DB35∕T 1995-2021 禽心包积液-肝炎综合征荧光定量 PCR 诊断技术

ICS11.220

CCSB41

35

福建省地方标准

DB35/T1995—2021

禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断

技术

FluorescencequantitativePCRdiagnosisoffowlhydropercardium-hepatitis

syndrome

2021-08-17发布2021-11-17实施

福建省市场监督管理局发布

DB35/T1995—2021

目次

前言.................................................................................II

1范围...............................................................................1

2规范性引用文件.....................................................................1

3术语和定义.........................................................................1

4疫病概述...........................................................................1

5设备、材料和试剂...................................................................2

6样品的采集、保存和处理.............................................................2

7样品中病毒DNA提取.................................................................3

8荧光定量PCR操作步骤...............................................................3

9结果判定...........................................................................3

10测序..............................................................................4

附录A（规范性）试剂的配制及引物序列.................................................5

附录B（资料性）扩增产物参考基因序列和荧光定量PCR扩增曲线图.........................6

I

DB35/T1995—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由福建省农业科学院提出。

本文件由福建省农业农村厅归口。

本文件起草单位：福建省农业科学院畜牧兽医研究所、福州海关技术中心。

本文件主要起草人：施少华、陈珍、陈翠腾、叶洪、张体银、郑腾、黄瑜、朱春华、傅光华、程龙飞、

万春和、彭春香、刘荣昌、陈红梅、傅秋玲。

II

DB35/T1995—2021

禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术

1范围

本文件规定了禽心包积液-肝炎综合征荧光定量PCR诊断技术的设备、材料和试剂，样品的采集、处

理和保存，样品中病毒DNA的提取，荧光定量PCR操作步骤及结果判定的技术要求。

本文件适用于禽心包积液-肝炎综合征的分子生物学诊断及流行病学监测。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

禽心包积液-肝炎综合征fowlhydropercardium-hepatitissyndrome；HHS

由禽腺病毒4型引起禽类的以心包积液、肝炎为特点的一种综合征。

3.2

禽腺病毒4型fowladenovirusserotype4；FAdV-4

引起禽心包积液-肝炎综合征的病原。

3.3

循环阈值cyclethreshold；Ct值

荧光定量PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

4疫病概述

禽心包积液-肝炎综合征（HHS），最早于1987年发生于巴基斯坦安卡拉地区。目前，该病呈现世界

范围分布，多个国家、地区相继报道该病的发生，各地分离到的毒株略有差异，但大多为FAdV-4，且具

有很强的致病性。2010年以来，我国多地发生了HHS，并从发病鸡群中分离到FAdV-4。该病主要临床特

征为心包充盈，心包内积有淡黄色液体或胶冻样物；肝脏呈现不同程度肿胀，质地较脆、易碎，有出血

斑或出血点；肾脏肿大、质地较脆，有的呈现“花斑肾”。该病主要发生于3～5周龄肉鸡，10～20周龄

蛋鸡偶有发生，有报道鸭、鹅、鸽及野鸟也可发生该病。发病鸡在4d后开始死亡，死亡期可持续7d～

10d，发病率和病死率分别为10%～30%和20%～75%。该病一年四季均可发生，以水平传播为主，也可垂

直传播，感染鸡排毒期可长达9周，发病日龄越早，死淘率越高。

1

DB35/T1995—2021

5设备、材料和试剂

5.1设备

5.1.1台式冷冻高速离心机（转速应＞12000r/min）。

5.1.2水浴锅或金属浴。

5.1.3微量可调移液器（量程分别为100µL～1000µL、20µL～200µL、2µL～20µL、0.5µL～

10µL）。

5.1.4荧光定量PCR仪。

5.1.5旋涡混合仪

5.2材料和试剂

5.2.1棉拭子稀释液：配比按照附录A的A.1。

5.2.2组织稀释液：配比按照附录A的A.2。

5.2.310%SDS溶液：配比按照附录A的A.3。

5.2.43mol/L醋酸钠缓冲液（pH5.2）：配比按照附录A的A.4。

5.2.575%乙醇：配比按照附录A的A.5。

5.2.6荧光定量PCR检测用引物和探针的序列、使用方法：配比按照附录A的A.6。

5.2.7蛋白酶K、Tris饱和苯酚、酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）、无水乙醇：直接购买成品使用。

