紫苏叶提取物在体外模拟消化过程中的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力研究

PAGE紫苏叶提取物在体外模拟消化过程中的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力研究中文题目中文题目紫苏叶提取物在体外模拟消化过程中的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力研究外文题目StudiesonAntioxidantandα-glucosidaseInhibitoryActivitiesofPerillaLeafExtractinVitroDigestionSimulationPAGE8摘要以紫苏（Perillafrutescens(L.)）叶为原材料，研究了体外模拟消化对紫苏叶提取物（Perillafrutescensextract，PFE）活性成分含量、其抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制能力的影响。分别采用福林酚法和氯化铝-亚硝酸钠比色法考察体外模拟消化对PFE中总酚和总黄酮含量的影响；以DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、铁还原能力为指标，评价其体外抗氧化能力变化情况；采用改良的荧光光谱法考察其α-葡萄糖苷酶抑制能力。结果表明：体外模拟胃液消化可显著降低PFE中总酚和总黄酮的含量（P<0.05），其中总酚含量从631.385±50.721降低至295.548±43.235mgGAE/gDW，总黄酮含量从652.641±30.691降低至280.893±11.757mgRutin/gDW；体外模拟肠液消化对其总酚含量无明显影响，总黄酮含量略有增加；模拟胃肠液消化可显著降低PFE的体外抗氧化能力（P<0.05），其DPPH自由基清除能力下降了47.3%，ABTS自由基清除能力下降了56.3%、铁还原能力下降了54.4%；体外模拟胃肠消化会显著减弱紫苏叶的α-葡萄糖苷酶抑制能力（P<0.05），其IC50值从0.113±0.005上升到0.525±0.067mg/mL；相关性分析发现PFE体外抗氧化活性、α-葡萄糖苷酶抑制能力的变化可能与其总酚和总黄酮含量的变化有关。总之，体外模拟消化会降低PFE中总酚和总黄酮含量，进而影响其体外抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制能力。本文研究为紫苏叶的开发利用提供了技术支撑和理论依据。关键词：紫苏，体外模拟消化，体外抗氧化活性，α-葡萄糖苷酶抑制能力StudiesonAntioxidantandα-glucosidaseInhibitoryActivitiesofPerillaLeafExtractinVitroDigestionSimulationAbstractTheleavesofPerillafrutescens(L.)wereusedasrawmaterials.Toinvestigatetheeffectsofsimulateddigestioninvitroonthecontentofactivecomponents,antioxidantactivityandα-glucosidaseinhibitionofPerillafrutescensextract(PFE).ThevariationsoftotalphenolicsandtotalflavonoidscontentswereevaluatedbythecolorimetricmethodswithFolinphenolandaluminumchloride-sodiumnitrite.TheeffectsofdigestiontreatmentsonantioxidantactivitieswereevaluatedbyDPPH,ABTSandFRAPmethods.Theeffectsofdigestiontreatmentsonα-glucosidaseinhibitionbymodifiedfluorescentspectrometry.TheresultsshowedthatthetotalphenolicandflavonoidscontentofPFEwasobviouslydecreasedbysimulatedgastricandintestinalfluid.Amongthem,thetotalphenolicscontentdecreasedfrom631.385±50.721to295.548±43.235mgGAE/gDW,andthetotalflavonoidscontentdecreasedfrom652.641±30.691to280.893±11.757mgRutin/gDW.Simulatedintestinaldigestionhadnosignificanteffectonthetotalphenolicscontent,butincreasedwithinanarrowrangeonthetotalflavonoidscontent.TheDPPH,ABTSandFRAPantioxidantactivityofPFEweresignificantlydecreasedby47.3%,56.3%and54.4%respectivelybymeansofsimulatedgastricandintestinalfluidtreatment(P<0.05）.Theα-glucosidaseinhibitionofPFEwassignificantlydecreasedbysimulatedgastricandintestinalfluidtreatment,anditsIC50increasedfrom0.113±0.005to0.525±0.067mg/mL.Correlationanalysisfoundantioxidantactivityandα-glucosidaseinhibitionmightberelatedtothecontentofphenolicandflavonoidscontent.Inconclusion,simulateddigestioninvitrocanreducethecontentoftotalphenolsandflavonoidsinPFE,therebyaffectingitsantioxidantactivityand-glucosidaseinhibitionabilityinvitro.TheresultsofthepresentstudycouldprovidetheoreticalbasisforthedevelopmentandutilizationofPerillaleaf.Keywords：Perillafrutescens，invitrodigestionsimulation，antioxidantactivityinvitro，α-glucosidaseinhibitoryactivity

目录摘要 IAbstract II目录 IV1前言 11.1紫苏简介 11.2研究现状 11.3抗氧化能力 21.4α-葡萄糖苷酶抑制剂 21.5体外模拟消化 21.6研究意义 32材料和仪器 32.1实验材料 32.1.1材料 32.1.2试剂 32.2仪器与设备 43技术方案 53.1紫苏叶提取物的制备 53.2模拟胃肠道消化 53.2.1模拟胃液消化 53.2.2模拟肠道消化 53.3胃肠道消化过程中紫苏提取物总酚含量的测定 63.4胃肠道消化过程中紫苏提取物总黄酮含量的测定 63.5胃肠道消化过程中紫苏提取物抗氧化活性的测定 63.5.1DPPH自由基清除能力 63.5.2ABTS自由基清除能力 73.5.3铁还原能力（FerricReducingAntioxidantPower，FRAP） 73.6胃肠道消化过程中紫苏提取物α-葡萄糖苷酶抑制能力的测定 73.7数据统计与分析 84研究结果与讨论 84.1模拟胃肠道消化对紫苏叶提取物中总酚含量影响 84.2模拟胃肠道消化对紫苏叶提取物中总黄酮含量影响 94.3抗氧化活性 114.3.1DPPH自由基清除能力 114.3.2ABTS自由基清除能力 134.3.3铁还原能力（FRAP） 144.4α-葡萄糖苷酶抑制能力 164.5相关性分析 185结论 19参考文献 19致谢 221前言1.1紫苏简介紫苏（Perillafrutescens(L.)），为唇形科紫苏属自花授粉一年生草本植物。该种有5个变种，分别是回回苏、紫苏、白苏、野生紫苏和耳齿紫苏ADDINNE.Ref.{44AA39FA-B42B-480B-8B68-C3C40E0F8E82}[1]。紫苏株高160-170厘米，主茎发达，叶形呈阔圆形或圆形，叶尖为短尖或突尖，基部阔楔形或圆形，叶缘在基部以上有粗锯齿，叶片颜色全绿或全紫，或面绿背紫。紫苏的再生能力强，在恰当的种植管理下，可获得高产量ADDINNE.Ref.{73A4E70A-DE4F-482C-B025-0935FE313514}[2,3]。紫苏原产于东亚，具野生型和栽培型，遍布于我国各省市地区，主要集中于华北、华南、华中、西南及台湾区域等，海外如不丹、朝鲜、日本、印度尼西亚等国家均有分布。早在2000多年前的古籍中就有记载紫苏的栽培和食用方法，历史悠久ADDINNE.Ref.{8B731B6F-C9BF-450B-8864-5DD1C9FC7F2A}[4,5]。紫苏作为一种药食同源型植物，被卫生部列为首批既是药品又是食品的60种作物之一ADDINNE.Ref.{E64326C5-345F-47EA-B6FA-DA37BD1BAE67}[6]。其中，紫苏叶在抗菌和抗病毒、止血、镇静和镇痛、抗氧化、抗肿瘤等方面都有积极的作用ADDINNE.Ref.{22FBE7EC-F857-4736-8194-59E9E6E2BCBF}[7]。此外，紫苏的药理作用不仅可用在临床和食品上，也可用在油料、保健和农业方面。1.2研究现状紫苏叶中化学活性成分含量丰富，其中以萜类、黄酮和酚类物质为主，具有增强机体免疫力、抗菌及抗氧化等功效ADDINNE.Ref.{28ED8E0D-5454-49FC-AC88-4DB892073641}[8]。近年来有科学家对其抗氧化功能做了大量的研究，成果显著。如刘宁等ADDINNE.Ref.