基于正交试验设计的大黄-黄芪药对总黄酮提取工艺优化

摘要目的：针对大黄-黄芪配伍中总黄酮的提取效率提升需求，采用超声波辅助提取技术，以乙醇浓度、提取时长、循环次数及物料溶剂比为关键参数，开展多因素协同优化研究，旨在确定各工艺参数的最优匹配方案。方法：采用紫外分光光度法建立总黄酮定量分析方法，以芦丁为对照品完成方法学验证，涵盖日内精密度（RSD）、6h稳定性、重复性（n=6）及回收率等指标。采用单因素法系统研究乙醇体积分数（50%-80%）、浸提时长（0.5-2h）、提取频次（1-4次）及固液比（1:5-1:20）的独立效应，结合四因素三水平正交设计（L₉(3⁴)）筛选最优工艺组合。结果：方法学考察结果表明，分析体系的日内精密度、供试品稳定性及方法重复性实验中RSD均控制在0.2%以内，样品回收率测定值达90.2%（RSD=1.31%）。工艺参数影响排序为提取时间＞提取次数＞固液比＞乙醇浓度。验证获得最佳工艺条件为60%乙醇、固液比1:5、提取1h并重复3次，黄酮得率达10.54%。经平行验证实验（n=3）确认，该工艺参数组合具有良好重现性。结论：本研究通过多因素正交设计优化，构建了大黄-黄芪药对黄酮类成分的高效超声辅助提取工艺，关键参数稳定可控且提取效能显著，为复方中药活性成分的标准化提取及工业化开发提供了可靠的技术路径。关键词：大黄；黄芪；总黄酮提取；正交设计；提取工艺优化

ABSTRACTObjective:Inresponsetothedemandforimprovingtheextractionefficiencyoftotalflavonoidsinthecompatibilityofrhubarbandastragalus,theultrasonic-assistedextractiontechnologywasadopted.Withethanolconcentration,extractionduration,cyclenumberandmaterial-to-solventratioaskeyparameters,amulti-factorcollaborativeoptimizationstudywasconductedtodeterminetheoptimalmatchingschemeofeachprocessparameter..Methods:Aquantitativeanalysismethodfortotalflavonoidswasestablishedbyultravioletspectrophotometry,andrutinwasusedasthereferencesubstancetocompletethemethodologicalvalidation,coveringintra-dayprecision(RSD),6-hourstability,repeatability(n=6),andrecoveryrate.Theindependenteffectsofethanolvolumefraction(50%-80%),extractiontime(0.5-2h),extractionfrequency(1-4times),andsolid-liquidratio(1:5-1:20)weresystematicallystudiedbythesingle-factormethod.Theoptimalprocesscombinationwasscreenedbythefour-factorthree-levelorthogonaldesign(L₉(3⁴)).Results:TheresultsofthemethodologicalinvestigationindicatedthattheRSDsoftheintra-dayprecision,thestabilityofthetestsamplesandtherepeatabilityofthemethodwereallcontrolledwithin0.2%.Therecoveryrateofthesampleswasmeasuredtobe90.2%(RSD=1.31%).Therankingoftheinfluenceofprocessparameterswasextractiontime>extractiontimes>solid-liquidratio>ethanolconcentration.Theoptimalprocessconditionsobtainedthroughvalidationwere60%ethanol,asolid-liquidratioof