DB53∕T 1082-2022 高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程

ICS65.020

CCSB15

53

云南省地方标准

DB53/T1082—2022

高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程

2022-05-20发布2022-08-20实施

云南省市场监督管理局  发布

DB53/T1082—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由云南省农业科学院甘蔗研究所提出。

本文件由云南省农业标准化技术委员会（YNTC07）归口。

本文件起草单位：云南省农业科学院甘蔗研究所。

本文件主要起草人：李婕、黄应昆、单红丽、王晓燕、张荣跃、仓晓燕、王长秘、尹炯、罗志明。

I

DB53/T1082—2022

高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程

1范围

本文件规定了高粱花叶病毒RT-PCR检测方法中涉及的仪器与耗材、试剂、检测样品的取样及对照设

置、检测方法和结果判定等。

本文件适用于高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus，SrMV）侵染的植物样品的RT-PCR检测。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

高粱花叶病毒Sorghummosaicvirus

高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus，SrMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属

（Potyvirus），是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，英文名称为Sorghummosaicvirus，缩写为SrMV，

参见附录A。

3.2

RT-PCR

反转录聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR）的简称，是一

种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得RNA特定片段。

4仪器与耗材

4.1仪器

主要仪器包含电子天平、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡

旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、可调微量移液器、研钵等。

4.2耗材

无核酸酶（Nuclease-free）的1.5mL和2.0mL离心管及0.2mLPCR管等。

5试剂

5.1常规试剂

液氮、焦碳酸二乙酯（DEPC）灭菌水或者RNase-free水、植物总RNA提取试剂盒、三氯甲烷、70%

乙醇、异丙醇、无水乙醇等。

1

DB53/T1082—2022

5.2RT-PCR试剂

Oligo(dT)18引物（0.5µg/µL），RT-PCR反转录试剂盒，含溴酚蓝染料的2×EasyTaqPCRSuperMix

聚合酶混合物。

5.3引物

5.3.1上游引物SrMV-F：5′-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3′，下游引物SrMV-R：

