步步高单克隆抗体的流程

演讲人：日期:步步高单克隆抗体的流程目录CATALOGUE01免疫原准备02动物免疫03细胞融合04杂交瘤筛选05克隆与生产06纯化与鉴定PART01免疫原准备抗原选择标准免疫原性与特异性抗原需具备强免疫原性以刺激B细胞活化，同时需确保其表位特异性，避免与其他蛋白发生交叉反应。优先选择天然构象完整的蛋白或合成多肽。纯度与稳定性抗原纯度应达到电泳级（>90%），避免宿主蛋白污染；需通过HPLC或质谱验证稳定性，确保在免疫周期内不发生降解或构象改变。分子量适宜性推荐使用10-150kDa范围内的抗原，过小需载体蛋白偶联（如KLH），过大可能影响淋巴结摄取效率。弗氏佐剂体系可选用TLR激动剂（如CpGODN）或纳米颗粒佐剂，通过激活树突细胞增强Th1/Th2双向免疫应答，但需进行预实验优化配比。新型佐剂应用生物安全性评估所有佐剂需通过内毒素检测（<0.1EU/mg），避免使用可引起自身免疫反应的成分如百日咳毒素。初次免疫采用完全弗氏佐剂（CFA）形成油包水乳剂，加强免疫改用不完全弗氏佐剂（IFA），需严格控制注射剂量避免肉芽肿形成。佐剂使用原则免疫原制备方法蛋白抗原处理重组蛋白需经复性缓冲液处理恢复天然构象，膜蛋白需添加CHAPS等温和去垢剂维持溶解性，冻干品需用PBS缓慢复溶避免聚集。多肽偶联技术通过Sulfo-SMCC等异双功能交联剂将半抗原与载体蛋白偶联，需控制摩尔比（20:1-30:1）并通过MALDI-TOF验证偶联效率。灭活病原体制备采用β-丙内酯或甲醛灭活后超速离心纯化，需通过空斑试验验证无活性残留，并添加铝佐剂增强呈递效果。PART02动物免疫免疫方案设计免疫周期规划设计包含基础免疫、加强免疫的阶梯式程序，基础免疫间隔周期需覆盖淋巴细胞活化期，加强免疫时机依据血清抗体动态调整。03优先采用皮下、腹腔或淋巴结注射等多点免疫策略，确保抗原充分接触免疫系统。佐剂选择需匹配抗原性质，如弗氏佐剂适用于水溶性抗原。02免疫途径确定抗原选择与优化根据目标蛋白特性筛选高纯度抗原，必要时进行抗原表位修饰或偶联载体蛋白以增强免疫原性。需综合考虑分子量、稳定性及宿主兼容性。01梯度剂量测试基础免疫阶段每间隔一定周期进行免疫，加强免疫频率需结合ELISA效价监测结果，通常效价平台期后实施最终加强。动态频率调整生理状态监控定期监测动物体温、体重及局部反应，异常情况下需暂停免疫并优化方案，确保动物福利与免疫效果平衡。通过预实验确定最佳抗原剂量，避免免疫耐受或过度炎症反应。初始剂量通常为50-100μg/次，后续根据动物体重和反应调整。剂量与频率控制在末次免疫后定期采血检测，绘制抗体效价变化曲线。效价达到1:10^5以上方可进行细胞融合，过低时需追加免疫。动态监测策略检测血清对相关蛋白的交叉结合能力，必要时通过亲和层析纯化目标抗体，减少后续筛选假阳性。交叉反应评估包被纯化抗原建立检测标准曲线，设置阳性/阴性对照，确保效价检测特异性。临界值设定需通过统计学分析确定。标准化ELISA体系建立血清效价检测PART03细胞融合骨髓瘤细胞培养采用高糖DMEM培养基，补充10%-15%胎牛血清、1%非必需氨基酸及2mML-谷氨酰胺，确保细胞生长所需的营养物质充足。细胞培养基配制培养环境控制传代与冻存维持恒温培养箱条件为37℃、5%CO2饱和湿度，定期观察细胞形态和密度，避免污染或过度生长导致细胞老化。当细胞融合度达80%-90%时，用0.25%胰酶消化传代，冻存时采用含10%DMSO的冻存液，梯度降温保存于液氮中。脾细胞分离技术脾脏组织处理无菌条件下取出脾脏，置于预冷的PBS缓冲液中，用注射器内芯轻柔研磨并通过200目细胞筛网获得单细胞悬液。红细胞裂解采用台盼蓝染色法计数，要求活细胞比例超过95%，并通过流式细胞术检测B淋巴细胞表面标志物CD19的表达水平。使用ACK裂解液处理细胞悬液5分钟，离心去除红细胞残留，保留淋巴细胞群体用于后续融合实验。细胞活性检测融合试剂与条件PEG融合法选用分子量1500-4000的聚乙二醇作为融合剂，浓度控制在50%，融合时严格保持37℃水浴并精确控制作用时间在1-2分钟。