生物制药生产工艺流程考核试卷及答案

生物制药生产工艺流程考核试卷及答案一、单项选择题（每题2分，共20分）1.以下哪种方法是生物制药中常用的菌种保藏方法，可长期保持菌种活性且变异率低？A.斜面低温保藏法（4℃）B.甘油冷冻保藏法（20℃）C.液氮超低温保藏法（196℃）D.沙土管保藏法2.发酵培养基中添加的“消泡剂”主要作用是：A.调节pH值B.抑制杂菌生长C.降低泡沫表面张力，防止溢出D.提供碳源3.高压蒸汽灭菌的标准条件是：A.100℃，30分钟B.115℃，15分钟C.121℃，1520分钟D.135℃，5分钟4.以下哪种分离技术基于分子大小差异实现目标产物纯化？A.离子交换色谱B.凝胶过滤色谱（分子筛）C.亲和色谱D.疏水相互作用色谱5.单克隆抗体制备过程中，杂交瘤细胞的筛选通常使用：A.HAT培养基B.高糖培养基C.LB培养基D.麦康凯培养基6.病毒类疫苗生产中，“灭活”步骤的核心目的是：A.提高病毒感染力B.破坏病毒核酸或蛋白质，消除致病性但保留抗原性C.增加病毒数量D.促进病毒变异7.生物反应器中“溶氧（DO）”的控制通常通过调节以下哪项参数实现？A.搅拌转速与通气量B.培养基pHC.接种量D.发酵温度8.基因工程药物生产中，“包涵体”的形成主要是由于：A.目标蛋白在原核表达系统中过度表达导致折叠错误B.培养基营养不足C.发酵温度过高D.杂菌污染9.以下哪种制剂工艺属于“无菌制剂”范畴？A.片剂压片B.冻干粉针剂分装C.颗粒剂干燥D.胶囊填充10.生物制品质量控制中，“内毒素检测”常用的方法是：A.兔热原试验B.鲎试剂法（LAL法）C.无菌检查法D.效价测定法二、填空题（每空1分，共20分）1.生物制药上游工艺的核心环节包括菌种选育与保藏、培养基制备、__________和发酵过程控制。2.发酵罐的关键参数监测通常包括温度、pH、溶氧（DO）、__________（至少2项）。3.离心分离技术中，“差速离心”主要用于分离__________不同的颗粒，而“密度梯度离心”则基于__________差异实现分离。4.单克隆抗体制备的“细胞融合”步骤中，常用的促融剂是__________（化学法）或__________（物理法）。5.病毒类疫苗生产中，“收获”病毒的方式取决于病毒的增殖特性：若病毒以出芽方式释放，需收集__________；若病毒裂解宿主细胞释放，需收集__________。6.基因工程药物的下游纯化工艺通常包括粗纯（如离心、过滤）、中间纯化（如__________）和精纯化（如__________）三个阶段。7.无菌制剂生产中，“A级洁净区”要求空气洁净度达到ISO__________级标准，需采用__________（如层流罩）维持环境。8.生物制品稳定性试验包括加速稳定性试验（通常条件为__________）和长期稳定性试验（通常条件为__________）。9.发酵染菌的常见原因包括培养基灭菌不彻底、__________（至少2项）。三、简答题（每题8分，共40分）1.简述生物制药中“种子扩大培养”的目的及关键控制要点。2.比较“分批发酵”“补料分批发酵”和“连续发酵”的优缺点，并说明各自适用场景。3.以重组人胰岛素生产为例，简述从工程菌发酵到最终制剂成型的主要工艺流程。4.列举三种常用的蛋白质纯化技术（需说明原理），并分析其在不同纯化阶段的应用。5.阐述生物制药生产中“无菌保证”的核心策略（至少包括设备、工艺、环境三方面）。四、综合分析题（20分）某生物制药企业生产重组人粒细胞刺激因子（rhGCSF），发酵过程中出现以下异常现象：发酵24小时后，溶氧（DO）从40%骤降至10%，且持续无法回升；发酵液pH从7.0快速上升至8.5；菌体密度（OD600）仅为正常批次的50%。请结合生物制药生产知识，分析可能的原因（至少4项），并提出对应的解决措施。答案一、单项选择题1.C（液氮超低温保藏法可长期保藏，变异率低）2.C（消泡剂降低泡沫表面张力）3.C（标准条件为121℃，1520分钟）4.B（凝胶过滤基于分子大小）5.A（HAT培养基筛选杂交瘤细胞）6.B（灭活保留抗原性，消除致病性）7.A（搅拌转速与通气量调节溶氧）8.A（原核表达系统中蛋白折叠错误形成包涵体）9.B（冻干粉针剂需无菌分装）10.B（鲎试剂法检测内毒素）二、填空题1.种子扩大培养2.搅拌转速、罐压、尾气CO₂浓度（任意2项）3.沉降速度；密度4.PEG（聚乙二醇）；电融合5.细胞培养液；细胞裂解液6.