病理检查常用技术解析

演讲人：日期:病理检查常用技术解析CATALOGUE目录01组织学技术基础02常规染色方法03免疫组化技术应用04分子病理学检测05细胞学检查技术06高级与新兴技术01组织学技术基础样本采集与固定标准规范化取材操作温度与pH控制固定液选择与时效需遵循无菌原则，使用锋利器械切取病变组织，避免挤压或牵拉导致人为假象。典型样本尺寸为1.5×1.5×0.3cm，特殊组织（如神经）需调整厚度至0.1cm。常规采用10%中性缓冲福尔马林，固定液体积应为组织体积的10倍。实体器官固定时间需12-24小时，空腔器官需灌注固定，固定不足会导致自溶，过度固定则影响抗原性。固定环境应保持4℃低温以降低酶活性，pH值严格维持在7.2-7.4之间。针对特殊检测（如电镜）需采用戊二醛-多聚甲醛混合固定液，并控制渗透压在300-310mOsm。梯度脱水程序依次经过70%、80%、95%和100%乙醇脱水，每级停留时间根据组织类型调整（如肝组织2小时/级，脂肪组织需延长至4小时）。二甲苯透明阶段需监控组织透明度变化，通常需要3次更换溶剂。组织处理与包埋流程浸蜡与包埋优化石蜡熔点选择56-58℃，采用真空渗透装置提高蜡液渗透率。包埋时需注意组织定向（如肠管需纵切包埋），包埋模具预冷至-20℃可减少结晶伪影。特殊组织需添加蜂蜡调节硬度。质量控制节点脱水终点检测可采用折光仪（乙醇浓度＞99.5%），蜡块硬度测试需达到邵氏D60标准。每批处理需设置对照组织监测处理效果。使用恒温冷台（-10℃）维持蜡块硬度，切片厚度常规3-5μm（骨髓活检需2μm）。采用一次性刀片，每切50片需更换刀口位置，刀角调整至5°可减少震颤条纹。切片制备与质量控制精密切片技术水浴温度控制在45±1℃，含0.1%明胶的载玻片可提高附着力。梯度烘烤程序（60℃30分钟→80℃15分钟）能有效避免脱片，特殊染色需采用多聚赖氨酸包被玻片。裱片与烘片规范每批次染色需设置阳性对照和阴性对照，HE染色核质比标准为苏木精染色时间5-8分钟（室温22℃）。采用数字化扫描系统进行色度分析，要求胞核OD值≥0.8，胞质OD值≤0.3。染色质控体系02常规染色方法HE染色原理与应用苏木精与伊红的协同作用苏木精作为碱性染料与细胞核内带负电的DNA和RNA结合，呈现蓝紫色；伊红作为酸性染料与细胞质及胞外基质中带正电的蛋白质（如胶原纤维）结合，呈现粉红色。两者结合可清晰区分细胞核与胞质结构。组织学诊断的核心技术广泛应用于病理活检、手术标本及教学切片中，如肿瘤良恶性鉴别、炎症分级和器官组织结构观察，是病理诊断的“金标准”。标准化操作流程包括脱蜡、水化、苏木精染色、分化、返蓝、伊红染色、脱水及封固等步骤，需严格控制染色时间（苏木精5-10分钟，伊红1-3分钟）以保证一致性。局限性及改进方向对某些特殊成分（如黏液、脂质）染色效果不佳，需结合特殊染色或免疫组化技术补充诊断。特殊染色技术解析刚果红染色特异性标记淀粉样蛋白，偏振光下呈现苹果绿色双折射，是诊断淀粉样变性的关键方法。PAS染色（过碘酸雪夫反应）检测糖原、黏液和基底膜，糖原呈紫红色，用于糖尿病肾小球病变或真菌感染诊断。Masson三色染色区分胶原纤维（蓝色）、肌纤维（红色）和胞核（黑褐色），常用于心肌病、纤维化疾病的研究。网状纤维染色（如Gomori法）通过银浸染技术显示网状纤维分布，用于肝硬化、肿瘤间质浸润评估，纤维呈黑色，背景为黄色。01020304优质HE切片需核质界限分明，细胞核呈深蓝紫色，胞质为均匀粉红色，无染料沉淀或过染。细胞核与胞质对比度染色效果评估标准切片应无皱褶、刀痕或气泡，腺体、血管等微结构层次清晰，避免脱片或染色不均。