基于药物峰的飞行时间质谱在耐碳青霉烯肠杆菌快速检测中的应用研究

-5-1前言肠杆菌科细菌作为人体内常见正常菌群，在特定情况下转变为条件致病菌，可致尿道、呼吸系统和血液系统等疾病，是引发医院感染的关键病原菌之一REF_Ref25492\r\h[1]。碳青霉烯类抗生素因其具备卓越的抗菌效能，常被用作治疗肠杆菌科细菌严重感染的常规药物REF_Ref7091\r\h[2]。随着此类药物的大规模使用，对耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae,CRE）的检出率急剧增长REF_Ref7307\r\h[3]。在我国，CRE感染的致死率死亡率高达50%REF_Ref6406\r\h[4]，相较之下，对碳青霉烯类敏感肠杆菌(carbapenem-sensitiveEnterobacteriaceae,CSE)感染的治疗选择更为丰富，而CRE感染在临床中可选择的有效抗生素更为有限。肠杆菌科对碳青霉烯类药物产生耐药性，主要通过三种机制：一是产生碳青霉烯酶；二是膜孔蛋白发生突变，同时伴随着头孢菌素酶（AmpC）或超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）生成过量；三是外排泵系统过度表达。其中，产生碳青霉烯酶是最主要的耐药机制REF_Ref1152\r\h[5]。鉴于此，快速检碳青霉烯酶变得尤为关键。目前CRE的实验室检测主要围绕碳青霉烯酶展开，分为表型检测和基因型检测。表型检测涵盖CarbaNP试验、改良碳青霉烯灭活试验（包括mCIM试验和eCIM试验）、碳青霉烯酶抑制剂增强试验等REF_Ref27220\r\h[6]。根据相关研究REF_Ref26879\r\hREF_Ref27220\r\h[6-REF_Ref26885\r\h8]，CarbaNP试验在检测碳青霉烯酶（涵盖产KPC、NDM、VIM、IMP、SPM和/或SME型碳青霉烯酶菌株）方面，其灵敏度和特异性虽表现良好，部分试剂却需自制，且有效期较短；此外，在部分分离株检测中，存在结果不准确的情况，尤其是针对某些特定类型的碳青霉烯酶（例如染色体介导的OXA型碳青霉烯酶）。改良碳青霉烯灭活试验和碳青霉烯酶抑制剂增强试验试验孵育时间较长REF_Ref27209\r\h[9]，导致检测效率不高。基因型检测法涵盖基因检测技术和酶免疫层析技术，不过这类方法只能检测预设范围的碳青霉烯耐药基因，即便成功检测出耐药基因，也不能确定其一定表达REF_Ref27568\r\h[10]。近年来，以基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted

laser

desorptionionization

time-of-flight

mass

spectrometry，MALDI-TOF

MS)技术检测CRE成为研究热点REF_Ref9802\r\h[11]。MALDI-TOFMS作为一种新兴细菌鉴定技术，凭借快速、准确、低成本的优势，在细菌鉴定领域得到广泛应用REF_Ref25926\r\h[12]，其原理主要依据质谱图中的特征峰对细菌进行鉴定和分类REF_Ref11935\r\h[13]。尽管在细菌耐药性检测方面仍处于探索阶段REF_Ref14074\r\h[14]，但有研究显示REF_Ref9199\r\h[15-REF_Ref9228\r\h19]，该技术对细菌耐药机制检测具有较高的灵敏度和特异性。碳青霉烯酶是β-内酰胺酶的一种，具备水解抗生素的能力REF_Ref10473\r\h[20]。2011年，Hrabák等REF_Ref11217\r\h[21]发现，将MALDI-TOFMS技术结合酶水解法，能够有效检测肠杆菌科和铜绿假单胞菌产生的碳青霉烯酶。此后，相关研究不断涌现，国内外诸多研究报道利用MALDI-TOF

