DB34∕T 4950-2024 禽白血病-通 用∕A∕J三重PCR检测技术规程

ICS11.220

CCSB41

34

安徽省地方标准

DB34/T4950—2024

禽白血病—通用/A/J三重PCR检测

技术规程

Technicalregulationforgeneric/A/JtriplePCRdetectionforavianleukemia

2024-09-14发布2024-10-14实施

安徽省市场监督管理局发布

DB34/T4950—2024

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定

起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由安徽省动物疫病预防与控制中心提出。

本文件由安徽省农业农村厅归口。

本文件起草单位：安徽省动物疫病预防与控制中心、安徽农业大学动物科技学院、滁州市动物疫病

预防与控制中心、宣城市动物防疫站、宁国市动物卫生监督所。

本文件主要起草人：沈艳、江定丰、郑举、季晶晶、王立、陈芳芳、何长生、程帮照、王维、范亚

楠、王倩、王军、苗文萍、段倩倩、刘畅、陆平、陈曦、周迎春、刘华、陈静、朱良强、伍唯。

I

DB34/T4950—2024

禽白血病-通用/A/J三重PCR检测技术规程

1范围

本文件规定了禽白血病-通用/A/J三重PCR检测方法的主要仪器设备、试剂、引物、反应条件、试验

步骤、结果判定。

本文件适用于禽白血病病毒、A亚群和J亚群的三重PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

Bp：碱基对（basepair）

DNA：脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid)

DEPC：焦炭酸二乙酯（diethypyrocarbonate）

PBS：磷酸盐缓冲盐水（phosphatebufferedsaline）

ALV：禽白血病病毒（avianleukemiavirus）

RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

RT-PCR；反转录聚合酶链反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）

5主要试剂

本文件所用试剂均为分析纯，所用水应符合GB/T6682中一级水的规格，所有试剂均用无RNase

污染的容器分装。

商品化的RNA提取裂解液。

PBS液，按照附录A.1配制。

TRIzolRNA提取试剂或其他商品化的基因组RNA提取试剂盒。

氯仿。

异丙醇（-20℃预冷）。

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DEPC水：在100mL三蒸水中加入100μLDEPC，18℃～22℃室温下过夜，121℃灭菌15min。也

可用商品化的产品。

75％乙醇：75mL无水乙醇加25mLDEPC水，配置成75％乙醇溶液，-20℃遇冷备用。

商品化的反转录试剂盒。

2×FastTaqpremix：商品化试剂盒。

50×TAE电泳缓冲液，见附录A.2。

1.5％琼脂糖凝胶，见附录A.3。

DNA分子量标准：DL2000Marker,商品化试剂

电泳上样缓冲液：100mL溶液中含0.25g溴酚蓝及40g蔗糖。

引物，引物对序列见附录B.1，加DEPC水制成100μmol/L的储存浓度和10μmol/L的工作浓

度。

阴性对照，健康鸡血液或者组织提取的DNA/RNA。

阳性对照，为A和J亚群禽白血病病毒基因组DNA/RNA。

6仪器和设备

PCR仪。

台式高速冷冻离心机（4℃，离心速度12000r/min以上）。

稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。

凝胶成像系统。

可调微量移液器（规格100μL～1000μL、20μL～200μL、1μL～20μL）以及无RNase污染带

滤芯吸头。

组织研磨器。

7样品的采集、运输与保存

按照NY/T541的规定执行。

8实验步骤

样本制备

8.1.1全血、血浆或精液

直接使用。

8.1.2组织样本

取待检组织样本于灭菌的组织研磨中，按质量体积比1：1加入灭菌PBS，充分研磨，制备组织匀

浆，4℃，3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，对样本进行编号。

RNA的提取

8.2.1取灭菌的1.5mL无RNA酶的离心管，编号。

8.2.2TRIzol试剂提取待检样品、阴性对照及阳性对照样品的RNA。

8.2.3100μL8.1中的制备样本，900μLTRIzol置入1.5mL无RNA酶的离心管，振荡5次至10次，

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DB34/T4950—2024

静置5min。

8.2.4加入200μL氯仿，振荡混匀，室温放置5min，4℃12000r/min，离心15min。

8.2.5吸取上层水相至一新的1.5mL无RNA酶的离心管中，加入等体积异丙醇（－20℃预冷），混

匀，室温放置5min，4℃12000r/min，离心15min。

8.2.6弃去上清，加入1mL75％乙醇（DEPC水配制），缓慢颠倒以漂洗沉淀及管壁，4℃12000r/min，

离心15min。

8.2.7倒去上清，加入置室温条件下干燥后，加适量（通常为20μL～30μL）DEPC水溶解。

8.2.8提取的RNA应尽快进行RT-PCR扩增。若需长期保存，应放置－70℃冰箱。

8.2.9也可以采用质量相当的商品化基因组RNA提取试剂盒进行待检样品、阴性和阳性对照样品的RNA

提取，按照试剂盒说明书进行操作。

反转录（RT）

参照反转录试剂盒说明操作。

PCR扩增

将表1中的试剂充分混匀，4000r/min离心30s。

PCR的反应条件：98℃预变性10s、95℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s、35个循