{B79D2CB7-1052-4B64-9F8E-FAEB8B992096}[9]研究发现紫苏叶含有丰富的黄酮类物质，对DPPH自由基有极强清除作用；郭晓青等ADDINNE.Ref.{83796901-2058-4A8F-ADF0-8E9C5E24BD51}[10]以乙醇为溶剂浸提紫苏叶中活性物质，获得多糖含量为9.43%，迷迭香酸含量为22.8%，其提取物对氢氧自由基、氧离子、DPPH自由基均有一定清除能力，但比同浓度Vc的清除能力弱；段江莲等ADDINNE.Ref.{0121E521-DE6D-4953-A969-D160FF0DFAA4}[11]研究发现相比紫苏籽、紫苏梗，紫苏叶甲醇提取物清除DPPH自由基能力及铁还原能力（FRAP）最强，对敏感菌株大肠杆菌的抑制效果最佳，同时，紫苏梗甲醇提取物对ABTS自由基具有较好的清除效果；邢颖等ADDINNE.Ref.{464B39C6-2799-4865-9572-F573494C1B06}[12]研究表明采用超声波纤维素酶同步法获得紫苏提取液的DPPH自由基清除能力及FRAP最强，且提取物中多酚含量与FRAP及DPPH自由基清除能力相关系数分别为0.878、0.804，均为极显著（P＜0.01）。来源于食物中的天然的酚类化合物是很好的抗氧化剂，能够清除体内过多的自由基，延迟或抑制体内的氧化损伤，预防氧化应激相关疾病的发生ADDINNE.Ref.{7950B3C9-766F-45D2-8742-5CFE0F76BF8C}[13]。有研究发现紫苏中主要的酚类物质有儿茶素、芹菜素、阿魏酸、咖啡酸、迷迭香酸和木犀草素ADDINNE.Ref.{14B48F9B-0D03-4DAF-A68A-8A03C03599AF}[14]。1.3抗氧化能力动物体内的活性氧自由基（ROS）水平与机体健康以及免疫、信号传导等功能有重要关系，如ROS含量异常，会破坏生物大分子，影响细胞活性，诱发各种疾病。研究表明，癌症、冠心病、各种炎症、糖尿病、衰老等都与ROS的诱导、攻击有关ADDINNE.Ref.{46B9BA99-2FD0-4697-B215-CBFBEC0831BE}[15]。另外，高血糖或肥胖的人，其ROS水平显著增高。阿尔兹海默症（AD）患者脑内的衰老斑发炎时，其主要成分Aβ蛋白将诱导ROS释放，ROS同时充当炎症的第二种信使ADDINNE.Ref.{DE95049D-FA09-4512-A71F-70593854D034}[16]。抗氧化剂可通过清除机体内过多的ROS，减小氧化压力，来缓解糖尿病并发症和减弱AD的炎症途径ADDINNE.Ref.{18C9F4CC-B161-4212-B426-1CF3A12AD028}[17]。因此研究样品的抗氧化能力对糖尿病和AD的治疗具有一定的参考意义。1.4α-葡萄糖苷酶抑制剂α-葡萄糖苷酶抑制剂（alpha-glucosidaseinhibitors，AGIs）是对Ⅱ型糖尿病有确切疗效，对Ⅰ型糖尿病起辅助作用的口服降糖药物。主要通过竞争性抑制位于小肠黏膜细胞刷状缘上的α-葡萄糖苷酶的活性，来阻碍多糖的分解和延缓葡萄糖的吸收，使餐后血糖水平得到控制ADDINNE.Ref.{350A540F-C5C3-4922-9680-C5A34C099B32}[18]。同时大量临床研究表明，AGIs在调节糖脂代谢、保护胰岛功能、增加胰岛素活性和缓解糖尿病并发症等方面也起重要作用ADDINNE.Ref.{BA403C0D-0269-4289-8203-387BE2841AE9}[19,20]。但目前上市应用的AGIs多为化学合成，如阿卡波糖、米格列醇、伏格列波糖等，常具有一定副作用，多表现为肠胃不适、急性肝炎等，且成本高ADDINNE.Ref.{3D48095E-E49C-40C5-AEE7-D13FFEB8CBDE}[21,22]。但由于该类药物本身的药理作用会引起患者出现不良反应，主要表现为腹胀、腹泻等症状ADDINNE.Ref.{1E229A1E-F83E-4DF6-B9B6-8DCD87C34EB4}[23]，因此国内外学者力图从天然产物中发现和筛选出更安全、毒副作用更小的降血糖活性成分。李项辉ADDINNE.Ref.{0D58360F-B336-40B2-A168-AA88E29AEAF5}[24]的研究结果表明猪胰肠、大米、酵母及细菌来源的α-葡萄糖苷酶会受到紫苏叶提取物的抑制作用。1.5体外模拟消化体外模拟胃肠道消化是指通过在体外模拟体内胃消化和肠道消化的环境，从而更好地评估食物中植物化学物质的变化情况ADDINNE.Ref.{5D3DB121-4FBC-4C4D-B7E5-4E65A9139304}[25]。尽管此方法不能精准有效地还原体内物质运输和代谢机制，但是它却可以作为一个简便的预测性方法。通过建立体外模拟消化模型评估它们的稳定性来发掘食品化合物的潜在生物利用度，如本文探究的体外抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶抑制能力。这种研究方法具快速、安全的优点，并且不像活体试验一样有伦理道德的限制。故借助这种方法用来确定紫苏叶提取物中总酚和总黄酮的潜在生物利用度ADDINNE.Ref.{F6B3B301-F9C5-4E2A-B43A-D5BCE28CD829}[26,27]。