离子交换色谱；亲和色谱（或反相色谱）7.5；单向流装置8.40℃±2℃，相对湿度75%±5%；25℃±2℃，相对湿度60%±10%9.接种操作污染、设备泄漏、空气过滤失效（任意2项）三、简答题1.目的：为发酵罐提供数量充足、生理状态一致的高活性种子，缩短发酵延迟期，提高生产效率。关键控制要点：①培养基成分与种子培养基匹配，确保菌体快速增殖；②控制培养温度、pH、溶氧等参数（如好氧菌需维持DO≥30%）；③严格监控种龄（对数生长期中期最佳）；④无菌操作，避免杂菌污染；⑤定期检测种子活力（如镜检、生长曲线分析）。2.分批发酵：一次性投料和收获，操作简单但生产效率低，适用于产物在稳定期积累的品种（如抗生素）。补料分批发酵：间歇补加营养，延长对数期，提高产量，适用于需控制碳源浓度（如避免葡萄糖效应）或产物诱导表达的场景（如重组蛋白）。连续发酵：连续进料和出料，生产效率高但染菌风险大、产物浓度低，适用于代谢产物稳定、需长期运行的工艺（如乙醇发酵）。3.工艺流程：①工程菌活化：从甘油管中复苏重组大肠杆菌，接种至摇瓶种子培养基（LB+抗生素），37℃振荡培养至对数期；②种子扩大培养：将摇瓶种子接种至一级种子罐（50L），培养至OD600=58，再转种至二级种子罐（500L），扩大培养至OD600=1015；③发酵培养：接种至生产罐（5000L），采用补料分批模式，控制温度37℃、pH7.0、DO≥30%，诱导期（OD600=50时）加入IPTG诱导重组胰岛素原表达；④菌体收集：发酵结束后离心（8000rpm，20分钟）收集菌体，高压匀浆破碎（1000bar，3次）释放包涵体；⑤包涵体纯化：洗涤（含TritonX100的缓冲液）去除杂蛋白，溶解（8M尿素+还原剂）后稀释复性（氧化还原缓冲液），形成正确二硫键；⑥酶切与纯化：用胰蛋白酶切割胰岛素原，获得胰岛素A链和B链，通过离子交换色谱（QSepharose）和反相色谱（C18柱）去除杂质；⑦制剂成型：纯化后胰岛素经0.22μm滤膜无菌过滤，加入锌离子（形成六聚体）和防腐剂（如苯酚），分装至西林瓶，冻干或液体灌装，轧盖后灯检、贴标。4.三种技术及应用：①离子交换色谱（IEC）：基于蛋白质表面电荷差异，通过阴阳离子交换树脂吸附目标蛋白。常用于中间纯化阶段（去除带相反电荷的杂蛋白）。②亲和色谱（AC）：利用目标蛋白与配基（如抗体、金属离子）的特异性结合，如HisTag蛋白用NiNTA树脂。适用于精纯化阶段（纯度可达95%以上）。③疏水相互作用色谱（HIC）：基于蛋白质表面疏水性差异，高盐条件下吸附，低盐洗脱。常用于粗纯后去除部分杂蛋白（如宿主蛋白）。5.无菌保证策略：①设备：采用蒸汽灭菌（SIP）或干热灭菌（如灌装机），关键设备（如发酵罐、配液罐）需验证灭菌效果（生物指示剂挑战试验）；②工艺：无菌制剂采用“最终灭菌”（如湿热灭菌）或“无菌生产工艺”（如冻干制剂的无菌分装），关键步骤（如过滤、灌装）在A级洁净区完成；③环境：生产区划分洁净级别（B级背景+A级操作区），定期监测浮游菌、沉降菌、表面微生物（如每4小时检测一次）；人员需穿无菌服（连体衣、手套、口罩），限制进出次数；④物料：原辅料、包装材料（如西林瓶）需经灭菌（如干热灭菌180℃×2小时）或除菌过滤（0.22μm滤膜），进入洁净区前需消毒（如75%乙醇擦拭）。四、综合分析题可能原因及解决措施：1.染菌污染：杂菌大量繁殖消耗氧气（DO下降），代谢产碱（pH上升），抑制工程菌生长（OD600低）。解决：立即停止发酵，取样镜检（革兰氏染色）或PCR检测杂菌种类；清理发酵罐，用NaOH溶液浸泡灭菌；排查污染来源（如空气过滤器失效、接种口泄漏）。2.培养基成分异常：碳源不足（如葡萄糖耗尽）导致工程菌代谢转向分解蛋白质（产氨，pH上升），同时呼吸强度下降（DO骤降）。解决：检测发酵液残糖（如DNS法），若残糖＜0.5g/L，补加葡萄糖溶液（需灭菌后补料）；优化培养基配方（如提高初始葡萄糖浓度或调整补料速率）。3.溶氧控制失效：搅拌电机故障（转速下降）或通气量不足（空气压缩机停机），导致供氧不足，工程菌缺氧死亡（OD600低），同时死菌自溶释放碱性物质（pH上升）。解决：检查搅拌电机电流、转速传感器；确认空气流量计读数，重启压缩机或切换备用气源；后续定期维护设备（如搅拌轴密封、空气过滤器更换）。4.工程菌退化：长期传代导致菌种代谢能力下降（如呼吸链酶活性降低），无法有效利用碳源（DO下降），同时代谢副产物（如氨）积累（pH上升）