DB15∕T 2770-2022 玉米秸秆低温高效降解菌筛选技术规程

ICS65.020.01

CCSB20

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T2770—2022

玉米秸秆低温高效降解菌筛选技术规程

Technicalcodeofpracticeforscreeningoflowtemperature

toleranceandhigheffectivecornstrawdegradationmicroorganism

2022-08-30发布2022-09-30实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

DB15/T2770—2022

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：内蒙古农业大学。

本文件主要起草人：高聚林、韩升才、于晓芳、青格尔、闹干朝鲁、胡树平、王富贵、包海柱、王

志刚、孙继颖、马达灵、屈佳伟、苏治军、李懿璞、刘剑、张赛楠、张鑫、欧阳一、吴胜。

I

DB15/T2770—2022

玉米秸秆低温高效降解菌筛选技术规程

1范围

本文件规定了农田低温高效秸秆降解菌的样本采集，菌株分离纯化，菌株性能测定。

本文件适用于在4℃～15℃条件下玉米秸秆降解微生物的筛选。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T23874饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法

GB/T35808林业生物质原料分析方法纤维素酶活性测定

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

纤维素酶cellulase

催化纤维素水解生成葡萄糖和低聚合度纤维的一组酶的总称，包括葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和

纤维二糖酶3个主要组分。

木聚糖酶xylanase

木聚糖水解酶系是一类降解木聚糖的酶系，包括β-1,4-内切木聚糖酶、β-木糖苷酶、α-L-阿拉

伯糖苷酶、α-D-葡糖苷酸酶、乙酰基木聚糖酶和酚酸酯酶，可降解自然界中大量存在的木聚糖类半纤

维素。

木质素过氧化物酶ligninperoxidase

木质素的生物降解过程中的主要木质素降解酶类。可在木素聚合物内形成自由基。导致键稳定变差

从而破坏木质素大分子。

锰过氧化物酶manganeseperoxidase

1

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一种含亚铁血红素的过氧化物酶，属于木质素降解酶类，能有效的降解木质素。

漆酶laccase

一种含四个铜离子的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶，以单体糖蛋白的形式存在。

吸光值opticaldensity

光通过被检测物，前后的能量差异即是被检测物吸收掉的能量，特定波长下，同一种被检测物的浓

度与被吸收的能量成定量关系。被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用OD值

表示，1OD=log10（1/trans），其中trans为检测物的透光率T值。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

ABTS：2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-

sulphonate）

CMC：羧甲基纤维素（carboxymethylcellulose）

5筛选流程

样本采集

5.1.1来源土壤样本采集

选取玉米成熟后收获前的根际土和玉米秸秆，将根际土浸泡在无菌水中进行系列梯度稀释，震荡悬

浮后静置5小时以上，取上清。

5.1.2来源玉米秸秆样本采集

将玉米秸秆磨碎过60目筛子，将筛下的粉末用无菌水进行梯度稀释。震荡后静止2小时以上取上清。

菌株分离纯化

5.2.1唯一碳源筛选培养

选取5.1.1和5.1.2制备的108CFU/mL的上清液100µL，分别涂布到以碱性木质素和羧甲基纤维素为

唯一碳源的选择培养基上见附录A，25℃培养一周。挑取不同菌落颜色和形态的单菌落进行培养。所用

相关的仪器设备参照附录A，实验材料参照附录A。

5.2.2菌株纯化

选择获得单菌落之后，转移到新的LB培养基中进行纯培养，之后在25%的甘油中-80℃条件下保存备

用。

菌株性能测定

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5.3.1菌株秸秆室内效果的测定

将选取的单菌落采用LB培养基培养至OD600=0.8，离心去上清，用蒸馏水将菌体清洗3次，获得菌悬

液。取烘干的2g秸秆放入50mL经0.22μm的滤膜进行过滤的土壤悬浮液中，然后加入上述调整好的菌液

108CFU/mL100µL。将秸秆和菌的混合物放置在15℃条件下放置2周，然后将降解后的秸秆取出放置在80℃

中48h烘干，之后测定秸秆的失重率。

5.3.2酶活性测定

选取秸秆降解能力最强的菌株进行木质纤维素酶酶活的测定。测定方法按附录B执行。按照表1的筛

选指标选取具的酶活和降解率高的指标。

表1玉米秸秆降解菌筛选指标

项目数值范围

CMC酶活性（U/L）≥90

木聚糖酶活性（U/L）≥80

木质素过氧化物酶活性（U/L）≥80

锰过氧化物酶活性（U/L）≥390

漆酶活性（U/L）≥100

秸秆失重率（14天）≥30%

5.3.3耐低温性测定

将5.3.2筛选出的候选菌株培养液108CFU/mL按照千分之一体积接种到LB培养基中，分别放置到4℃

150rpm培养7天，选取OD600≥0.1（4℃）。

田间促腐效果测定

将上述步骤选出的低温高效秸秆降解菌发酵后等比例混合，组成复合菌制成菌剂。玉米收获后，田

间开沟30cm深，放入装有50g长度为5cm的秸秆块的网袋，然后按照秸秆：菌剂=1000:2（w:w）的比例将

制备好的菌剂(活菌数为108CFU/g)均匀撒施到秸秆块的表面，然后覆土期间保持土壤含水量（20-30%）。

每隔30天取出5袋秸秆测量其失重率，木质纤维素的组成以及秸秆的破碎率和硬度，参照附录A的测定方

法。

3

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A

A

附录A

（资料性）

低温高效秸秆降解菌的分离及其田间效果分析方法

A.1仪器设备

洁净工作台、高速冷冻台式离心机、紫外可见分光光度计、电热恒温水浴锅、恒温震荡培养箱、移

液器、磁力搅拌器、恒温干燥箱。

A.2试剂和材料

刚果红、甘油、NaCl、硫酸铵、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、硫酸锰、蛋白胨、羧甲基纤维