有学者通过体外模拟消化对酚类物质及其抗氧化活性进行了研究，发现多酚类物质在胃肠道的消化会受胃肠道消化酶、酸碱环境、无机盐及其他因素的影响从而改变其抗氧化活性。因此体外模拟胃肠消化与化学提取法相比能更好地还原酚酮类物质真实的生理消化情况ADDINNE.Ref.{078BE826-FA27-45A2-A40B-A75583A8E496}[28]。1.6研究意义目前对紫苏的研究大多是其相关成分测定，其中对紫苏所含的黄酮、多酚、多糖等物质的研究偏多，且关于紫苏的体外抗氧化活性研究已有部分报道，而对一些酶的抑制作用研究较少。但由于目前紫苏的应用价值主要还是体现在药食价值上，紫苏作为中药材或食物进入人体消化系统后，经过胃肠道消化酶的处理和酸碱环境的改变，其活性物质的含量及效能变化还未可知，目前亦没有相关研究评测紫苏抗氧化活性物质在人体胃肠道消化过程中的抗氧化能力及α-葡萄糖苷酶抑制能力。因此，本研究以紫苏叶为原料,对其甲醇提取物在体外模拟消化过程中的总酚含量、总黄酮含量及其抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶抑制能力进行了研究,旨在为紫苏在人体消化过程中的功能活性预测评估提供帮助，为紫苏进一步的开发利用提供一定的理论基础。2材料和仪器2.1实验材料2.1.1材料紫苏叶，购于广东省梅州市，于2018年7月采摘，自然晒干后于-20℃储存待用。2.1.2试剂试剂名称生产商胃蛋白酶（酶活力为1:3000）、胰蛋白酶（酶活力为1:250）、纤维素酶、果胶酶江苏锐阳生物科技有限公司没食子酸、福林酚（Folin-Ciocalteu）试剂、芦丁（Rutin）、酿酒酵母α-葡萄糖苷酶、阿卡波糖（Acarbose）、4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-MUG）Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司2,2'-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）、1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）、水溶性维生素E（Trolox）、维生素C（Vc）、槲皮素（Quercetin）Solarbio公司分析纯磷酸二氢钾、过硫酸钾、醋酸钠、磷酸钾、甘氨酸钠、Na2CO3、NaHCO3、NaNO2、Al(NO3)3、FeSO4、FeCl3、NaOH、CuSO4、K2SO4四川西陇化工有限公司分析纯甲醇、H2SO4、HCl四川西陇化工有限公司2.2仪器与设备设备名称型号生产商电子分析天平FA1104N上海丙林电子科技有限公司高速多功能粉碎机YB-250A永康市速锋工贸有限公司数显恒温水浴锅HH-2常州国华电器有限公司循环水式多用真空泵SHB-III郑州长城科工贸有限公司旋转蒸发仪RE-52上海亚荣生化仪器厂数显电热鼓风干燥箱DGH-9140A海一恒科学仪器有限公司超声波清洗器SG5200HDT上海冠特超声仪器有限公司冷冻干燥机LGJ-1D-80北京亚泰科隆仪器技术有限公司pH计YXFT3MP梅特勒-托利多精密仪器有限公司高速台式离心机TGL-10C上海安亭科学仪器厂超低温冰箱U410-86艾本德生物仪器有限公司多功能酶标仪 SYNERGYH1美国BIOTEK公司数显恒温振荡器THZ-82A常州朗越仪器制造有限公司海尔电冰箱BCD-539WT青岛海尔股份有限公司3技术方案3.1紫苏叶提取物的制备取100g紫苏叶经粉碎后过40目筛，按1:20的固液比（w/v）与70％甲醇混合，加入0.06g纤维素酶及0.02g果胶酶，再用醋酸钠缓冲液调pH至5.0，然后在超声波功率为500W、温度为50℃的条件下提取60min，提取后进行抽滤，滤渣再次进行上述相同条件处理，合并前后两次滤液，在50℃下真空浓缩，得到的提取物用70%甲醇定容至100mL,于-20℃保存用于后续处理。3.2模拟胃肠道消化3.2.1模拟胃液消化方法参考文献ADDINNE.Ref.{BAB377AF-19C6-4F71-BEFA-E8B35C9CC737}[29]并略作修改。取若干份各5mL紫苏提取液置于有50mL塑料离心管中，加入450mg胃蛋白酶，振荡其充分溶解，用5MHCl调节pH至2.0，通过振荡器混匀，并在37℃、120r/min的摇床培养箱中恒温振荡2h。分别在第1h、第2h取出样品1、2各三份在5000r/min的转速下离心10min，收集上清液并分装在离心管中，于-20℃冰箱中保存备用。3.2.2模拟肠道消化制备模拟肠消化液，准确称取0.68g磷酸二氢钾，加入0.2mol/LNaOH溶液19mL和40mL离子水，混匀后加入1.0g胰蛋白酶，待胰酶充分溶解后，用NaOH溶液或HCl溶液调节pH值至7.5±0.1，后再加去离子水定容至100mL，充分摇匀。取出胃液消化模拟后的待处理样品，各加入模拟肠消化液10mL，振荡后调节pH值至7.5，通过振荡器混匀，并在37℃、120r/min的摇床培养箱中恒温振荡2h。分别在第1h、第2h取出样品3、4各三份在5000r/min的转速下离心10min，收集上清液并分装在离心管中，于-20℃冰箱中保存备用。