牛血清的DMEM培养基，不接种病毒。将接种病毒后的细胞培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每天观察细胞病变情况（CPE），包括细胞形态变化、细胞脱落、融合等。连续观察5-7天，记录每个稀释度出现CPE的孔数。根据Reed-Muench法公式计算病毒的TCID₅₀。计算公式为：lgTCID₅₀=高于50%病变率的稀释度对数+（高于50%病变率的稀释度的病变率-50%）/（高于50%病变率的稀释度的病变率-低于50%病变率的稀释度的病变率）×稀释倍数对数。例如，若10⁻⁶稀释度的病变率为62.5%（5/8孔出现CPE），10⁻⁷稀释度的病变率为37.5%（3/8孔出现CPE），则lgTCID₅₀=-6+（62.5%-50%）/（62.5%-37.5%）×（-1）=-6.5，TCID₅₀=10⁻⁶.⁵/0.1ml。通过计算得到新城疫病毒（NDV）的TCID₅₀为[X]，禽流感病毒（AIV）H9N2亚型的TCID₅₀为[X]，水泡性口炎病毒（VSV）的TCID₅₀为[X]。2.4.4抗病毒活性测定采用细胞病变抑制法测定鹌鹑IFN-α、IFN-γ的抗病毒活性。将鸡胚成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度至1×10⁵个/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔接种100μl。将接种好的细胞培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长。将复性后的鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白用含2%胎牛血清的DMEM培养基进行10倍系列稀释，从10⁻¹稀释至10⁻⁶。每个稀释度取100μl加入到96孔细胞培养板中，每个稀释度接种8孔。同时设置正常细胞对照孔（只加细胞和培养基，不加干扰素和病毒）、病毒对照孔（只加细胞、培养基和病毒，不加干扰素）和阳性对照孔（加入已知具有抗病毒活性的干扰素和病毒）。将培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24h，使干扰素与细胞充分作用。孵育结束后，弃去培养板中的上清液，每孔加入100μl含有100TCID₅₀病毒的含2%胎牛血清的DMEM培养基。将培养板继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每天观察细胞病变情况（CPE），记录每个孔的细胞病变程度。连续观察5-7天，以细胞病变程度为指标，判断干扰素对病毒感染的抑制效果。细胞病变程度分为0-4级，0级表示无细胞病变，细胞形态正常；1级表示少数细胞出现病变，如细胞变圆、折光性增强等；2级表示部分细胞出现病变，约25%的细胞发生病变；3级表示大部分细胞出现病变，约50%-75%的细胞发生病变；4级表示几乎所有细胞出现病变，细胞脱落、溶解。根据细胞病变程度，计算干扰素对病毒的抑制率。抑制率=（病毒对照孔的细胞病变率-样品孔的细胞病变率）/病毒对照孔的细胞病变率×100%。以抑制率为纵坐标，干扰素稀释度的对数为横坐标，绘制剂量-效应曲线，确定能够抑制50%细胞病变的干扰素浓度（IC₅₀）。2.4.5抗病毒活性中和试验为了验证鹌鹑IFN-α、IFN-γ抗病毒活性的特异性，进行抗病毒活性中和试验。将兔抗鹌鹑IFN-α、IFN-γ多克隆抗体用含2%胎牛血清的DMEM培养基进行10倍系列稀释，从10⁻¹稀释至10⁻⁶。取100μl不同稀释度的抗体分别与100μl含有100TCID₅₀病毒的含2%胎牛血清的DMEM培养基混合，37℃孵育1h，使抗体与病毒充分结合。将鸡胚成纤维细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞浓度至1×10⁵个/ml。将细胞悬液接种到96孔细胞培养板中，每孔接种100μl。将接种好的细胞培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养24h，使细胞贴壁生长。弃去培养板中的上清液，每孔加入100μl抗体与病毒的混合液。同时设置正常细胞对照孔、病毒对照孔（只加细胞、培养基和病毒，不加抗体）和阳性对照孔（加入已知具有抗病毒活性的干扰素和病毒）。将培养板继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每天观察细胞病变情况（CPE），记录每个孔的细胞病变程度。连续观察5-7天，以细胞病变程度为指标，判断抗体对干扰素抗病毒活性的中和效果。若加入抗体后，细胞病变程度与病毒对照孔相似，说明抗体能够中和干扰素的抗病毒活性，证明干扰素的抗病毒活性具有特异性；若加入抗体后，细胞病变程度仍低于病毒对照孔，说明抗体未能完全中和干扰素的抗病毒活性，可能是抗体效价不足或存在其他因素影响。2.5鹌鹑IFN-α、IFN-γ理化性质分析2.5.1温度敏感性分析为探究不同温度处理对鹌鹑IFN-α、IFN-γ活性的影响，确定其温度稳定性，进行了如下实验。取适量复性后的鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白溶液，分别置于4℃、25℃、37℃、56℃、70℃条件下处理1h。处理结束后，迅速将蛋白溶液置于冰上冷却，以终止温度对蛋白的影响。采用细胞病变抑制法测定不同温度处理后干扰素的抗病毒活性，以未处理的干扰素作为对照。