组织结构完整性如PAS染色中糖原需定位准确，无背景非特异性着色；刚果红染色需排除假阳性干扰。特殊染色的特异性染色结果需符合临床诊断需求，如肿瘤分级时核分裂象应清晰可辨，否则需重新优化染色条件。病理诊断适用性03免疫组化技术应用抗体选择与优化策略需通过Westernblot、免疫荧光等交叉验证抗体的靶标结合能力，排除非特异性结合干扰，确保抗体仅识别目标抗原表位。抗体特异性验证通过预实验确定最佳稀释比例（如1:100至1:1000范围），平衡信号强度与背景噪音，避免过度稀释导致假阴性或高浓度引发假阳性。确保一抗宿主种属与样本种属不同（如兔抗人抗体检测小鼠组织需用抗兔二抗），避免内源性免疫球蛋白干扰。抗体浓度梯度测试多克隆抗体可识别多个抗原表位，敏感性高但特异性较低；单克隆抗体特异性强但可能因表位遮蔽导致漏检，需根据靶标特性选择。多克隆与单克隆抗体权衡01020403种属匹配性考量采用4%中性缓冲甲醛固定24小时内完成，避免过度固定导致抗原遮蔽；石蜡包埋切片厚度控制在3-5μm，保证抗原暴露一致性。根据靶蛋白特性选择热修复（pH6.0柠檬酸缓冲液高压）或酶消化（胰蛋白酶/胃蛋白酶），恢复因固定掩蔽的抗原表位。使用5%BSA或正常血清封闭非特异性位点30分钟；一抗4℃过夜孵育优于室温1小时，提高结合稳定性；二抗避光孵育避免荧光淬灭。同一实验采用相同试剂批次，设立阳性/阴性对照（如已知表达组织与空白对照），监控实验重复性。实验操作标准化组织固定与处理规范抗原修复方法优化封闭与孵育条件控制批次间质量控制结果判读与常见问题特异性信号评估阳性信号应定位在预期亚细胞结构（如膜蛋白呈膜分布，核蛋白集中于核内），排除胞质弥漫着色等非特异性染色。背景干扰处理高背景可能因封闭不充分或抗体浓度过高，可增加封闭时间或调整抗体稀释度；内源性过氧化物酶活性需用3%H₂O₂阻断15分钟。假阴性排查检查抗原修复是否充分（如高压时间不足）、一抗失效（通过阳性对照验证）或样本处理不当（如固定过度导致抗原降解）。定量分析标准化采用H-score或Allred评分系统，综合染色强度（0-3+）与阳性细胞百分比（0-100%），减少主观判读偏差。04分子病理学检测PCR技术原理与类型PCR（聚合酶链式反应）通过高温变性（95℃）使DNA双链解离为单链，低温退火（50-65℃）使引物与模板特异性结合，中温延伸（72℃）由DNA聚合酶合成新链，循环30-40次后可扩增目标DNA片段数百万倍。用于基因克隆、病原体检测等基础扩增，依赖电泳分析结果，灵敏度高但仅能定性。通过荧光信号实时监测扩增过程，可精确定量初始模板量，广泛应用于病毒载量检测（如HIV、HPV）和基因表达分析。将反应体系分割为微滴，通过统计阳性微滴数实现绝对定量，适用于低频突变检测（如肿瘤ctDNA分析）和拷贝数变异研究。基本原理常规PCR实时荧光定量PCR（qPCR）数字PCR（dPCR）FISH与CGH技术应用比较基因组杂交（CGH）通过对比肿瘤与正常DNA的杂交信号强度差异，全基因组筛查拷贝数变异，在实体瘤（如神经母细胞瘤）和血液系统恶性肿瘤中揭示染色体失衡。03高分辨率CGH（aCGH）结合微阵列技术将检测分辨率提升至kb级，可识别微小缺失/重复（如22q11.2微缺失综合征），优于传统核型分析。0201荧光原位杂交（FISH）利用荧光标记的核酸探针与样本DNA/RNA杂交，可在细胞或组织原位定位特定基因序列，用于HER2基因扩增检测（乳腺癌分型）和染色体易位诊断（如BCR-ABL融合基因）。新一代测序方法解析02

03

单细胞测序01