MS对特征峰的鉴别能力进行细菌耐药性检测REF_Ref26618\r\h[22-REF_Ref26624\r\h23]。本研究是基于REF_Ref27395\r\h[24]试验菌株所产碳青霉烯酶可水解亚胺培南，进而引起其相对分子质量改变这一原理，运用MALDI-TOFMS检测药物峰，以此判断菌株是否产碳青霉烯酶。通过对临床菌株的验证和前瞻性评估，旨在为飞行时间质谱应用于临床实验室的CRE快速检测提供依据。2材料与方法材料菌株来源60株CRE菌株：收集深圳某综合三甲医院分离于2023年1月-2025年2月期间的CRE菌株样本及其患者相关临床资料，剔除同一患者同一部位重复菌株后纳入60株CRE。43株CSE菌株：收集分离于2024年12月-2025年2月深圳某综合三甲医院的CSE菌株，剔除同一患者同一部位重复菌株后纳入43株CSE。CSE菌株的入选标准：①全自动微生物质谱分析仪（安图Autofms1000）已鉴定为肠杆菌科细菌；②VITEK2.0GN334药敏检测卡检测出对亚胺培南或厄他培南为敏感或中介,经mCIM试验鉴定为不产碳青霉烯酶。64株药敏结果未知肠杆菌科细菌：收集分离于2025年3月-2025年4月深圳某综合三甲医院的64株肠杆菌科细菌。质控菌株：阳性对照菌株：肺炎克雷伯氏菌(ATCC®BAA-1705)；阴性对照菌株：大肠埃希菌(ATCC®25922)，该菌株不具有碳青霉烯酶活性。仪器与试剂方法本实验方法按照以下技术路线进行操作，如图1。2.2.1CRE菌株的验证试剂配制：①抗生素溶液配制：从-20℃冰箱中取出碳青霉烯酶检测试剂盒放置室温15分钟，往抗生素试剂管（亚胺培南）里加入700μL缓冲液混匀，分装至1.5mL离心管中，每管50μL（未用完的抗生素溶液立即置于-20℃以下保存）。②校准品配制：取出试剂盒中的1支校准品，加入质谱样本预处理试剂的裂解液2和裂解液1各30μL，用移液枪吹打混匀。菌株复苏与分离培养：将保存于-80℃冰箱中的60株CRE菌株取出，置于室温下恢复15min，采用分区划线法接种于血琼脂培养基（血平板）上，35℃过夜孵育。MALDI-TOFMS检测碳青霉烯酶：①挑菌与抗生素孵育：采用1μL接种环挑取血平板上的1-2个菌落（直径：0.5-2mm），尽量选择单菌落，如果菌落较小可选择几个形态特征较一致的菌落，将菌株加入用EP管分装好的抗生素溶液中，充分混匀。接着将菌株和抗生素的混合液置于(35±2)℃的水浴箱中孵育30-40min。其后，将EP管以12000rpm的转速离心5min。②上机检测：取EP管中上清液1μL，点靶，待其干燥后，加入基质液1μL，晾干，然后进行质谱分析。质谱仪采用反射正离子检测模式，方法选择“Carbapenem”；采集质量范围设为100~1000Da。③图像分析：将采集好的光谱导入AutofClassifier软件进行分型，由于亚胺培南和基质液混合物产生的质谱峰为489m/z，若该菌株产碳青霉烯酶，将水解抗菌药物，该菌株的489m/z处的特征峰将消失或明显减弱。因此，该菌株是否产碳青霉烯酶的判断依据是质谱图中489m/z处的峰是否消失或明显减弱。质谱结果和MIC结果比较：理论上60株CRE菌株经AutofClassifier软件的分型结果应均为碳青霉烯酶阳性，应与患者临床信息的药敏结果（对亚胺培南或厄他培南耐药）相符。2.2.2CSE菌株的验证MALDI-TOFMS检测碳青霉烯酶：按照上述CRE菌株验证的步骤进行检测。质谱结果与MIC结果比较：将43株CSE菌株经AutofClassifier软件的分型结果与其MIC结果分析比较。2.2.3肠杆菌科细菌的前瞻性检测细菌鉴定与药敏：按照上述菌株验证的步骤进行检测。MALDI-TOFMS检测碳青霉烯酶：按照上述CRE菌株验证的步骤进行检测。