TFDSA-外泌体提取与纯化工艺规范

Q/LB.□XXXXX-XXXXT/FDSAXXXX—202X目次TOC\o"1-1"\h\t"标准文件_一级条标题,2,标准文件_附录一级条标题,2,"20384前言 II102751范围 1189192规范性引用文件 1275543术语、定义和缩略语 1154814一般要求 1239254.1实验室及生产环境 1299114.2人员资格 1201244.3原材料与试剂 2298844.4生物安全与处置 2282885系统结构与功能 2270035.1外泌体制备系统组成 2311445.2系统功能要求 2225176技术要求 266606.1外泌体基本属性要求 2247426.2提取与纯化性能要求 2151686.3工艺过程要求 3248717试验方法 3191408质量控制 3180828.1批次一致性验证 322608.2稳定性验证 316655附录A（资料性）外泌体提取与纯化流程 417716附录B（规范性）外泌体提取方法比较表 5前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容有可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由中国食品药品企业质量安全促进会提出并归口。本文件起草单位：本文件主要起草人：外泌体提取与纯化工艺规范范围本文件规定了外泌体提取与纯化过程中的一般要求、系统结构与功能、技术要求、试验方法、质量控制。本文件适用于来源于细胞培养上清液、体液（如血清、尿液、乳汁）等样本的外泌体提取与纯化，适用于科研、临床前研究及产业化生产。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T5009.5食品安全国家标准食品中蛋白质的测定GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求GB/T38482动物源性I型胶原蛋白成分测定聚丙烯酰胺凝胶电泳法GB/T39729细胞纯度测定通用要求流式细胞测定法GB/T39730细胞计数通用要求流式细胞测定法GB/T42076.1生物技术细胞计数第1部分：细胞计数方法通则《中华人民共和国药典（2025年版）》（以下简称《药典》）术语、定义和缩略语GB/T39729、GB/T39730、GB/T42076.1界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1超速离心法exosomeultracentrifugationmethod利用不同组分的沉降速率差异，在高速离心力作用下实现外泌体分离的技术。3.2纳米颗粒跟踪分析nanoparticletrackinganalysis（NTA）通过追踪溶液中纳米颗粒布朗运动轨迹，测定颗粒粒径分布与浓度的技术。4一般要求4.1实验室及生产环境4.1.1实验室/生产场地应满足所在地生物安全管理要求，具备样品前处理、分离纯化、质控检测三大功能区，并实现适当的人员与流程分隔以降低交叉污染风险。4.1.2关键设备（超速离心机、超滤装置、液相色谱/尺寸排阻色谱设备、免疫亲和柱、纳米颗粒跟踪分析仪NTA、透射电镜TEM或冷冻电镜Cryo-EM、Westernblot/流式细胞仪等）应建立校准与维护制度，校准周期及合格判定依据应记录并可追溯。4.2人员资格操作人员应经过外泌体生物学、无菌操作、仪器操作、安全与质量体系培训，并具备独立正确操作的能力。4.3原材料与试剂4.3.1原材料（细胞系、培养基、血清/血浆样品等）应有来源可追溯性，细胞系应通过细胞鉴定与无支原体检测；若使用血清，应说明是否去除外泌体并记录批次证书。4.3.2使用的缓冲液、酶和试剂应符合实验室/产业质量要求，关键缓冲液应标注制备配方、pH、渗透压和保存条件。4.4生物安全与处置样品废弃物应按生物危害废弃物管理要求处置，关键步骤应有明确处置流程和记录。5系统结构与功能5.1外泌体制备系统组成外泌体制备系统由表1模块组成。表1制备系统模块组成模块名称功能描述样本前处理模块去除细胞、大颗粒杂质，获得澄清液体样本提取模块采用差速离心、超滤、沉淀或免疫亲和等方法提取外泌体纯化模块通过密度梯度离心、SEC、TFF等方式进一步纯化浓缩与换液模块使用超滤或TFF技术进行缓冲液置换与浓缩质量控制模块对外泌体进行粒径、浓度、纯度、标志物等检测5.2系统功能要求外泌体制备系统功能应包括下列要求。a）支持多种样本类型（细胞上清、血清、尿液等）处理。b）实现外泌体的高效提取（回收率≥60%）与高纯度（杂蛋白去除率≥80%）。c）具备可扩展性，支持从实验室小试（10mL）到中试（1L～10L）规模。d）所有接触样本的部件应为生物相容性材料，符合USPClassVI标准。6技术要求6.1外泌体基本属性要求外泌体基本属性要求应符合表2规定。表2基本属性要求项目要求检测方法粒径范围30nm～150nmNTA(GB/T38482)浓度误差≤±10%NTA或FCM形态典型杯托状双层膜结构TEM（透射电镜）表面标志物CD9、CD63、CD81阳性表达WesternBlot或流式细胞术杂蛋白残留≤10%BCA法测总蛋白，计算杂蛋白比例6.2提取与纯化性能要求外泌体提取与纯化性能要求应符合表3规定。表3性能要求项目要求外泌体回收率≥60%（以NTA检测初始与终浓度计算）杂蛋白去除率≥80%内毒素含量≤0.25EU/mL（符合《药典》要求）微生物限度无菌（符合《药典》无菌检查法）病毒污染不得检出（qPCR法检测HIV、HBV、HCV等）6.3工艺过程要求提取与纯化工艺流程图见附录A，过程应符合下列要求。a）所有操作应在符合GB19489的生物安全二级（BSL-2）实验室进行。b）样本处理应在采集后4h内完成，或于4℃保存不超过24h。c）提取与纯化过程应在4℃条件下进行，避免外泌体降解。d）使用缓冲液应符合GB/T6682一级水标准，pH7.2～7.4，渗透压280mOsm/kg～320mOsm/kg。7试验方法外泌体提取与纯化性试验方法应符合表4规定。表4试验方法技术指标项目对应试验方法名称方法来源粒径范围纳米颗粒跟踪分析（NTA）GB/T38482浓度误差NTA或流式细胞术（FCM）GB/T39730、GB/T42076.1形态透射电子显微镜（TEM）常规TEM方法（参考《药典》）表面标志物WesternBlot或流式细胞术《药典》、WB常规法杂蛋白残留BCA法（总蛋白定量）GB/T5009.5外泌体回收率浓度比对法（NTA前后对比）GB/T38482（NTA方法）杂蛋白去除率BCA法（蛋白定量）GB/T5009.5内毒素含量鲎试剂凝胶法《药典》微生物限度无菌检查法（薄膜过滤法或直接接种法）《药典》无菌检查法病毒污染（HIV/HBV/HCV）qPCR法检测病毒核酸《药典》或参照ICH指南8质量控制8.1批次一致性验证每批次外泌体制品应进行以下检测并记录。a）粒径主峰偏移≤10nm。b）浓度CV≤10%。c）标志物表达一致性（WB条带灰度差异≤15%）。8.2稳定性验证稳定性验证应按照下列要求执行。a）储存条件：-80℃、-20℃、4℃，分别于0、7、14、30天取样检测。b）评价指标：粒径变化≤10%，浓度下降≤20%，标志物表达无明显减弱。

附录A

（资料性）

外泌体提取与纯化流程A.1外泌体提取与纯化流程示意图外泌体提取与纯化流程示意图见图A.1。图A.1外泌体提取与纯化流程示意图附录B

（规范性）

外泌体提取方法比较表B.1外泌体提取方法比较表外泌体提取方法比较参照表B.1的规定执行。