素钠、木素、酵母粉、3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂)：称取182.0g酒石酸钾钠,溶解于500mL

蒸馏水中,加热(不超过50℃),于热溶液中依次加入6.3g3,5-二硝基水杨酸、21.0g氢氧化钠、

5.0g苯酚、5.0g无水硫酸钠,搅拌均匀至溶解,冷却后用蒸馏水定容至1000mL,储存于棕色瓶中,

室温保存,7d～10d后使用。

柠檬酸缓冲液：由0.1mol/L的柠檬酸溶液与0.1mol/L的柠檬酸三钠溶液混合配置。①A液：

称取4.2g柠檬酸,用少量蒸馏水溶解并定容至200mL；②B液：称取5.88g柠檬酸三钠,用少量蒸

馏水溶解并定容至200mL。将A液与B液混合，调节pH为4.5，4℃冰箱保存备用；

乙酸-乙酸钠缓冲液：①A液：量取6mL冰醋酸,定容至1000mL；②B液：称取8.2g醋酸钠,

蒸馏水溶解并定容至1000mL。将A、B液混合,调节pH为4.8，低温冷藏备用；

iv1mg/mL葡萄糖标准溶液配置。

v1mg/mL木糖标准溶液配置。

vi100mM丙二酸-丙二酸钠缓冲液：A液：称取1.6604g丙二酸钠，调节pH为4.5，溶于水中

定容至100mL；B液：称取1.0406g丙二酸，溶于水中定容至100mL，将A、B溶液混合，调节pH值

为4.5；

vii0.6mM2，2′-连氮-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）溶液：称取ABTS0.0329

g，溶于水中定容至100mL；

viii10mM硫酸锰溶液：称取硫酸锰0.169g，溶于水中定容至100mL；

ix10mM过氧化氢溶液：移取30％过氧化氢0.102mL，定容至100mL，用前现配；

x200mM酒石酸缓冲液：配制A液：200mM酒石酸；B液200mM酒石酸钠溶液，将两种溶液按比

例混合，调节缓冲液pH值为3.0；

xi40mM黎芦醇：称取黎芦醇0.6728g，定容至100mL。

A.3培养基

CMCNa基本培养基：称取硫酸铵2g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、硫酸锰

0.02g、蛋白胨10g、羧甲基纤维素钠10g，配置1L溶液，121℃、0.12MPa条件下灭菌20min；

木素基本培养基：称取硫酸铵2g、磷酸氢二钾1g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.02

g、蛋白胨10g、木素1g，配置1L溶液，121℃、0.12MPa条件下灭菌20min；

LB培养基：称取蛋白胨10g、酵母粉5g、NaCl10g，配置1L溶液，121℃、0.12MPa条件下

灭菌20min；

产酶培养基:蛋白胨0.5g/L、硫酸铵2.0g/L、磷酸氢二钾1.0g/L、尿素0.6g/L、七水硫酸

镁0.05g/L、七水硫酸锰0.016g/L、七水硫酸锌0.017g/L、氯化钙0.02g/L、氯化钠0.2g/L、无

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菌水1L，121℃、0.12MPa条件下灭菌20min。

玉米秸秆降解培养基：玉米秸秆50g/L(1cm～2cm茎秆)、硫酸铵15g/L、尿素3g/L、

蛋白胨3g/L、氯化钙0.1g/L、七水硫酸镁5g/L、磷酸氢二钾1g/L、氯化钠0.1g/L、七水硫酸

铁0.05g/L、七水硫酸锰0.016g/L、七水硫酸锌0.014g/L、氯化钴0.02g/L、无菌水1L。

A.4秸秆硬度测定方法

经过一定时间埋土之后，将秸秆挖出用自来水清洗干净，采用烘箱80℃烘干48h。将选相对完整

的秸秆，用SY-SO3型茎秆强度测定仪分别测定玉米茎秆的穿刺强度，3次重复，取平均值。

A.5秸秆各主要组分含量的测定

用vosant洗涤法将根系烘干粉粹后过1mm筛，按照纤维素分析仪（ANKOMA200i）的方法测定木质素、

纤维素、半纤维素的含量。

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B

B

附录B

（规范性）

低温高效秸秆降解菌木质纤维素酶活测定方法

B.1CMC酶活性测定

按照国标GB/T35808规范执行。

B.2木聚糖酶活性测定方法

按照国标GB/T23874规范执行。

B.3木质素过氧化物酶活性测定

B.3.1操作步骤

准确移取200mM酒石酸缓冲液0.5mL于容积为1.4mL的比色皿中，加入40mM黎芦醇0.1mL。准确

加入待测酶50μL、蒸馏水350μL。在30℃条件下水浴10min，加入浓度为20mM过氧化氢溶液0.01

mL启动反应，使用分光光度计迅速测定310nm处的吸光度，1min后再测定1次，计算二者之差，即为每

分钟的吸光度变化（OD310变化）。

B.3.2酶活计算公式

木质素过氧化物酶酶活=OD310变化/9.3×1.01×106/X（U/L）

X─待测酶液体积：50μL；木素过氧化物酶催化黎芦醇后形成产物在310nm下的摩尔吸光系数为

9300mol-1·L·cm-1。

B.4锰过氧化物酶活性测定

B.4.1操作步骤

准确移取100mM丙二酸-丙二酸钠缓冲液0.5mL于容积为1.4mL的比色皿中，加入10mM硫酸锰

溶液0.1mL。准确加入待测酶液50μL，加入蒸馏水350μL。在30℃条件下水浴10m