质谱结果与MIC结果比较：采用Vitek2Compact全自动微生物药敏仪对其进行亚胺培南敏感性试验，其MIC结果解释参照美国临床和实验室标准化协会(Clinicalandlaboratorystandardsinstitute,CLSI)标准CLSIM100S(第35版)REF_Ref32130\r\h[25]，将64株肠杆菌科细菌经AutofClassifier软件的分型结果与其MIC结果分析比较。2.2.4质量控制质谱峰校准：利用基质液中α-氰基-4-羟基肉桂酸（α-HCCA：C10H7NO3，相对分子质量189.17g/mol）电离产生的质谱峰，对波峰采集质量范围在100~1000Da部分进行校准REF_Ref9222\r\h[26]。校准峰分别为HCCA[M+H+]：190.170m/z、HCCA[2M+H+]：379.340m/z和HCCA[LXP]：608.680m/z，HCCA[BK]：757.400m/z，4个校准峰值同时出现，并且每个峰的最大容差(Err/ppm)都不超过±350ppm，即视为校准通过。药物对照：取配制好的抗生素溶液1μL点靶，干燥后滴加1μL基质液，上机后收集的质谱峰作为此次实验的药物对照。阴阳性对照：采用肺炎克雷伯氏菌(ATCCBAA-1705)作为阳性对照菌株，以及大肠埃希菌(ATCC25922)作为阴性对照菌株，再按照上述实验流程检测。2.2.5统计学处理应用Kappa检验分别对已知菌株（CRE菌株和CSE菌株）和64株肠杆菌科细菌的质谱法结果与MIC法结果进行一致性检验，再用Wilson计分区间计算一致性比例的置信区间，从而更好地分析对比MIC法质谱法对CRE鉴定的一致性。3结果3.1质量控制结果3.1.1质谱校准峰结果见图2，可见质谱图中同时出现4个校准峰，分别为190.103m/z、379.279m/z、608.376m/z和757.101m/z，且各个峰的最大容差均不超过±350ppm，质谱仪内部校准通过。3.1.2药物对照和阴阳性对照结果药物对照组和阴性对照组经AutofClassifier软件分型结果均为碳青霉烯酶阴性，质谱图（见图3a、图3b）均同时检测到489m/z处的特征峰；阳性对照组的分型结果为碳青霉烯酶阳性，图谱（见图3c）中489m/z处的特征峰消失。3.2CRE菌株的验证结果3.2.1CRE菌株分布及药敏结果60株CRE菌株构成比从高到低依次分别为由肺炎克雷伯菌（60%），大肠埃希菌（23%）、奇异变形杆菌（3%）、阴沟肠杆菌（3%）、弗劳地枸橼酸杆菌（3%）、产气克雷伯菌（2%）、产酸克雷伯菌（2%）、B群沙门菌（2%）、摩根摩根菌（2%），详见表3。60株CRE菌株的标本来源分布从高到低依次分别为中段尿（38%）、痰（20%）、灌洗液（13%）、外周血（12%）、伤口分泌物（8%）、脓液（5%）、粪便（2%）、腹水（2%），详见图4。60株CRE菌株的科室分布主要依次为重症医学科（23株，占38.3%）、呼吸与危重症（6株，占10%），肾内科（5株，占8.3%）、血液内科（4株，占6.7%）；其余科室分布情况详见图5。60株CRE菌株对不同抗菌药物的耐药率均达50%以上，其中替加环素和阿米卡星的耐药率最低，依次分别为52.6%和52.9%，详见表4和图6。3.2.2MALDI-TOFMS检测碳青霉烯酶结果60株CRE菌株经质谱检测碳青霉烯酶，分型结果为阳性59株，阴性1株。59株阳性结果的质谱图中，489m/z处的特征峰均出现消失或显著减弱，与阳性对照组的图谱特征基本一致（见图7）；而1株阴性结果的质谱图没有出现此类变化；说明MALDI-TOFMS所验证的60株CRE有59株产碳青霉烯酶，1株未检测出产碳青霉烯酶。3.2.3质谱结果与MIC结果质谱法检测60株CRE的分型结果为碳青霉烯酶阳性59株，阴性1株；60株CRE菌株的MIC结果均为对亚胺培南或厄他培南耐药（详见表5和图7）；汇总质谱法和MIC法的结果如表5所示。