5′-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3′（R=A/G，Y=C/T）。

5.3.2用无核酸酶的水将上、下游引物分别配制成浓度为20µM的水溶液。

5.3.3目的扩增片段约为820bp。

5.4电泳缓冲液的配制

按以下步骤配制电泳缓冲液：

a)称取242g的Tris，先用300mL的ddH2O搅拌溶解后，加100mL0.5mol/L的EDTA水溶液

配制50×TAE储存液；

b)用ddH2O将储存液稀释50倍配制1×TAE工作液；

c)称取Tris108g、硼酸55g、7.44g的Na2EDTA·2H2O，加入40mL0.5mol/L的EDTA水溶液，

再用ddH2O定容至1000mL配制10×TBE储存液；

d)用ddH2O将储存液稀释20倍配制0.5×TBE工作液。

5.5扩增产物电泳检测试剂

1%左右（W/V）琼脂糖，核酸染料。

6检测样品的取样及对照设置

6.1阳性对照

以SrMV侵染的植物样品作为阳性对照。

6.2阴性对照

以健康植物样品作为阴性对照。

6.3空白对照

以灭菌ddH2O作为空白对照。

6.4取样

戴一次性手套采集甘蔗叶片或芽作为待检样品，且每采一个样品跟换一次手套，过程中不应交叉污

染。

将采的集样品放入自封袋中，编号，冷藏运输到实验室液氮速冻后，于-80℃冰箱保存备用。

7检测方法

7.1总RNA提取

总RNA提取步骤如下：

2

DB53/T1082—2022

a)戴一次性手套称取0.1g待测样品置于灭菌研钵中，液氮冷冻，研磨至粉状后放入1.5mL离心

管中，并对每支管进行编号；

b)用核酸提取试剂盒提取样品总RNA，按提取试剂使用说明书进行操作；

c)提取后用蛋白/核酸分析仪测定RNA相对浓度，当A260/A280比值为1.8～2.0时，可用于

RT-PCR检测。

7.2反转录

按以下步骤进行反转录：

a)以提取的总RNA为模板，在PCR管中按序依次加入：Oligo(dT)18引物约0.5µL、RNA模板

约2.0μL（约200ng）、反转录试剂、灭菌DEPC水补足10μL反转录反应体系，混匀；

b)2000rpm快速离心10s，放入PCR仪合成cDNA，按RT-PCR试剂盒说明书进行操作。

7.3PCR扩增

按以下步骤进行PCR扩增：

a)以合成的cDNA第一链为模板，在PCR管中按序依次加入：灭菌DEPC水7.2μL、含溴酚蓝

染料的2×EasyTaqPCRSuperMix聚合酶混合物10μL、反转录产物（cDNA）2.0μL、0.4μL

上游引物SrMV-F（20μM）、0.4μL下游引物SrMV-R（20μM），制成20μLPCR反应体系，

2000rpm快速离心10s混匀后放进PCR仪进行PCR扩增；

b)94℃预变性5min；

c)94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；

d)72℃延伸10min。

7.4琼脂糖凝胶电泳检测

按以下步骤进行：

a)用1×TAE或0.5×TBE缓冲液配制1.0%左右（W/V）琼脂糖胶，加热至琼脂糖完全熔化；

b)待凝胶冷却至50℃～60℃时，在100mL琼脂糖胶中加入适量的核酸染料，混匀；

c)将凝胶倒入置有样品梳的制胶板上；

d)待凝胶充分冷却后，拔除样品梳，将制胶板同制好的琼脂糖凝胶一并放入装有1×TAE或

0.5×TBE电泳缓冲液的水平电泳槽；

e)每个样品取10μLPCR扩增产物加入样品梳孔，在其中一个样品梳孔中加入6μLDNA分子量

标准（MarkerE），130V恒定电压下电泳25min；

f)电泳结束后，把胶板取出用凝胶成像仪观察、拍照。

8结果判定

阳性对照在820bp左右有条带，阴性对照和空白对照无条带，则检测结果有效。RT-PCR检测结果

判定详见表1。

3

DB53/T1082—2022

表1RT-PCR检测结果判定

判定条件

RT-PCR产物在820bp左右有无条带出现（参见附录B）结果判定

序号空白对照阴性对照阳性对照检测样品

检测结果有效，被检测甘蔗样品感染高粱花

无无有有

1叶病毒

检测结果有效，被检测甘蔗样品未感染高粱

无无有无

2花叶病毒

检测结果无效，将实验中的所有试剂更换，

3有/无有/无无有/无并重新提取检测样品RNA，进行RT-PCR检

测

4

DB53/T1082—2022

附录A

（资料性）

高粱花叶病毒

A.1高粱花叶病毒

高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）

成员，英文名称为Sorghummosaicvirus，缩写为SrMV。

A.2病原特征

A.2.1病毒粒体

SrMV病毒粒体呈弯曲线状，无包膜，螺旋对称结构，大小为（750～850）nm×（13～15）nm。

A.2.2基因组

基因组由一条正单链RNA组成，大小约10kb，编码一个多聚蛋白，经蛋白酶水解后可产生10个成

熟的蛋白质，从N端到C端依次是P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP，还

在P3氨基端编码区发生移码翻译出P3N-PIPO。

A.3寄主

在自然条件下，SrMV可侵染甘蔗（Saccharumofficinarum）、高粱（Sorghumbicolor）、玉米（Zea

mays）和细叶芒（Miscanthussinensis）等禾本科植物。

A.4病害症状

SrMV侵染为害叶片，花叶症状主要表现在叶片上，尤以新叶基部症状最为明显；病毒可系统侵染，

导致整丛蔗株发病，叶色褪绿，产生许多与叶脉平行的黄绿相间不规则条纹，大小长短不一，布满叶片，

与正常部分参差间隔成“花叶”；病株生长差、矮化、分蘖少，汁液量减少。

A.5传播途径

SrMV可通过带毒的无性繁殖材料（种质）、田间病株及种传等方式传播，可通过收获机械、刀具

和摩擦接种等方式传播，也可被多种蚜虫（甘蔗棉蚜C