空白对照组：用等体积的0.5mol/LNaHCO3代替胃肠道消化液，调pH值至7.5。3.3胃肠道消化过程中紫苏提取物总酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法ADDINNE.Ref.{1A824D33-CF32-415A-AC6F-64F86843BC48}[30]测定样品中的总酚含量。于96孔酶标板上加入25µL稀释后样品与20µLFolin-Ciocalteu试剂，充分混合后加200µL7.5%（w/v）Na2CO3溶液，避光反应25min后，于765nm测吸光值Ai。用体积分数为70%甲醇代替样品做空白，用去离子水代替Na2CO3的吸光值为Aj，样品溶液的吸光值为AΔ=Ai-Aj。以没食子酸（20~100µg/mL）为标准品计算总酚含量，结果表示为毫克没食子酸当量每克干物质（mgGAE/gDW）。3.4胃肠道消化过程中紫苏提取物总黄酮含量的测定 采用AlCl3-NaNO2-NaOH比色法ADDINNE.Ref.{EEEB6819-D8D0-40C8-9439-1DA07F274887}[30]测定样品的总黄酮含量。准确吸取用体积分数为70%甲醇溶液溶解稀释到合适浓度的样品或者标准品40µL于96孔酶标板中，再加入20µL3%NaNO2溶液，振荡混匀后静置6min，然后加入20µL6%Al(NO3)3溶液，振荡混匀，待反应6min后再加入140µL4%NaOH溶液和60µL体积分数为70%甲醇，振荡混匀，静置15min后，于510nm处测吸光值。以芦丁（0~1000µg/mL）为标准品计算总黄酮含量，结果表示为毫克芦丁当量每克干物质（mgRutin/gDW）。3.5胃肠道消化过程中紫苏提取物抗氧化活性的测定3.5.1DPPH自由基清除能力DPPH自由基清除能力的测定参考文献ADDINNE.Ref.{7AE4A0C3-7154-4E68-B465-339D24EAFBA6}[31]的方法并略有修改。准确吸取100µL稀释到合适浓度的样品加入96孔酶标板中，随即加入100µLDPPH溶液（0.15mmol/L），充分混合后在室温下避光反应30min，于517nm处测定其吸光度值（As），以体积分数为70%的甲醇溶液代替样品的反应为空白（Ac），以体积分数为70%的甲醇溶液代替DPPH溶液的反应为样品空白（Ab），以Vc和Trolox为阳性对照，所有测定平行三次，按公式（1）计算清除率。（1）式中：As是样品的吸光度值；Ac是以体积分数70%的甲醇溶液代替样品的反应体系的吸光度值（控制组）；Ab是以体积分数为70%的甲醇溶液代替DPPH溶液的反应体系的吸光度值（空白组）。3.5.2ABTS自由基清除能力ABTS自由基清除能力的测定参考文献ADDINNE.Ref.{D37D9AF9-2163-4C07-B005-047CA5612791}[28,32]的方法，取50µL样品溶液加入96孔酶标板中，加入200µLABTS溶液（含7mmol/LABTS和2.45mmol/L过硫酸钾），充分混合后在室温下避光反应6min，采用酶标仪在734nm处测定其吸光度值（As），以体积分数为70%的甲醇溶液代替样品的反应为空白（Ac），以体积分数为70%的甲醇溶液代替ABTS溶液的反应为样品空白（Ab），以Vc和Trolox为阳性对照，所有测定平行三次，清除率计算同公式（1）。式中，As、Ac不变，Ab是以体积分数为70%的甲醇溶液代替ABTS溶液的反应体系的吸光度值（空白组）。3.5.3铁还原能力（FerricReducingAntioxidantPower，FRAP）参考文献ADDINNE.Ref.{0275FAC8-7DFF-442B-A877-5919C59B41D8}[33]并略加修改，取15µL适宜浓度的样品溶液（体积分数为70%的甲醇溶液稀释）和225µLFRAP溶液（300mmol/LpH3.6醋酸钠缓冲液、10mmol/LTPTZ和20mmol/LFeCl3按体积比10:1:1现用现配）于96孔酶标板中混匀，37℃避光温育10min，在593nm波长下测定吸光度值，以Vc和槲皮素为阳性对照，所有测定平行三次，计算同公式（1）。式中，As、Ac不变，Ab是以体积分数为70%的甲醇溶液代替FRAP溶液的反应体系的吸光度值（空白组）。同时以不同浓度（10~100µg/mL）的FeSO4水溶液代替样品与FRAP溶液反应，计算吸光度，绘制FeSO4浓度与吸光度值的标准曲线，样品的FRAP用FeSO4当量表示，即为每克样品相当于FeSO4的质量（mg）。3.6胃肠道消化过程中紫苏提取物α-葡萄糖苷酶抑制能力的测定参考LiaoADDINNE.Ref.{30E7FB10-9312-477C-A5AF-36777FE2B668}[34]的方法并略加修改，取50µL适宜浓度的样品溶液、20µLα-葡萄糖苷酶溶液（0.14U/mL，pH6.8磷酸钾缓冲液配制）和50µL4-MUG（0.84µM，pH6.8磷酸钾缓冲液配制）于96孔酶标板中充分混匀，37℃避光温育20min，加入100µL甘氨酸钠溶液（200mM，pH10.6）振荡30s终止反应。以激发波长355nm、发射波长460nm进行测定并记录荧光值，以阿卡波糖为阳性对照，所有测定平行三次。抑制率计算按下式。