全基因组测序（WGS）在单个细胞水平解析基因组、转录组或表观组异质性，揭示肿瘤微环境细胞亚群特征及耐药机制，推动精准治疗策略开发。靶向测序（Panel测序）针对特定基因集（如癌症相关基因）进行深度测序，性价比高，适用于临床伴随诊断（如肺癌EGFR突变检测）。对个体全部DNA序列进行测定，可发现编码区、非编码区及结构变异，用于罕见病诊断和肿瘤驱动突变挖掘，但数据量大、成本较高。05细胞学检查技术通过细针穿刺病变部位获取细胞样本，适用于浅表淋巴结、甲状腺、乳腺等部位，操作需注意穿刺角度与深度以避免损伤血管或神经。细针穿刺抽吸技术（FNA）脱落细胞采集法灌洗液收集技术利用自然脱落或机械刮取的细胞（如宫颈刮片、痰液、尿液），需确保样本新鲜且避免污染，采集后立即固定以保持细胞形态完整性。通过生理盐水灌洗腔道（如支气管肺泡灌洗）获取细胞，需控制灌洗压力与液体量，避免细胞溶解或过度稀释影响检测灵敏度。细胞样本采集技巧涂片制备与染色流程快速染色法（Diff-Quik）薄层液基细胞学技术（TCT）采用苏木精、伊红等染料分层染色，突出细胞核与胞质对比度，适用于宫颈癌筛查，需严格控制染色时间以避免过染或褪色。样本经离心处理后均匀分散于保存液，通过自动化设备制成单层细胞涂片，显著减少血液或黏液干扰，提高诊断准确性。通过甲醇固定后直接滴加嗜酸性及嗜碱性染料，适用于术中快速病理评估，但细胞细节分辨率低于巴氏染色。123巴氏染色（Papstain）形态学诊断要点核质比异常分析恶性肿瘤细胞常表现为核质比增高，核染色质粗糙且分布不均，需结合核仁大小及数量综合判断恶性程度。细胞排列模式观察良性病变细胞多呈规则单层排列，而癌变细胞可呈现三维簇状、腺样或散在分布，侵袭性强的肿瘤常见单个细胞浸润现象。背景成分评估炎症或坏死背景中的中性粒细胞、淋巴细胞数量可辅助判断感染或免疫状态，纤维蛋白渗出提示组织修复或慢性炎症可能。06高级与新兴技术数字病理学平台介绍集成化医疗信息管理数字病理学平台通过整合高分辨率扫描设备与云端存储技术，实现病理切片的全数字化管理，支持多终端调阅、批注及三维重构，显著提升病理科工作效率和诊断标准化水平。跨地域远程会诊功能基于5G网络和加密传输协议，平台可实时传输4K级病理图像至全球专家端，解决基层医院病理医师短缺问题，尤其适用于罕见病鉴别和术中冰冻切片快速诊断场景。教学科研一体化应用平台内置AI标注系统和病例数据库，支持病理教学中的虚拟显微镜训练，同时为临床研究提供大规模病例数据挖掘和分子病理学关联分析功能。质控与标准化建设通过自动图像校准、染色一致性评估等模块，确保不同机构间诊断结果的可比性，符合国际CAP认证要求的数字化质控体系。血液病精准分型诊断利用多色荧光标记技术（如10色以上panel），可同时检测白血病细胞表面30余种抗原表达，实现AML/MDS等疾病的微小残留病灶（MRD）监测，灵敏度达0.01%。干细胞研究应用结合侧向散射光（SSC）和荧光染料Hoechst33342，可分离SP（sidepopulation）干细胞群体，用于造血干细胞移植前的细胞纯度鉴定。免疫微环境分析通过胞内因子染色（ICS）和增殖标志物检测，量化肿瘤浸润淋巴细胞亚群比例，为免疫检查点抑制剂疗效预测提供CD8+PD-1+/CD4+FOXP3+等关键参数。微生物快速检测采用核酸荧光标记和特定抗体偶联，实现血流感染中细菌/真菌的快速鉴定及药敏试验，较传统培养法缩短检测时间72小时以上。流式细胞术应用场景人工智能辅助分析全切片图像（WSI）智能筛查基于深度学习的卷积神经网络（CNN）算法，可自动识别宫颈液基细胞学中的HSIL以上病变，敏感度达98.7%，大幅降低初筛