3.3CSE菌株的验证结果3.3.1MALDI-TOFMS检测碳青霉烯酶结果应用MALDI-TOFMS对43株CSE菌株检测，经AutofClassifier软件分型，共检测出40株碳青霉烯酶阴性，3株碳青霉烯酶阴性。40株阴性结果的质谱图489m/z处的特征峰均被检测到，其峰强度与与阴性对照组489m/z峰强度基本一致，见图8；3株阳性结果的质谱图表现为489m/z处的特征峰消失或明显减弱；说明所验证的43株CSE菌株中40株不产碳青霉烯酶，3株检测出产碳青霉烯酶。3.3.2质谱结果与MIC结果质谱法检测43株CSE的分型结果为碳青霉烯酶阳性3株，阴性40株；MIC法对43株CSE进行亚胺培南或厄他培南药敏试验，敏感40株，中介3株（1株大肠埃希菌、1株肺炎克雷伯菌、1株产气克雷伯菌）。汇总质谱法和MIC法的结果如表5所示。3.4肠杆菌科细菌的前瞻性检测结果3.4.1细菌鉴定与药敏结果64株肠杆菌科细菌经MALDI-TOFMS鉴定，大肠埃希菌43株，肺炎克雷伯菌19株，阴沟肠杆菌2株；MIC法对其进行亚胺培南/厄他培南药敏试验，58株菌株敏感，4株为中介，2株为耐药，详见表6。3.4.2MALDI-TOFMS检测碳青霉烯酶结果应用MALDI-TOFMS对64株肠杆菌科细菌检测，经AutofClassifier软件分型，碳青霉烯酶阴性有58株，所有质谱图489m/z处的特征峰均被检测到，其峰强度与与阴性对照组489m/z峰强度基本一致；碳青霉烯酶阳性有6株，其质谱图489m/z处的特征峰均表现出消失或明显减弱，与阳性对照的图谱基本一致；说明所检测的64株肠杆菌科细菌有58株不产碳青霉烯酶，6株检测出产碳青霉烯酶。3.4.3质谱结果与MIC结果质谱法检测64株肠杆菌科细菌的分型结果为碳青霉烯酶阳性6株，阴性58株；MIC法对64株肠杆菌科细菌进行亚胺培南或厄他培南药敏试验，敏感58株，中介4株，耐药2株。汇总质谱法和MIC法的检测结果如表6所示。3.5统计学处理结果对比MIC法，质谱法对已知菌株验证和未知菌株检测的统计学结果见表7。已知菌株的验证：对60株CRE菌株的验证结果（表5）进行一致性检验，结果显示灵敏度（真阳性率）为98.3%，假阴性率为1.7%，总符合率为98.3%；应用Wilson计分区间求其95%的置信区间为（91.6%,99.3%），总符合率在置信区间内。同理，对43株CSE菌株的验证结果（表5）进行统计学处理，结果显示特异度（真阴性率）为93.0%，假阳性率为7.0%，总符合率为93.0%，在95%的置信区间（82.2%，96.3%）内。肠杆菌科细菌的前瞻性检测：同上，对检测结果（表6）进行统计学处理，结果显示灵敏度为100%，特异度为93.1%，假阳性率为6.5%，总符合率为93.8%，在95%的置信区间（85.5%，96.3%）内。4讨论抗生素的过度使用加速了细菌耐药性的发展，细菌耐药性受到了全球公共健康领域的广泛关注。2017年，世界卫生组织（WHO）把耐碳青霉烯酶肠杆菌（CRE）纳入了全球病原体威胁优先级列表REF_Ref31463\r\h[27]。据资料显示，CRE感染所导致的患者病死率在44%至70%之间。CRE的治疗相当困难，临床上可选的抗菌药物极为有限，感染之后，患者不仅需要承受更长的住院周期，其死亡风险也会显著增加REF_Ref9345\r\h[28]。因此，尽早快速地检测CRE是临床实验室的重要任务，可为临床合理、精准用药提供有力指导，降低患者死亡率。本实验通过观察亚胺培南特征峰的变化，评估应用MALDI-TOFMS对CRE鉴定的准确性，将亚胺培南与肠杆菌共孵育30-40min，结束后离心分离抗生素和菌，质谱检测上清液，再分析亚胺培南489m/z特征峰的信号强度变化。根据该特征峰的变化来判定肠杆菌是否产碳青霉烯酶。若该菌株水解亚胺培南，则489m/z处的特征峰将消失或减弱，表明该菌株产碳青霉烯酶。