DB2102∕T 0083-2023 小新月菱形藻藻种提纯复壮技术规程

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DB2102/T0083—2023

小新月菱形藻藻种提纯复壮技术规程

1范围

本文件规定了水产养殖用小新月菱形藻NitzschiaClosterium藻种（以下简称藻种）提纯复壮的术语

和定义、水质和设施设备条件、藻种培养液和固体培养基的配制、消毒除菌、固体培养基藻种培养及保

存、细胞提纯复壮及扩繁等内容。

本文件适用于水产养殖用小新月菱形藻等低温硅藻的一级藻种提纯复壮。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB11607-1989渔业水质标准

SC/T2047-2006水产养殖用海洋微藻保种操作技术规范

DB21/T2777-2017海洋浮游微藻分离和筛选技术规程

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1

藻种细胞提纯复壮purificationandrejuvenationofalgaecells

通过分离技术，将混杂或衰退藻种中一部分仍保持原有典型性状的单细胞分离出来，经扩大培养以

恢复原藻种的典型性状。

3.2

固体培养基solidmedium

在培养液中加入适宜凝固剂，灭菌处理后凝固制成平板或斜面，用于微藻藻种的分离、纯化、复壮、

保存培养的培养基。

3.3

藻种克隆algaecloning

由同一个藻种细胞分裂繁殖而形成的、具有相同遗传物质的细胞系。

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4水质和设施设备条件

4.1水质条件

所用海水应经沉淀、过滤处理，水质应符合GB11607-1989的规定。

4.2设施设备

4.2.1清洗设备

水槽、试管刷和大瓶刷。

4.2.2消毒设备

紫外灯、烘箱、高压灭菌锅、电陶炉、煤气或液化气灶具。

4.2.3操作观察设备

显微镜、超净工作台、电子天平、配制营养液所需化学试剂（分析纯及以上等级）、量程为100μl

和1ml移液器及配套枪头，用于培养的一次性无菌培养皿（直径90mm～100mm）和20ml～40ml玻璃试

管（配有带砂芯乳胶塞），试管架、20ml一次性无菌注射器及0.22μm孔径无菌针筒式滤膜过滤器。

4.2.4培养保种设备

光照培养架、低温展示柜、恒温光照培养箱。

5藻种培养液和固体培养基的配制

5.1营养液配制

5.1.1康威培养基（以下简称A液）、康威培养基—微量元素溶液（以下简称B液）和康威培养基—

硅酸钠溶液的成分参照DB21/T2777-2017附录A，康威营养液由A液和B液组成，具体如下：

a)配制A液时，将DB21/T2777-2017表A.1.1中试剂加入纯水中，加热至试剂完全溶解；

b)配制B液时，将DB21/T2777-2017表A.1.2中试剂加入纯水中，滴加10%盐酸摇匀，至试剂

完全溶解，液体澄清；

c)将B液全部倒入A液中，放置12h以上，即成为康威营养液。

5.1.2藻种培养用尿素溶液配方见附录A。

5.2固体培养基用抗生素溶液配制

藻种固体培养基用抗生素溶液配方见附录B。

5.3藻种扩繁用培养液配制

灭菌海水冷却后，按照1000：1体积比分别加入灭菌的康威营养液、康威培养基—硅酸钠溶液和尿

素溶液后摇匀。

5.4固体培养基配制

向100ml海水中加入0.8g～1g琼脂粉，加热至溶解制成琼脂海水基质，高压灭菌后置超净工作台

中，于室温下冷却至45℃～55℃时按照1000：1体积比分别添加灭菌的康威营养液、康威培养基—硅酸

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钠溶液、尿素溶液和抗生素溶液后摇匀，立即向一次性灭菌培养皿内倒入约20ml，使培养基铺满每个

培养皿底部，静止放置至培养基凝固后，倒置于超净台中备用。

6消毒除菌

6.1藻种扩繁用海水灭菌

按照SC/T2047-2006中5.1.1规定的微藻分离、保存用海水的消毒方法执行。

6.2营养液和固体培养基灭菌

康威营养液、康威培养基—硅酸钠溶液以及琼脂粉海水基质应采用121℃高压蒸汽灭菌15min，尿

素溶液应采用0.22μm孔径无菌针筒式滤膜过滤器过滤除菌。

6.3器具灭菌

塑料器具应采用121℃高压蒸汽灭菌15min，灭菌后置于80℃恒温箱烘干；玻璃器具应用135℃恒温

3h灭菌。

7固体培养上藻种培养与保存

7.1接种

7.1.1藻种活化

藻种（细胞浓度为8×106cell/ml～1.2×107cell/ml）按照1：1000比例接种藻种扩繁用培养液，

环境温度17℃～20℃，光照度3000Lux～6000Lux下培养2d。

7.1.2藻种的接种

用微量移液器向固体培养基上添加100μL灭菌海水，取活化藻种10μL～20μL放入固体培养基中，

使灭菌海水与藻种混合。

向固体培养基上加入4颗～6颗直径4mm左右的玻璃珠，盖好培养皿，水平摇晃培养皿，使玻璃珠在

培养基上随机滚动，将藻种和海水均匀涂布在固体培养基上。

2h～4h后，固体培养基上液体被基本吸收后，用封口膜缠绕培养皿侧面，将培养皿上下结合部空

间封闭。

7.2藻种克隆的培养

适宜条件下（见7.1.1）培养固体培养基上的藻种细胞，25d～30d后，在固体培养基上长出1mm

以上的藻种克隆。

7.3藻种克隆的度夏保种

当固体培养基上长出大于1mm的藻种克隆时，应将培养皿放置于4℃～6℃透光低温展示柜保存，保

存期可达5个月～17个月。

8细胞提纯复壮及扩繁

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8.1固体培养基上藻种细胞的提纯复壮

秋季，室温下降至20℃时，对固体培养基上藻种细胞进行提纯复壮筛选：

——将固体培养基置于显微镜下观察各个藻种克隆，挑选细胞形状饱满、细胞数量多、色素均匀且

没有细菌混杂的藻种克隆；

——用灭菌牙签将选择好的藻种克隆挑起，放入盛有10ml扩繁营养液的试管中，于适宜条件下（见

7.1.1）培养，同时进行多个藻种克隆的筛选培养，一个藻种克隆培养一管，不同藻种克隆间

不应相互混淆。

8.2提纯复壮藻种的扩繁

当试管内的藻细胞生长密度超过3×106cell/ml时，比较不同试管中克隆细胞的密度，挑选细胞密

度较大的克隆群体，倒入盛有400ml扩繁营养液的500ml三角烧瓶中,适宜条件下（见7.1.1）扩繁培养。

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AA

附录A

（资料性）

藻种培养用尿素溶液配方

A.1藻种培养用尿素溶液配方见表A.1

表A.1藻种培养用尿素溶液配方

成分用量

尿素3.0g

蒸馏水100ml

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BB

附录B

（资料性）

藻种固体培养基用抗生素溶液配方

B.1藻种固体培养基用抗生素溶液配方

B.1.1藻种固体培养基用青链霉素溶液配方见表B.1，所用抗生素均为试剂级。

表B.1藻种固体培养基用青链霉素溶液配方

成分用量