环，72℃终延伸8min扩增反应结束后，进行扩增产物的琼脂糖凝胶电泳。

表1PCR反应体系（总体积为20μL）

体积

组分

/μL

2×FastTaqpremix10.0

ALV-pol-F（10μmol/L）1.0

ALV-pol-R（10μmol/L）1.0

ALV-A-F（10μmol/L）1.5

ALV-A-R（10μmol/L）1.5

ALV-J-F（10μmol/L）0.5

ALV-J-R（10μmol/L）0.5

模板1.0

DEPC水3.0

总量20.0

琼脂糖凝胶电泳

制备1.5％的琼脂糖凝胶板（参见附录A.3），取5.0μLPCR产物和1.0μL电泳上样缓冲液混

合后，分别加样到凝胶孔中。100V恒压下电泳15～20min，在凝胶成像系统上观察并拍照记录。

9结果判定

试验成立条件：阳性对照在338bp、274bp、145bp位置同时出现特异性扩增条带；阴性对照无任

何特异扩增条带。

3

DB34/T4950—2024

被检样本338bp、274bp、145bp位置同时出现特异性扩增条带，判定ALV核酸阳性、ALV-A、ALV-

J亚群核酸阳性。

被检样本338bp、145bp位置同时出现特异性扩增条带，判定ALV核酸阳性、ALV-A亚群核酸阳性。

被检样本274bp、145bp位置同时出现特异性扩增条带，判定ALV核酸阳性、ALV-J亚群核酸阳性。

被检样本仅145bp位置出现特异性扩增条带，判定ALV核酸阳性。

被检样本无特异性扩增条带，判定ALV阴性。

注：必要时，可取RT-PCR扩增产物进行序列测定，并与已公开发表的ALV特异性片段进行同源性比对分析，以确证检

测结果。

4

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附录A

（规范性）

相关试剂配制

A.1PBS缓冲液

灭菌双蒸水800mL

NaCl8g

KCl0.2g

Na2HPO41.44g

KH2PO40.24g

用HCl调节溶液的pH值至7.4，加灭菌双蒸水定容至1L，在121℃高压下蒸汽灭菌20min，

保存于室温。

A.250×TAE电泳缓冲液

A.2.10.5mo1/L乙二铵四乙酸二钠(EDTA)溶液（pH8.0）

乙二铵四乙酸二钠溶液18.6g

灭菌双蒸水80mL

氢氧化钠调pH至8.0

灭菌双蒸水加至100mL

A.2.2TAE电泳缓冲液（50×）

羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g

冰乙酸57.1mL

0.5mo1/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100ml

灭菌双蒸水加至1000mL

用时用灭菌双蒸水稀释使用。

A.31.5％琼脂糖凝胶

琼脂糖粉1.5g

1×TAE电泳缓冲液加至100mL

将琼脂糖粉加入100mLTAE电影缓冲液（1×）中，加热融化。温度降至60℃左右时，加入5μL

核酸染料，均匀铺板，厚度为3mm～5mm。

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附录B

（资料性）

引物

B.1PCR引物

引物信息见表B.1。

表C.1PCR引物信息

引物序列扩增基因片段长度

引物名称扩增基因

（5'-3’）(bp)

ALV-pol-F5'-TACTTGAGCCCTTGCGACTC-3’

pol基因（通用）145

ALV-pol-R5'-ATGGTGAACCCGGCTCTTTC-3’

ALV-A-F5'-TTACATGGGCCAACCGTACA-3’

gp85基因(A亚群)274

ALV-A-R5'-GGTGGCTCATCCCACATAGA-3’

ALV-J-F5'-AGGCCCTATGTCAACCAATCA-3’

gp85基因(J亚群)338

ALV-J-R5'-GCCCTGTCCCCACAAATCAA-3’

6

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附录C

（资料性）

扩增片段参考序列

C.1pol基因（通用）特异性扩增片段（145bp）

TACTTGAGCCCTTGCGACTCAAGC