根据CRE的定义REF_Ref28471\r\h[29]：CRE是指在体外药敏试验中，存在对亚胺培南、厄他培南、美罗培南或多利培南等碳青霉烯类抗生素至少一种具有耐药特或已证实可产碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。对于摩根菌属、变形杆菌属和普罗威登菌属等因生物特性引起亚胺培南天然敏感性下降的菌种，其耐药性评估需结合美罗培南等其他碳青霉烯类抗生素进行药敏检测，避免因单一指标造成误判REF_Ref11465\r\h[30]。即该菌株经质谱鉴定属于肠杆菌科细菌，经MALDI-TOFMS检测出碳青霉烯酶，表明该菌株是CRE，从而能够完成对CRE的识别判定。根据相关研究资料REF_Ref22570\r\h[31-REF_Ref29056\r\h36]可知，CRE中，肺炎克雷伯菌的检出率最高通常在66.7%至73.9%区间内；其次为大肠埃希菌，检出率在8.5%至16.6%范围。本次实验中，对深圳某综合三甲医院分离的60株CRE菌株分析发现，菌株构成存在差异，其中肺炎克雷伯菌占比高达60%，位列首位；大肠埃希菌检出率则为23%，紧随其后；与上述研究不符，原因可能是存在地域、样本量、研究时间跨度的差异REF_Ref19548\r\h[37]。本次收集的60株CRE菌株，有38%来自中段尿，原因可能是粪便污染尿道口（尤其女性因尿道短且临近肛门）或肠道菌群移位导致的条件致病菌感染REF_Ref23777\r\h[38-REF_Ref23794\r\h41]。在临床科室分布方面，这些CRE菌株主要集中在重症医学科，占比38.3%，主要是因为重症医学科的患者大多病情严重或处于术后恢复期，其免疫功能低下，且基础疾病较为复杂，长期抗生素压力导致耐药菌株的产生REF_Ref25044\r\h[42-REF_Ref25048\r\h43]。本实验选用亚胺培南作为水解底物，主要基于以下考量：在动力学特性上，亚胺培南水解速率显著快于美罗培南与厄他培南REF_Ref24499\r\h[44]；在质谱检测上，亚胺培南及其水解产物仅呈现两个特异性信号峰，且峰形清晰直观，便于观察结果REF_Ref16678\r\h[45]，且能有效减少质谱读取误差REF_Ref16844\r\h[46]。此外，Lasserre等人REF_Ref17073\r\h[47]的研究发现，亚胺培南溶液在-80°C能够保持至少1个月的稳定性，这一发现为本实验在日常操作中提供了可行性保障。理论上，药物被酶水解的同时也产生了水解产物，而本实验选择以药物特征峰作为检测对象，而非对水解产物峰进行检测。这或许与亚胺培南水解产物不稳定性存在关联。有研究表明REF_Ref17357\r\h[48]，细菌在与亚胺培南共孵育后，亚胺培南的特征峰出现消失，但其水解产物峰却未明显增加。不过也有研究REF_Ref18307\r\h[49]发现亚胺培南水解产物峰有上升情况。这种研究差异的产生，可能是实验所需的试剂和实验条件不完全一致，改变了亚胺培南水解产物的稳定性。本实验先对已知菌株（60株CRE菌株和43株CSE）进行回顾性验证，应用MALDI-TOFMS对其进行碳青霉烯酶的检测，与MIC结果比较分析其一致性；再对64株肠杆菌科细菌进行前瞻性研究，分析MALDI-TOFMS对碳青霉烯酶的检测结果与MIC结果的一致性。结果显示，对比MIC法，在回顾性验证中质谱法对已知CRE菌株验证的灵敏度为98.3%，对已知CSE菌株验证的特异度为93.0%；在前瞻性检测中质谱法对肠杆菌科细菌检测的灵敏度为100%，特异度为93.1%；表明本实验质谱法对CRE鉴定的灵敏度和特异度较好。同时，对已知菌株验证和肠杆菌科细菌前瞻性检测的总符合率均在95%的置信区间内，说明该检测方法具有良好的检测性能REF_Ref12341\w\h[50]。然而本实验质谱法对CRE的鉴定存在假阴性结果（碳青霉烯酶阴性），原因可能是所检测CRE菌株的耐药机制是非产酶机制，如膜孔蛋白突变或外排泵系统过表达REF_Ref27220\w\h[6]。