电融合技术采用方波电脉冲参数为场强1-2kV/cm、脉冲宽度30-50μs，优化膜穿孔效率的同时保证细胞存活率。后处理步骤融合后立即用无血清培养基稀释终止反应，低速离心去除残留PEG，重悬于HAT选择培养基中进行杂交瘤筛选。PART04杂交瘤筛选HAT培养基应用选择性抑制非融合细胞HAT培养基中的氨基蝶呤能阻断核苷酸合成途径，抑制骨髓瘤细胞增殖，而杂交瘤细胞可利用次黄嘌呤和胸腺嘧啶通过补救途径存活，从而实现选择性培养。优化细胞融合效率通过调整HAT培养基中次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶的浓度比例，可显著提高杂交瘤细胞的形成率，同时减少未融合亲本细胞的干扰。长期稳定性验证需定期检测HAT培养基的pH值、渗透压及营养成分稳定性，确保其能持续维持杂交瘤细胞的生长和抗体分泌功能。酶联免疫吸附试验（ELISA）采用高特异性抗原包被微孔板，通过酶标二抗与杂交瘤上清液中的抗体结合，显色反应定量检测抗体分泌水平，灵敏度可达pg级。抗体分泌检测方法免疫荧光细胞染色利用荧光标记的抗原与细胞表面或胞内抗体结合，通过流式细胞术或共聚焦显微镜直接观察抗体分泌细胞的分布及强度。免疫印迹法（WesternBlot）将杂交瘤上清液中的抗体与目标抗原进行电泳分离后转膜，通过化学发光法检测抗体与抗原的特异性结合能力。阳性克隆初筛有限稀释法克隆化将初筛阳性孔细胞进行梯度稀释至0.5-1个细胞/孔，通过统计学方法确保单克隆性，避免多克隆竞争导致的抗体特性丢失。交叉反应性测试采用相关抗原家族蛋白或组织切片进行抗体特异性验证，排除与非目标抗原结合的假阳性克隆。亚克隆稳定性评估对候选克隆进行至少三轮亚克隆培养，检测各代次细胞抗体分泌的一致性，排除遗传不稳定的克隆株。PART05克隆与生产有限稀释克隆化通过有限稀释法将杂交瘤细胞稀释至每孔0.5-1个细胞，确保单克隆性，避免多克隆竞争干扰抗体特异性。单细胞分离技术采用条件培养基或饲养层细胞提供生长因子支持，提高低密度细胞的存活率与增殖能力。克隆效率优化通过ELISA或流式细胞术检测上清液抗体滴度，筛选高表达克隆并逐步扩大培养规模。克隆筛选与扩增细胞株稳定性验证遗传标志物监测通过STR分析或核型检测确认细胞株无交叉污染或遗传漂变，维持单克隆源性。冻存复苏性能评估验证细胞株在液氮冻存后复苏的存活率、生长曲线及抗体分泌能力，排除冻存损伤影响。长期传代稳定性测试连续传代30代以上，定期检测抗体产量、亲和力及遗传稳定性，确保生产一致性。体外培养流程01采用基础培养基配合葡萄糖/谷氨酰胺动态补料，平衡细胞生长与抗体表达效率。优化pH（7.0-7.4）、溶氧（30%-60%）、温度（36.5-37.5℃）等参数，最大化细胞密度和抗体产量。使用化学成分明确的无血清培养基降低批次差异，避免动物源性成分引入外源风险。0203分批补料培养策略生物反应器参数控制无血清培养基应用PART06纯化与鉴定抗体分离技术疏水相互作用层析基于抗体疏水性的差异，在高盐条件下吸附至疏水介质，低盐洗脱，常用于分离结构相似但疏水性不同的抗体变体。离子交换层析根据抗体表面电荷差异，通过调整pH和盐浓度梯度分离不同电荷特性的抗体组分，适用于去除宿主细胞蛋白和DNA残留。亲和层析法利用抗原-抗体特异性结合原理，通过固定化抗原或ProteinA/G层析柱选择性捕获目标抗体，实现高效分离。洗脱后需进行缓冲液置换以去除杂质。01SDS电泳通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳评估抗体纯度，观察单一条带（约150kDa非还原条件或50kDa还原条件）确认无降解或聚合。高效液相色谱（HPLC）采用尺寸排阻色谱（SEC-HPLC）检测聚集体和片段，反相色谱（RP-HPLC）分析疏水性杂质，纯度需达95%以上。紫外分光光度法通过280nm吸光度测定抗体浓度，需校正核酸和蛋白污染的影响，计算公式为浓度（mg/mL）=（A280×稀释倍数）/消光系数。纯度与浓度分析0203功能验证测试0