DB15∕T 2112-2021 土壤中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定 高效液相色谱法

ICS65.100.01

CCSZ18

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2112—2021

土壤中土霉素、四环素、金霉素残留量的测

定高效液相色谱法

Determinationofoxytetracyline，tetracylineandchlortetracyline

residuescontentinSoil—HPLCmethod

2021-03-25发布2021-04-25实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2112—2021

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由赤峰市农牧科学研究院提出。

本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC19）归口。

本文件起草单位：赤峰市农牧科学研究院。

本文件主要起草人：邓宇、文辉、王岩、乌仁图雅、荣迪、李宝栋、王盛男、陈琪、赵剑平、娜日

娜、曲颖超、李雯雯、索力墨、红敏、巴图、刘汉宇、张智勇。

I

DB15/T2112—2021

土壤中土霉素、四环素、金霉素残留量的测定高效液相色谱法

1范围

本文件规定了土壤中土霉素、四环素和金霉素残留量的高效液相色谱检测方法。

本文件适用于土壤中土霉素、四环素和金霉素残留量的测定。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T395农田土壤环境质量监测技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样经Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇溶液提取定容，HLB固相萃取小柱净化，经高效液相色谱仪测定，

外标法定量。

5试剂和材料

5.1除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682中规定的一级水。

5.2乙腈（C2H3N）：色谱纯。

5.3甲醇（CH4O）：色谱纯。

5.4磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H20）。

5.5乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H20）。

5.6柠檬酸（C6H807·H20）。

5.7水合草酸（C2H2O4·2H20）。

5.8磷酸氢二钠溶液（0.4mol/L）：称取143.26g磷酸氢二钠，用水溶解，定容至1000mL。

5.9乙二胺四乙酸二钠溶液（0.1mol/L）：称取37.22g乙二胺四乙酸二钠，用水溶解，定容至1000

mL。

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DB15/T2112—2021

5.10柠檬酸溶液（0.2mol/L）：称取42.03g柠檬酸，用水溶解，定容至1000mL。

5.11磷酸氢二钠-柠檬酸（Mcllvaine）缓冲液（pH=6.8±0.05）：将1000mL0.4mol/L磷酸氢二钠

溶液（5.8）与294mL0.2mol/L柠檬酸溶液（5.10）混匀。

5.12Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液：取Na2EDTA·2H20（5.5）、磷酸氢二钠-柠檬酸（Mcllvaine）缓

冲液（5.11）和甲醇按1+1+2（体积）比例混匀，必要时用NaOH溶液或HCl溶液调节pH=7.20±0.05。

5.13草酸溶液（0.01mol/L）：称取1.26g草酸，用水溶解，定容至1000mL。

5.14甲醇-水（1+19）：量取5mL甲醇与95mL水混匀。

5.15草酸-甲醇溶液（0.01mol/L）：称取1.30g草酸，用甲醇溶解，定容至1000mL。

5.16土霉素（oxytetracycline）标准物质：纯度大于等于96.5%、四环素（tetracycline）标准物

质：纯度大于等于94.2%、金霉素（chlortetracycline）标准物质：纯度大于等于99.5%。

5.17土霉素、四环素、金霉素标准储备溶液（2.00mg/mL）：准确称取一定量的土霉素、四环素、金

霉素标准物质（5.16）于100mL容量瓶中，分别用甲醇溶解定容，于0℃~4℃保存,存储期1个月。

5.18土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液（100μg/mL）：分别取5mL土霉素、四环素、金霉素标

准储备液（5.17）至100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，储存于冰箱0℃~4℃保存,存储期

1个月。

5.19土霉素、四环素、金霉素混合标准溶液使用液（20μg/mL）：吸取土霉素、四环素、金霉素混合

标准溶液（5.18）10mL至50mL容量瓶中，用Na2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液（5.12）稀释至刻度，