也存在假阳性结果，可能是所检测菌株的耐药机制复杂，除碳青霉烯酶参与其中外，外膜孔蛋白的减少或缺失，以及外排泵的过量表达等因素，也会与碳青霉烯酶协同作用，共同影响菌株耐药性的形成。在某些情况下，这些机制的综合作用可能导致药敏结果与预期不符REF_Ref6406\w\h[4]；也可能是因抗生素保存不当导致分解，检测不出489m/z处的特征峰，从而检测出碳青霉烯酶假阳性。总之，虽存在假阴性或假阳性结果还有待继续研究，但本实验在回顾性验证和前瞻性检测中表现出较好的灵敏度和特异度，且总符合率均在95%置信区间内；且质谱法操作快速简单，亚胺培南与菌株的孵育时间短，耗时1小时左右即出结果，同时可实现多样本并行检测，大幅提升检测效率。与MIC法相比，质谱法极大地缩短了药敏检测时间，有望在临床实验室的CRE的快速检测中得到广泛应用。本实验也存在一些有待改进之处。首先，由于收集时间短，收集到的标本量较少，对已知菌株验证的标本量与肠杆菌科细菌前瞻性检测的标本量没有做到一致；同时对CSE菌株验证和对前瞻性检测的菌株类型较少，未纳入多种类型的肠杆菌科细菌。其次，MALDI-TOFMS可检测出各种已知或未知的碳青霉烯酶，但无法判断该菌所产碳青霉烯酶的类型。此外，目前该方法仅适用检测产碳青霉烯酶并水解抗生素的细菌，而对于因膜孔蛋白缺失或外排泵过表达等其他机制所导致耐药的细菌，则无法进行检测。最后，本实验选取亚胺培南的特征峰489m/z作为产碳青霉烯酶的判断标准，而吴灿权REF_Ref9228\r\h[19]等人和梁世周REF_Ref9222\r\h[26]等人的研究，选择300m/z和489m/z两个质谱峰作为结果的判断；许春燕REF_Ref9209\r\h[16]的研究只将300m/z处的质谱峰作为产酶的判断标准；刘璐REF_Ref29539\r\h[51]的研究，选择亚胺培南的特征峰则是254m/z。众多研究表明，亚胺培南的特征峰目前仍存在判断标准不一的问题，可能是因为不同的质谱分析仪器和实验条件（如离子源、加速电压、检测器灵敏度等）会影响特征峰的出现和强度，因此还有待进一步探索研究。结论本实验证明，基于对药物峰的检测，MALDI-TOFMS对耐碳青霉烯肠杆菌的鉴定表现出较好的灵敏度和特异度，且检测时间大幅减少，可实现批量检测，在临床实验室的CRE快速检测中具有较大应用潜力，但其灵敏度和特异性尚需进一步优化。参考文献张伟伟.2023年临床分离肠杆菌科细菌的分布特征及其耐药情况分析[J].航空航天医学杂志,2024,35(07):830-832.刘卫平，海云婷，杨丽芳，等.某三级综合医院耐碳青霉烯肠杆菌科细菌流行特征及耐药性分析［J］.中华医院感染学杂志，2020.30(19):2943-2948.IACCHINIS,SABBATUCCIM,GAGLIOTTIC,etal.BloodstreaminfectionsduetocarbapenemaseproducingEnterobacteriaceeinItaly:resultsfromnationwidesurveillance,2014to2017LJJ.EuroSurveill,2019,24(5):1800159.中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识编写组,中国医药教育协会感染疾病专业委员会,中华医学会细菌感染与耐药防控专业委员会.中国碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌感染诊治与防控专家共识[J].中华医学杂志,2021,101(36):2850-2860.Zhang

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