1:5,extractionfor1hourandrepeated3times,withaflavonoidyieldof10.54%.Parallelverificationexperiments(n=3)confirmedthatthiscombinationofprocessparametershadgoodreproducibility.Conclusion:Inthisstudy,throughmulti-factororthogonaldesignoptimization,anefficientultrasound-assistedextractionprocessforflavonoidcomponentsofrhubarb-Astragalusmembranaceuswasconstructed.Thekeyparameterswerestableandcontrollable,andtheextractionefficiencywassignificant,providingareliabletechnicalpathforthestandardizedextractionandindustrialdevelopmentofactivecomponentsincompoundtraditionalChinesemedicines.KeyWords:DaHuang;HuangQi;Extractionoftotalflavonoids;OrthogonalDesign;ExtractionProcessOptimization综述近年来，在当前社会经济发展与疾病谱系演变背景下，心脑血管疾病、代谢异常综合征及恶性肿瘤等慢性病的患病率持续攀升。在这一健康挑战中，中医药的防治优势逐步得到重视REF_Ref10349\r\h[1]。大黄来源于蓼科掌叶大黄（RheumpalmatumL.）、唐古特大黄（R.tanguticumMaxim.exBalf.）或药用大黄（R.officinaleBaill.）的干燥根茎，性味苦寒，主归脾、胃、大肠等经，具有泻下攻积、清热泻火等功效REF_Ref10558\r\h[2]；黄芪则取自豆科蒙古黄芪（Astragalusmembranaceusvar.mongholicus）或膜荚黄芪（A.membranaceus）的干燥根REF_Ref10852\r\h[3]，性甘微温，归肺脾二经，以益气固表、升阳举陷为功效特点REF_Ref10829\r\h[4]。临床上两药配伍主要应用于REF_Ref11835\r\h[5]慢性肾病（如肾功能不全）、糖尿病并发症（如周围神经病变）及心血管疾病（如高血压合并代谢紊乱）的辅助治疗。1.1国内外研究动态自20世纪末以来，随着现代提取技术与分析手段的持续进步，中药活性成分的提取工艺研究受到广泛关注REF_Ref10349\r\h[1]。在传统浸泡、回流提取等方法的基础上，国内外学者相继引入了超声辅助提取（UAE）、微波辅助提取（MAE）以及超临界流体提取（SFE）等现代技术REF_Ref12067\r\h[6]，应用于天然产物活性成分的提取研究中。机理研究证实REF_Ref10071\r\h[7]，超声辅助提取技术利用高频机械振荡与空化现象产生的协同作用，能够有效增强溶媒对植物细胞结构的渗透性能，从而加速目标组分的溶出速率，这不仅提升提取效率，还能缩短工艺时间、减少溶剂消耗，在中药提取领域展现出显著优势。正交实验设计是通过正交表安排实验，使各因素的各水平在试验中均匀搭配、相互独立，从而以最少的实验次数分析各因素对结果的影响，并确定最优组合REF_Ref12305\r\h[8]。相关研究指出，正交试验可有效筛选出影响提取率的关键参数，如溶剂浓度、提取时间及料液比等REF_Ref12406\r\h[9]，从而构建稳定、高效的提取流程。在多项文献报道中，正交设计不仅显著提高了黄酮类等活性成分的得率，也为中药产品质量控制与工艺稳定性提供了技术保障REF_Ref12305\r\h[8]。1.2本选题的创新性和研究意义1.2.1创新性1.2.1.1方法学验证的系统性本研究在工艺优化前，系统开展了总黄酮含量测定方法的建立和方法学考察工作，结果表明：仪器精密度、方法稳定性、重复性和加样回收率指标均符合要求，为后续实验建立了可信的分析基础REF_Ref12847\r\h[10]。1.2.1.2多因素正交设计的应用针对大黄与黄芪配伍提取工艺中的复杂变量关系，本研究采用四因素三水平法构建正交试验设计，通过系统分析了乙醇体积分数、提取时间、提取次数和料液比对总黄酮得率的影响规律REF_Ref12906\r\h[11]，不仅量化了单一参数的独立作用，还解析了多因子间的协同效应，显著提升了工艺优化效率。