基因编辑技术原理与应用

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g基因编辑•基因编辑技术是一种对细胞内基因组上DNA序列进行改造的技术。•原理：通过特异的内切酶复合体，精确识别

细胞内DNA片段中靶点的核苷酸序列

，在预定的位置切割DNA，切断的DNA被细胞内的DNA修复系统的精确编辑

(基因编辑---修正，

删除

，插入)从而达到定点改造基因的目的。基

因

编

辑

技

术•自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链断裂(double-strandbreak,DSB),即非同源末端连接(Nonhomologous

end

joining,NHEJ)和同源重组(homologous

recombination,HR)。基因编辑热度变化趋势200720112005200920132015CRISPR/Cas9(成簇的规律性间隔的短回文重复序列)，2013年TALEN(转录激活样效应因子核酸酶)，2011年ZFN第

二

代(锌指核酸酶)，1996年第

一

代第

三

代基因编辑的三大利

器DNA识别域：由一系列Cys2-His2锌指蛋白(zinc-fingers)串联组成，每个锌指大约由30Aa组成，形成了一种保守的ββɑ

结构。在锌指ɑ螺旋结构表面的那几个氨基酸能够与DNA大沟

上的3个碱基结合。核酸内切酶：FokI，形成二聚体

时切割双链DNA第一代技术:

锌指核酸酶TALE蛋白中的DNA结合结构域是由一连串33~35Aa的重复结构域组成的，其中每一个结构域都能够识别一个碱基对。TALE核酸酶的DNA结合特异性主要由两个高度可变的氨基酸决定。TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的Fok

I临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。第二代技术：TALE

N技术•CRISPR-CAS系统的组成主要包括:由不连续的重复序列R(repeat)与长度相似的间区序列S(spacers)间隔排列而成的CRISPR簇，前导序列L(leader)以

及一系列CRISPR相关蛋白基因cas。Cas蛋白是一种双链DNA核酸酶，能在guide

RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体

才能发挥作用。第三代技术：CRISPR/Cas9CRISPR-Cas9

=

DNA识别域

+DNA识别域：向导RNA，CRISPR

RNA(crRNA)RNA

(transactingtracrRNA)。crRNA补结合，另一端与tracrRNA核酸内切酶由两部分组成：和反式作用CRISPRCRISPR

RNA,一端与靶标核苷酸互互补结合。Cas9CRISPR/Cas原理核酸内切酶：

Cas9核酸内切酶。CRISPR/Cas的作用机理

(分为三个阶段来理解)：PhaseⅢPhase

ⅠPhaseⅡ最主要的要求：PAM(protospacer-adjacent

motif)为NGG。在人类基因组中，平均每8bp就出现一个NGG

PAM。CRISPR/Cas

9系统靶向要求三种不同技术的比较2.

不能精确控制外源基因插入位点3.

对靶基因抑制不彻底、不特异4.

难以稳定的遗传5.

费时费力费钱，难以大量应用并引起转基因技术：

T-DNA插入RNA干扰技术：

dsRNA

、Artificial

miRNA核外遗传技术：

质粒、人工染色体其

它

基

因

操

作

的

优

劣同源重组技术：

e.g.

传统的基因敲除小鼠基因突变技术：物理诱变、化学诱变

…一系列生物伦理的问题

…1.

无法控制突变位点基因治疗基因功能研究改造和培育新品种基因编辑新技术的用途免疫细胞表面的CCR5蛋白是HIV进入免疫细胞的“入口”。而少数北欧人由于CCR5基因“变异”

(来源于原始高加索人)，具备天然的HIV抵抗力。基因编辑技术首次应用于临床。目前SangamoBioSciences基于ZFNs技术治疗艾滋病的方法已经进入临床II期试验。2014年3月12日，宾夕法尼亚大学PabloTebas教授团队利用SangamoBioSciences开发的ZFNs基因编辑技术，显著提高了艾滋病患者对艾滋病毒的抵抗能力。ZFNs技术治疗艾滋病婴儿白血病治疗2015年，美国科学家利用经TALENs基因编辑技术改造的细胞株，成功缓解了Layla的不治之症--急性淋巴细胞性白血病(ALL)

，造就了世界首例婴儿白血病治疗奇迹，是基因编辑技术有史以来第二次被运用在人体上技术。修改捐赠细胞使其抗癌：蕾拉的生命获救得益于基因工程修改过的血液细胞。美国科学家对血液细胞进行了三次修改。科学家们首先在捐赠的血液细胞中添加抗白血病基因，其次科学家使用TALENs技术关闭两个基因，关闭第一个基因是为了确保捐赠的细胞不被蕾拉的身体排斥，关闭第二个基因是为了确保捐赠细胞不被治疗药物杀死。Editas宣布的2017年人体实验激动人心之处在于，

这有可能是首次体内(in

vivo)

基因编辑试验

。

这项研究成功的意义在于，

将CRISPR基因编辑

“工具”装载到病毒体内，

再把病毒注射到患处，

CRISPR可以自行对患病

部位进行基因改造。2015年

，CRISPR基因编辑技术可以用于治疗利伯先天性黑朦病

(Lebercongenital

amaurosis，

一种遗传性视力衰退疾病)

，

Editas将在2017年开展

CRISPR基因编辑人体实验。“恢复”受损基因，治疗利伯先天性黑朦病Katrine