（2）式中：As是样品的荧光值；Ac是以样品溶剂代替样品的反应体系的荧光值（控制组）；Ab是以磷酸钾缓冲液代替酶液的反应体系的荧光值（空白组）。3.7数据统计与分析所有试验平行测定3次，试验结果以平均值±标准偏差表示。采用SPSS22.0软件进行单因素方差分析（ANOVA）和相关性分析。采用Origin2017软件进行方程拟合计算半抑制浓度（IC50）。4研究结果与讨论4.1模拟胃肠道消化对紫苏叶提取物中总酚含量影响图1总酚含量标准曲线Fig.1Thestandardcarveoftotalphenolicscontent天然产物中含有丰富的总酚等活性成分，其与抗氧化活性等一系列生物活性密切相关ADDINNE.Ref.{41392976-EF02-4C3D-941E-35824825859A}[28]图1总酚含量标准曲线Fig.1Thestandardcarveoftotalphenolicscontent图2样品的总酚含量注：柱形图上不同字母表示差异显著，P<0.05，下同。Fig.图2样品的总酚含量注：柱形图上不同字母表示差异显著，P<0.05，下同。Fig.2ThetotalphenolicscontentofsampleNotice:Differentlettersonthecolumnshowsignificantdifferences,P<0.05,thesamebelow.上述结果说明，模拟胃液消化会显著降低样品中总酚，模拟消化结束时的总酚含量是未作处理的46.8%。此外，减少的酚类物质可能是被胃蛋白酶在模拟胃液消化的第1h内分解，而胰蛋白酶对其不起作用。4.2模拟胃肠道消化对紫苏叶提取物中总黄酮含量影响图3总黄酮含量标准曲线Fig.3图3总黄酮含量标准曲线Fig.3Thestandardcarveoftotalflavonoidscontent图4样品的总黄酮含量Fig.4Thetotalflavonoidscontentofsample由图3可知，在测定浓度范围内，芦丁浓度与吸光值呈线性相关关系，其R2值为0.9976。由图4可知，紫苏各处理组的总黄酮含量差异较大，总黄酮含量的大小分别为空白组（652.641±30.691mgGAE/gDW）、胃液消化1h（161.042±24.064mgGAE/gDW）、胃液消化2h（305.61±20.652mgGAE/gDW）、胃肠液消化1h（286.046±37.844mgGAE/gDW）、胃肠液消化2h（280.893±11.757mgGAE/gDW）。紫苏提取物经过模拟胃液消化和肠液消化处理后，其第1h与第2h的总酚含量未发生显著变化（P>0.05），但前者显著低于后者（P<0.05），且均显著低于未做胃肠液处理的空白组（P<0.05）。上述结果说明，模拟胃液消化会使紫苏叶提取物中黄酮类物质含量降低。而且是在模拟胃液消化的第1h内快速下降。在模拟肠道消化处理的第1h内，黄酮类物质出现少量增加，相比模拟胃液消化2h处理后的总黄酮含量升高了87.2%，这说明胰蛋白酶可促进黄酮的释放，与从彦丽等ADDINNE.Ref.{52994842-1E9F-4B1A-B385-8354FD286215}[35]实验结果相一致。此外，总黄酮含量的测定结果与总酚含量的测定结果为极显著相关（P<0.01），相关系数为0.962。4.3抗氧化活性本次研究选取DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和FRAP三种反应体系，评估紫苏在模拟胃肠道消化过程中抗氧化能力ADDINNE.Ref.{4FD7CE47-8333-4671-8FDB-047CBC311956}[36,37]。4.3.1DPPH自由基清除能力紫苏各不同处理组的DPPH自由基清除能力见图5和表1。图5紫苏样品的DPPH自由基清除能力Fig.5图5紫苏样品的DPPH自由基清除能力Fig.5TheDPPHradicalscavengingabilityofPerillasampleTable1TheIC50ofDPPHradicalofPerillasampleIC50（mg/mL）空白组0.520±0.146a胃液消化1h1.222±0.151c胃液消化2h0.801±0.183ab胃肠液消化1h0.949±0.166bc胃肠液消化2h0.766±0.036abVc0.090±0.008Trolox0.155±0.045注：Vc和Trolox作为阳性对照，下同。紫苏各处理组及粗提取物的DPPH自由基清除能力由半抑制浓度（Halfmaximalinhibitoryconcentration，IC50）表示，IC50越低，表示其清除能力越强。由图5可知，紫苏粗提取物经胃液消化后，其DPPH自由基清除能力显著下降，经肠液消化后无明显变化（P<0.05）。IC50的大小分别为空白组（0.52±0.146mg/mL）、胃液消化1h（1.222±0.151mg/mL）、胃液消化2h（0.801±0.183mg/mL）、胃肠液消化1h（0.949±0.166mg/mL）、胃肠液消化2h（0.766±0.036mg/mL）。由表1可知，各组样品均与阳性对照Vc（0.090±0.008mg/mL）和阳性对照Trolox（0.155±0.045mg/mL）有显著性差异（P<0.05）。