5.2.8ProbeqPCR试剂盒：应与荧光定量PCR仪相配套的探针qPCR试剂盒。

5.2.9PCR反应管：与荧光定量PCR仪相配套的PCR反应管。

4

5.2.10阳性对照：含FAdV-4目的基因片段的质粒DNA（拷贝数≥2.13×10/µL）。

5.2.11阴性对照：Nuclease-freeWater。

6样品的采集、保存和处理

6.1样品的采集

6.1.1棉拭子样品的采样

将棉拭子插入咽喉或泄殖腔旋转3～5次，取出放入盛有1.0mL棉拭子稀释液的1.5mL无菌离心管中。

6.1.2组织样品的采集

无菌采集病禽有明显病变的肝脏、脾脏等组织。

6.2样品保存

样品采集后应保存在2℃～8℃条件下，24h内送达实验室。超过24h的应保存在-20℃条件下，

且时间不应超过7d。如需长期保存，须保存在-70℃～-80℃条件下。

6.3样品的处理

6.3.1棉拭子样品的处理

取出棉拭子样品，于旋涡混合仪上振荡15s，4℃、5000r/min离心10min，取上清液备用。

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DB35/T1995—2021

6.3.2组织样品的处理

取组织样品，按质量体积比（1:5）加入组织稀释液进行匀浆，转入1.5mL无菌离心管中，反复冻

融2～3次后，4℃、5000r/min离心10min，取上清液备用。

7样品中病毒DNA提取

7.1常规方法提取DNA

7.1.1取540μL上清液，先加60μL10%SDS溶液后，再加蛋白酶K至终浓度50μg/mL，于旋涡混

合仪上混匀15s，置56℃孵育2h。

7.1.2加入等体积Tris饱和苯酚，于旋涡混合仪上混匀15s后，置4℃、12000r/min离心15min。

7.1.3离心后吸取上清液转移至1.5mL无菌离心管（注意不要吸出中间层），加入等体积酚:氯仿:

异戊醇（25:24:1），颠倒混匀15s，静置5min后，置4℃、12000r/min离心15min，吸取上清

液转至其他无菌离心管中。

7.1.4重复7.1.3步骤1次。

7.1.5加入相当于上清液1/10体积的3mol/L的醋酸钠缓冲液（pH5.2）、2倍体积的无水乙醇，颠

倒混匀15s，-20℃沉淀2h。

7.1.6于4℃下12000r/min离心15min后倾去上清液，加入800μL75%乙醇溶解沉淀物，置4℃

下12000r/min离心5min后吸尽残余液体；再以75%乙醇溶解沉淀物1次，置4℃下12000r/min

离心5min，吸尽残余液体；置4℃下12000r/min离心5s后吸尽残余液体，室温静置5min。

7.1.7加入50μL灭菌双蒸水溶解沉淀物，冰浴备用。提取的DNA应于2h内进行荧光定量PCR或保

存于-20℃条件下。

7.2商品化试剂盒提取DNA

病毒DNA的提取，也可采用商品化DNA提取试剂盒提取。

8荧光定量PCR操作步骤

在PCR反应管中分别加入以下试剂：ProbeqPCRmix10µL，引物FAdV-4-F、FAdV-4-R各0.4µL，

探针引物FAdV-4-P0.8µL，模板DNA2.0µL，加Nuclease-freeWater至总体积20µL，混匀，离心5s。

将PCR反应管放入定量PCR仪，扩增反应条件：95℃预变性2min；95℃变性10s，60℃退火30s，共

40个循环；最后保存于4℃。同时，设立阳性对照和阴性对照各至少一个。

9结果判定

阳性对照有典型的扩增曲线，且Ct值≤27；阴性对照无扩增曲线，且无Ct值；两者均符合，方可判

定检测结果有效，见附录B的B.1。

待检样品Ct值≤32时，且出现典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阳性，见附录B的B.1。

待检样品Ct值＞35时，或无典型的扩增曲线，判为FAdV-4核酸检测阴性，见附录B的B.1。

待检样品32＜Ct值≤35时判为可疑，应重做；重做时待检样品Ct值≤32判为FAdV-4核酸检测阳性，

待检样品Ct值＞32判为FAdV-4核酸检测阴性。

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10测序

必要时可对定量PCR产物进行测序，参考序列参见附录B的B.2。

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DB35/T1995—2021

附录A

（规范性）

试剂的配制及引物序列

A.1棉拭子稀释液

0.01mol/LPBS缓冲液中添加青霉素（10000IU/mL）、链霉素（10mg/mL）、庆大霉素（250pg/mL）

和制霉菌素（5000IU/mL），调节pH至7.2～7.4。

A.2组织稀释液

0.01mol/LPBS缓冲液中添加青霉素（2000IU/mL）、链霉素（2mg/mL）、庆大霉素（50pg/mL）

和制霉菌素（1000IU/mL），调节pH至7.2～7.4。

A.310%SDS溶液

称量10g十二烷基硫酸钠，加入90mL灭菌双蒸水，小心搅拌，缓慢加热至水温在25℃以上使之完

全溶解。

A.43mol/L的醋酸钠缓冲溶液

取800mL水加入408g三水醋酸钠，溶解后用冰乙酸调节pH值至5.2，加水定容到1000mL。

A.575%乙醇

量取750mL的无水乙醇加入250mL的灭菌双蒸水。

A.6荧光定量PCR检测用引物序列

荧光定量PCR检测用引物序列为：

a)正向引物FAdV-4-F：5′-CCCGATCTCAGTCAAATT-3′；

b)反向引物FAdV-4-R：5′-TGCTAAACTTGTAACGGTC-3′；

c)探针引物FAdV-4-P：5′-FAM-AACGACAAAAACACCGCC-MGB-3′。

荧光定量PCR扩增片段为196bp，引物和探针用双蒸水溶解至10µmol/L，保存于-20℃备用。