1.2.1.3最优工艺参数的验证基于正交试验结果，该研究通过多批次验证试验确定了稳定可控的最优工艺参数组合。该成果不仅阐明了大黄-黄芪配伍提取的关键控制要素，更为中药制剂产业化生产中的质量控制标准制定提供了重要技术支撑。1.2.2研究意义本研究系统优化了大黄-黄芪复方组合中提取总黄酮的工艺过程，通过多因素正交优化实验系统探究各工艺参数对黄酮提取率的影响规律，确定了最佳工艺参数组合。研究建立了标准化的操作流程，显著提升了活性成分的提取效率，为中药复方制剂的工业化生产提供了可量化、可复制的技术依据。研究成果不仅有助于推动中药质量控制标准的优化与升级，所获得的高纯度总黄酮组分亦为开发用于糖尿病、肾病等慢性疾病防治的中药新产品提供了关键原料支持，对传统中医药现代化的发展具有重要的现实意义和应用价值REF_Ref13125\r\h[12]。2实验内容2.1仪器与材料2.1.1药物与试剂大黄（批号：230601，重庆国乘堂制药有限公司），黄芪（批号：241202，江苏宜草生物科技有限公司），经鉴定符合《中国药典》2020版相关要求；芦丁标准品（纯度≥98%，批号：81L02，由河南省万佳首化生物科技有限公司提供）；无水乙醇，亚硝酸钠，硝酸铝及氢氧化钠等试剂均为分析纯规格，采购自国药集团化学试剂有限公司。2.1.2实验仪器UV-1280型紫外可见分光光度计（日本岛津公司制造）；ATX124型精密电子天平（日本岛津公司）；KM-600DE型超声处理设备（昆山美美超声仪器公司）；L500型台式离心机（长沙湘仪离心机公司）。所有仪器设备均经计量校准且在有效使用期内。2.2实验方法与结果2.2.1大黄-黄芪黄酮的提取方法2.2.1.1供试品溶液与空白对照溶液的制备精密称取大黄-黄芪（1:1）混合药粉6.00g，置250mL锥形瓶中，加入适量乙醇溶液。采用超声波辅助提取技术（工作频率50kHz）处理样品后，所得提取混合体系在4000r/min转速条件下进行离心分离操作（持续5min），取上清液即得供试品溶液。参考上述方法同步制备空白对照溶液用于后续检测校正。2.2.1.2建立芦丁标准曲线准确称量10.0mg芦丁对照品（精确至0.1mg），定量转移至10mL容量瓶中，采用60%（v/v）乙醇溶液溶解并定容至刻度，获得1.0mg/mL标准储备液。采用梯度稀释法分别移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8及1.0mL储备液，使用同浓度乙醇溶液稀释至10mL，制得0.1-1.0mg/mL系列标准工作液REF_Ref13651\r\h[13]。显色反应体系构建流程为：精确移取1.0mL各浓度标准液至10mL具塞试管中，依次加入1.0mL60%乙醇（空白校正）、0.5mL5%（m/v）亚硝酸钠溶液，涡旋混合后静置反应5min；继而加入0.5mL10%（m/v）硝酸铝溶液，振荡混匀后二次静置5min；最终加入4.0mL4%（m/v）氢氧化钠溶液，充分混匀后避光显色15min。以同步制备的未加显色剂混合液作为参比，于510nm波长处测定各反应体系的吸光值REF_Ref13690\r\h[14]。经线性回归分析显示（REF_Ref21544\h图1），芦丁浓度（X，mg/mL）与吸光值（Y）的定量模型为Y=1.6882X+0.1182（R²=0.9964），在0.1-1.0mg/mL范围内呈现良好的线性响应（R²>0.99），满足痕量组分定量检测要求。图SEQ图\*ARABIC1芦丁标准曲线2.2.1.3总黄酮含量的测定准确吸取1mL大黄-黄芪药对提取液至容量瓶中,用60%乙醇(v/v)定容至25mL,混合均匀后按照“REF_Ref196160214\n\h2.2.1.2”项下方法测量其吸光度，并计算黄酮的得率REF_Ref14121\r\h[15]（Y）。其中：C表示通过标准方程得到的提取液黄酮浓度（mg/mL），N表示提取液的稀释倍数，V表示提取液总体积（mL），M表示原料初始质量（g）。2.2.2方法学试验考察2.2.2.1精密度试验精密称量2.84mg芦丁对照品，采用无水乙醇溶解并定量转移至10mL容量瓶中定容，参照“REF_Ref196160214\n\h2.2.1.2”项下方法连续测定6次吸光度，结果显示吸光值均值为0.4789，其RSD=0.154%，证明该分析仪器精密度良好。2.2.2.2重复性试验精确称量6份平行样品（每份6.00g，药材基质配比1:1），参照“REF_Ref196160402\n\h2.2.1.1”项下方法制备供试品溶液，吸取1mL用无水乙醇定容至25mL，基于“REF_Ref196160214\n\h2.2.1.2”项下检测方法进行吸光度测定并计算含量（mg/g）。