上述结果表明，体外模拟消化过程会显著降低紫苏提取物的DPPH自由基清除能力，模拟消化结束后的IC50值升高到0.766±0.036mg/mL，相比空白组的IC50升高了47.3%。DPPH自由基清除能力是抗氧化活性的重要指标之一，化合物对其清除能力主要与化合物的羟基数量多少和结构有关，故推测DPPH自由基清除能力降低可能与酚类、黄酮类物质的降解有关。4.3.2ABTS自由基清除能力图6紫苏样品的ABTS自由基清除能力Fig图6紫苏样品的ABTS自由基清除能力Fig.6TheABTSradicalscavengingabilityofPerillasample表2紫苏样品对ABTS自由基的IC50Table2TheIC50ofABTSradicalofPerillasampleIC50（mg/mL）空白组1.364±0.042a胃液消化1h2.91±0.279c胃液消化2h2.335±0.195bc胃肠液消化1h2.719±0.448bc胃肠液消化2h2.132±0.277bVc0.016±0.001Trolox0.032±0.002紫苏各处理组的ABTS自由基清除能力与DPPH自由基清除能力的变化趋势一致。经胃液消化后，其ABTS自由基清除能力显著下降，经肠液消化后无明显变化（P<0.05）。由图6可知，IC50的大小分别为空白组（1.364±0.042mg/mL）、胃液消化1h（2.91±0.279mg/mL）、胃液消化2h（2.335±0.195mg/mL）、胃肠液消化1h（2.719±0.448mg/mL）、胃肠液消化2h（2.132±0.277mg/mL）。由表2可知，各处理组样品均与阳性对照Vc（0.016±0.001mg/mL）和阳性对照Trolox（0.032±0.002mg/mL）有显著性差异（P<0.05）。上述结果表明，体外模拟消化过程会显著降低紫苏提取物的ABTS自由基清除能力，模拟消化结束后的IC50值升高到2.132±0.277mg/mL，相比空白组的IC50升高了56.3%。各处理组抗氧化能力大小的变化趋势与DPPH基本相同，DPPH法和ABTS法的相关系数为0.947（P<0.05），具有显著相关性。4.3.3铁还原能力（FRAP）FRAP与DPPH法和ABTS法不同，不是针对一种自由基的清除活性，测定的是抗氧化物质氧化还原的潜力ADDINNE.Ref.{8382AB1E-C836-4A02-9BA5-811F5FAFA4CB}[38]。原理为样品中的还原性物质在酸性环境下，将TPTZ与Fe3+复合物（Fe3+—TPTZ）还原为Fe2+而呈明显的蓝色，在593nm处有最大吸收，测定反应体系在593nm处的吸光度值记为FRAP值，且以FeSO4为标准物质，FRAP值越大，则样品的FRAP越强ADDINNE.Ref.{6FFC0DBE-D860-43E5-B94B-CC83CE71DA95}[33]。FRAP标准曲线见图7。紫苏各不同处理组的FRAP见图8。图8样品与对照物的FRAPFig.8TheFRAPofsampleorcontrol图7FRAP标准曲线Fig.7ThestandardcarveofFRAP在测定浓度范围内，FeSO4浓度与吸光值呈线性相关关系，其R2值为0.9984。由图8可知，紫苏各处理组的FRAP经胃液消化后，其FRAP显著下降，经肠液消化后无明显变化（P>0.05）。各组FRAP大小分别为空白组（247.899±9.596mgFeSO4/gDW）、胃液消化1h（102.936±2.168mgFeSO4/gDW）、胃液消化2h（119.502±12.672mgFeSO4/gDW）、胃肠液消化1h（107.568±6.68mgFeSO4/gDW）、胃肠液消化2h（113.159±5.002mgFeSO4/gDW）。阳性对照的FRAP大小分别为Vc（2076.666±28.151mgFeSO4/gDW）、槲皮素（1243.333±33.664图8样品与对照物的FRAPFig.8TheFRAPofsampleorcontrol图7FRAP标准曲线Fig.7ThestandardcarveofFRAP上述结果表明，体外模拟消化过程会显著降低紫苏提取物的铁还原能力，模拟消化结束后的FRAP值降至113.159±5.002mgFeSO4/gDW，相比空白组下降了54.4%。此外，测定样品时FRAP法与DPPH法和ABTS法测得的自由基清除能力的相关系数为0.775和0.898，均具有较好的相关关系。4.4α-葡萄糖苷酶抑制能力α-葡萄糖苷酶抑制剂是对Ⅱ型糖尿病有确切疗效的口服降糖药，通过竞争性抑制小肠上α-葡萄糖苷酶的活性，从而阻碍多糖的分解和延缓葡萄糖的吸收，使餐后血糖水平降低ADDINNE.Ref.{47F5DC7B-838F-4A75-9EA8-2B92DEFD434E}[39]。因此，我们通过测定样品抑制α-葡萄糖苷酶活性的能力来评价紫苏的降血糖和抗糖尿病的潜力，结果如图9和表3。图9紫苏样品的α-葡萄糖苷酶抑制能力Fig.9图9紫苏样品的α-葡萄糖苷酶抑制能力Fig.9Theα-glucosidaserestrainingabilityofPerillasampleTable3TheIC50ofα-glucosidaseofPerillasampleIC50（mg/mL）空白组0.113±0.005a胃液消化1h0.296±0.012b胃液消化2h0.344±0.011b胃肠液消化1h0.466±0.079c胃肠液消化2h0.525±0.067c阿卡波糖1.926±0.086注：阿卡波糖作为阳性对照。