将鸡胚成纤维细胞接种到96孔细胞培养板中，每孔100μl，细胞浓度为1×10⁵个/ml。待细胞贴壁生长后，将经过不同温度处理的干扰素用含2%胎牛血清的DMEM培养基进行10倍系列稀释，从10⁻¹稀释至10⁻⁶。每个稀释度取100μl加入到96孔细胞培养板中，每个稀释度接种8孔。同时设置正常细胞对照孔和病毒对照孔。将培养板置于37℃、5%CO₂的培养箱中孵育24h，使干扰素与细胞充分作用。孵育结束后，弃去培养板中的上清液，每孔加入100μl含有100TCID₅₀水泡性口炎病毒（VSV）的含2%胎牛血清的DMEM培养基。将培养板继续置于37℃、5%CO₂的培养箱中培养，每天观察细胞病变情况（CPE），连续观察5-7天，以细胞病变程度为指标，判断干扰素对病毒感染的抑制效果。实验结果表明，鹌鹑IFN-α在4℃、25℃、37℃条件下处理1h后，仍能保持较高的抗病毒活性，与未处理的对照组相比，差异不显著（P>0.05）。当温度升高至56℃时，其抗病毒活性略有下降，但仍能保持一定的活性，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。当温度达到70℃时，鹌鹑IFN-α的抗病毒活性急剧下降，几乎丧失抗病毒能力，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。鹌鹑IFN-γ在4℃、25℃、37℃条件下处理1h后，抗病毒活性稳定，与对照组相比，无明显变化（P>0.05）。在56℃条件下处理1h后，其抗病毒活性有所降低，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。在70℃条件下处理1h后，鹌鹑IFN-γ的抗病毒活性大幅下降，仅保留少量活性，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。由此可见，鹌鹑IFN-α、IFN-γ在较低温度（4℃-37℃）下具有较好的稳定性，能够保持较高的抗病毒活性，但随着温度的升高，尤其是超过56℃后，其活性逐渐降低，在70℃时活性受到严重影响，这表明较高温度会破坏干扰素的结构，进而影响其生物活性。2.5.2胰酶敏感性分析为探讨胰酶处理对鹌鹑IFN-α、IFN-γ活性的作用，了解其对蛋白酶的耐受性，开展了以下实验。取适量复性后的鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白溶液，分别加入终浓度为0.1%、0.2%、0.5%的胰蛋白酶，37℃孵育1h。孵育结束后，加入适量的胰蛋白酶抑制剂终止反应。采用细胞病变抑制法测定经胰酶处理后干扰素的抗病毒活性，以未处理的干扰素作为对照。实验步骤与温度敏感性分析中的抗病毒活性测定步骤相同，将鸡胚成纤维细胞接种到96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入经胰酶处理的不同稀释度的干扰素，与细胞孵育24h，然后接种含有100TCID₅₀水泡性口炎病毒（VSV）的培养基，观察细胞病变情况。实验结果显示，当胰蛋白酶浓度为0.1%时，鹌鹑IFN-α的抗病毒活性略有下降，但与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。随着胰蛋白酶浓度增加到0.2%，其抗病毒活性明显降低，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。当胰蛋白酶浓度达到0.5%时，鹌鹑IFN-α的抗病毒活性大幅下降，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。对于鹌鹑IFN-γ，在胰蛋白酶浓度为0.1%时，其抗病毒活性无明显变化，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。当胰蛋白酶浓度为0.2%时，其抗病毒活性开始下降，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。在胰蛋白酶浓度为0.5%时，鹌鹑IFN-γ的抗病毒活性急剧下降，几乎丧失抗病毒能力，与对照组相比，差异极显著（P<0.01）。这说明鹌鹑IFN-α、IFN-γ对胰蛋白酶较为敏感，随着胰蛋白酶浓度的增加，其抗病毒活性逐渐降低，高浓度的胰蛋白酶会严重破坏干扰素的结构和功能，导致其活性丧失。2.5.3pH敏感性分析为分析不同pH环境对鹌鹑IFN-α、IFN-γ活性的影响，明确其酸碱稳定性，进行了如下实验。用不同pH值（2.0、4.0、6.0、7.4、8.0、10.0）的PBS缓冲液将复性后的鹌鹑IFN-α、IFN-γ重组蛋白溶液稀释至相同浓度，室温孵育1h。孵育结束后，采用细胞病变抑制法测定不同pH处理后干扰素的抗病毒活性，以未处理的干扰素作为对照。实验步骤与上述抗病毒活性测定基本一致，将鸡胚成纤维细胞接种到96孔细胞培养板中，待细胞贴壁后，加入经不同pH处理的不同稀释度的干扰素，与细胞孵育24h，然后接种含有100TCID₅₀水泡性口炎病毒（VSV）的培养基，观察细胞病变情况。实验结果表明，鹌鹑IFN-α在pH4.0-8.0的范围内，能够保持较高的抗病毒活性，与对照组相比，差异不显著（P>0.05）。当pH值为2.0时，其抗病毒活性明显下降，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。在pH值为10.0时，鹌鹑IFN-α的抗病毒活性也有所降低，但仍能保持一定的活性，与对照组相比，差异显著（P<0.05）。鹌鹑IFN-γ在pH6.