混匀，储存于冰箱0℃~4℃保存,存储期1个月。

5.20固相萃取柱（N-乙烯基吡咯烷酮和二乙烯苯的共聚体-HLB或相当者）：60mg/3mL。使用前依次

使用5mL甲醇及5mL水预处理，保持柱体湿润。

5.21针式过滤头：0.22μm（有机相）。

6仪器和设备

6.1超高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。

6.2天平：感量0.01g，0.00001g。

6.3低温冷冻离心机：转速大于3500r/min。

6.4恒温水浴振荡器：振荡频次不小于300r/min。

6.5氮吹仪。

6.6固相萃取装置。

6.7真空泵。

6.8pH计：测量精度±0.02。

6.9容量瓶：玻璃，10mL，50mL，100mL，1000mL。

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DB15/T2112—2021

6.10具塞离心管：50mL。

6.11移液枪：量程20μL，100μL，1000μL。

6.12漩涡混匀仪：振荡频率不小于2800r/min。

6.13样品筛：0.5mm。

7分析步骤

7.1样品采集

土壤样品采集按照NY/T395的规定执行。

7.2样品制备

土壤样品采集后去除杂质，在室温条件下自然风干，粉碎，全部通过0.5mm样品筛（6.13），密封

保存。

7.3提取

称取过筛样品1g~2g（精确至0.01g）于50mL具塞离心管中，加入20mLNa2EDTA-Mcllvaine-

甲醇提取液（5.12），室温振荡20min（6.4），于3500r/min离心10min，取上清液至另一离心管中。

残渣中再依次加入20mL、10mLNa2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液（5.12），重复提取两次，合并上清

液并定容至50mL。

7.4净化

移取上清液5mL于具塞离心管中，置于氮吹仪上，40℃浓缩至原体积的一半左右，加适量水稀释

至体积约5mL，控制流速以1mL/min的速度通过已活化处理的HLB固相萃取柱，用5mL甲醇-水(5.14)淋

洗固相萃取柱，弃去全部流出液。真空抽干10min，用5mL草酸-甲醇（5.15）洗脱液洗脱，收集洗脱

液并在40℃氮吹浓缩至近干，用2.00mLNa2EDTA-Mcllvaine-甲醇提取液（5.12）涡旋溶解残渣，过

0.22μm滤膜（5.21）进行测定。

7.5测定

7.5.1液相色谱仪参考条件

色谱柱：C18色谱柱，柱长250mm，内径4.6mm，粒径5.0μm。

流动相及梯度洗脱条件：见表1。

流速：1.0mL/min。

检测波长：355nm。

柱温：30℃。

进样量：20μL。

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DB15/T2112—2021

表1流动相及梯度洗脱条件

时间流动相[乙腈（5.2）]流动相[0.01mol/L草酸(5.13)]流动相[甲醇(5.3)]

min%%%

0～228848

22～23157015

23～32157015

32～338848

33～358848

7.5.2液相色谱测定

分别移取不同体积20μg/mL混合标准溶液使用液（5.19）于10mL容量瓶中，用Na2EDTA-Mcllvaine-

甲醇提取液（5.12）定容至刻度，逐级稀释配制成0.1μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0

μg/mL和20.0μg/mL的系列标准工作液，进样测定。以色谱峰面积进行外标法定量。标准工作液及试

样液中土霉素、四环素、金霉素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内。试样浓度不在线性范围内时

将样品稀释后进样。标准品液相色谱图参见附录A。

7.5.3空白试验

除不加样品外，其余均按照上述测定步骤进行。

7.5.4定性分析

在仪器最佳工作条件下，按照液相色谱条件测定样品溶液和标准溶液，如果样品溶液中某组分保留

时间与标准溶液的某一组分保留时间相差在±0.5%以内，可认定相同组分。

8结果计算

样品中被测组分的含量Xi，数值用毫克每千克（mg/kg）表示，按式（1）计算，保留2位有效数字：

퐶푖×푓×V×1000

푋푖=……(1)

푚×1000

式中：

Xi—样品中被测组分含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；

Ci—从工作曲线得到的被测组分溶液浓度的数值，单位为微克每毫升（μg/mL）；

f―稀释倍数；

V—样品的稀释液定容体积，单位为毫升（mL）；

m—样品称样量，单位为克（g）。

9精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。

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DB15/T2112—2021

10检出限、定量限和回收率

10.1本方法的检出限：土霉素0.54mg/kg，四环素0.66mg/kg，金霉素0.84mg/kg。

10.2本方法的定量限：土霉素1.61mg/kg，四环素1.99mg/kg，金霉素2.51mg/kg。

10.3土霉素回收率：71.66%~93.93%