本论文选择以4-甲基伞形酮-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-MUG）代替常用的p-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）作为底物，4-MUG法较pNPG法除底物稳定时间延长2~3倍外，还可测定溶解性弱、易浑浊的样品，结果灵敏、重现性好。由图9可知，紫苏经模拟胃肠道消化处理后，其α-葡萄糖苷酶抑制能力显著下降，各处理组与未进行胃肠液处理的空白组均存在显著性差异（P<0.05）。其中其胃液消化1h和2h之间、胃肠液消化1h和2h之间差异均不显著（P>0.05），说明其抑制能力下降均发生在各阶段消化前期。由表3可知，样品的IC50均显著低于阳性对照阿卡波糖（1.926±0.086mg/mL）。上述结果表明，紫苏的α-葡萄糖苷酶活性抑制能力在模拟胃肠道消化过程中不断减弱，消化结束时，其IC50值从0.113±0.005mg/mL显著上升至0.525±0.067mg/mL。原因可能是紫苏叶提取物在胃肠道消化时，其总酚、总黄酮等活性物质不断减少，导致α-葡萄糖苷酶活性抑制能力随之变弱。4.5相关性分析表4样品的抗氧化试验结果与总酚含量、总黄酮含量、α-葡萄糖苷酶抑制能力的IC50值的相关性分析Table4ThecorrelationalanalysesofantioxidationexperimentandtotalphenolicscontentandtotalflavonoidscontentandtheIC50valuesofα-glucosidaseinhibitionPerillatotalphenolicstotalflavonoidsDPPHABTSFRAPα-glucosidasetotalphenolics10.962**0.7750.894*0.998**0.779totalflavonoids10.7650.8610.942*0.613DPPH10.947*0.7750.331ABTS10.898*0.536FRAP10.806α-glucosidase1注：**为极显著（P<0.01），*为显著（P<0.05）利用SPSS22.0软件对试验结果进行相关性分析，结果见表4。由表4可知：总酚与总黄酮含量的相关系数为0.962，表示两者高度相关。DPPH、ABTS自由基清除能力和FRAP三种抗氧化试验结果间的相关系数范围为0.775-0.947，且显著性均小于0.05，表明三种抗氧化试验结果间具有良好的相关关系，可共同作为评价样品抗氧化能力的有效指标。三种抗氧化试验结果与α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的IC50值间呈正相关，其相关系数范围为0.331-0.806，且显著性均小于0.05。总酚与总黄酮含量与三种抗氧化试验结果及α-葡萄糖苷酶活性抑制能力呈正相关，其相关系数范围为0.613-0.998，且显著性均小于0.05，说明紫苏叶提取物中的酚类与黄酮类物质可能是其产生抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质。5结论总酚、总黄酮含量测定结果表明：紫苏叶提取物经体外模拟胃肠道消化后，总酚和总黄酮含量都出现显著下降的现象，且减少的含量都集中出现在模拟胃液消化的第1h内，可能与胃蛋白酶的降解作用，以及体系酸碱度、无机盐等其他因素的影响，其作用机理有待进一步探究。体外抗氧化试验结果表明：紫苏叶提取物经体外模拟胃肠道消化后，其抗氧化活性均出现显著减弱，模拟消化结束后，DPPH自由基清除能力的IC50值升高到0.766±0.036mg/mL，ABTS自由基清除能力的IC50值升高到2.132±0.277mg/mL，相比空白组的IC50分别升高了47.3%、56.3%，FRAP值降至113.159±5.002mgFeSO4/gDW，相比空白组的IC50下降了54.4%。三种抗氧化试验结果间的相关系数范围为0.775-0.947（P<0.05），即三个反应体系具有良好的相关关系，可共同评价样品抗氧化能力的有效指标。采用改良的荧光光谱法（4-MUG法）测定紫苏模拟胃肠道消化过程中的α-葡萄糖苷酶抑制能力，结果显示其α-葡萄糖苷酶抑制能力不断减弱，其IC50值升高到0.525±0.067mg/mL。说明紫苏叶活性物质在胃肠道消化时发生降解，影响了其α-葡萄糖苷酶活性抑制能力。相关性分析表明，紫苏叶提取物在体外模拟胃肠道消化过程中的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力呈一定相关性，说明紫苏叶提取物中的酚类与黄酮类物质可能是其产生抗氧化和抑制α-葡萄糖苷酶活性的主要物质。参考文献ADDINNE.Bib参考文献[1] 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