结果显示平均吸光度为0.3919，黄酮含量平均值为33.76mg/g，RSD=0.074%<1%，表明该方法满足复杂基质样品定量分析的重复性要求。2.2.2.3稳定性考察精密称量6份平行样品（每份6.00g，药材基质配比1:1），参照“REF_Ref196160402\n\h2.2.1.1”项下方法制备供试品溶液，吸取1mL用无水乙醇定容至25mL，基于“REF_Ref196160214\n\h2.2.1.2”项下检测方法，分别于0、30min、1h、2h、4h、6h测定吸光度，得平均值为0.3762，计算其RSD=2.57%，表明溶液在6h内稳定性良好，但需注意提取液冷藏保存为佳，防止降解影响后续实验结果REF_Ref15081\r\h[16]。2.2.2.4加样回收率考察精密称量已知黄酮含量的药材基质样品六份（药材基质配比1:1），定量添加等量芦丁标准溶液后，参照“REF_Ref196160214\n\h2.2.1.1”项下方法制备供试品溶液，用无水乙醇定容至25mL。每份取1mL，基于“REF_Ref196160214\n\h2.2.1.2”项下检测方法测定吸光度。以未加标样品的本底吸光值作为参比，计算加样回收率REF_Ref15195\r\h[17]。结果显示，加标组吸光度平均值为0.4196，经计算得加样回收率为90.2%，RSD=1.31%<1.5%，确证本检测体系具有良好的测定准确性，能够有效控制复杂基质中目标成分的定量误差。2.2.3单因素试验2.2.3.1乙醇体积分数对黄酮得率的影响采用1:5（g/mL）的固定料液比，设定0.5小时提取时长和2次提取次数，系统探究了不同体积分数乙醇溶媒（50%、60%、70%、80%）对该复方药材中黄酮类成分溶出特性的影响规律。实验结果（见REF_Ref16834\h图2）显示，黄酮提取率与醇溶液浓度呈现非线性相关性：当乙醇体积分数由50%逐步提升至70%时，黄酮溶出量呈显著增长趋势（当70%时，溶出量达到最大值）；继续提高至80%时得率反而下降。峰值时黄酮组分与溶剂的极性匹配度最佳，符合"相似相溶"原理。值得注意的是，当乙醇浓度超过70%后，提取液色泽明显加深，推测是高浓度乙醇溶解了更多色素及非目标成分所致REF_Ref15525\r\h[18]REF_Ref16328\r\h[19]。因此，后续实验选择70%作为最佳乙醇浓度参数。图SEQ图\*ARABIC2乙醇体积分数对黄酮得率的影响2.2.3.2提取时间对黄酮得率的影响在70%乙醇浓度、1:5料液比和2次提取的固定条件下，设置0.5、1.0、1.5、2.0小时四个时间梯度，探究提取时间与黄酮得率的相关性。由REF_Ref2534\h图3可知黄酮得率随时间变化呈现类似典型抛物线特征，1小时提取时获得最高得率4.84%。延长提取时间反而导致得率下降，这可能是由于：热不稳定性黄酮类物质发生降解；长时间超声处理引发成分氧化。基于此，确定1小时为最优提取时长。图SEQ图\*ARABIC3提取时间对黄酮得率的影响2.2.3.3提取次数对黄酮得率的影响保持70%乙醇浓度、1:5料液比和0.5小时提取时间的基准参数，实验通过设置1-4次梯度参数，探究提取次数对目标成分提取率间的影响关系。通过REF_Ref2573\h图4可看出，随着提取次数增加，黄酮得率可持续提高，这是因为经过反复的提取，药对中的黄酮成分不断溶出在溶剂中，使黄酮得到大量提取，得率增加。但从工业化生产角度综合考虑：三次以上提取的得率增幅趋缓；溶剂消耗和设备占用成本倍增。权衡效益与成本后，选择2次提取作为最佳方案。图SEQ图\*ARABIC4提取次数对黄酮得率的影响2.2.3.4料液比对黄酮得率的影响在固定乙醇体积分数（70%）、提取时长（0.5h）及提取轮次（2次）的优化工艺参数体系下，设计四个梯度固液比参数（1:5～1:20，g/mL），解析溶剂用量对成分提取的调控作用。结果见REF_Ref32568\h图5，在1:5至1:10范围内，得率与溶剂用量呈正相关。但超过1:10后出现反效现象，这是由于当溶剂含量占比较小时，药对中的黄酮不能完全溶出；随着溶剂量增多，过量的乙醇破坏黄酮的部分结构，杂质的溶出量也会增多REF_Ref16848\r\h[20]。因此1:10被确定为最经济的料液比参数。图SEQ图\*ARABIC5料液比对黄酮得率的影响2.2.4正交优化试验及最优组合验证实验2.2.4.1正交试验设计与结果基于单因素实验结果，本实验筛选出对黄酮提取效率具有显著影响的四个关键参数：乙醇体积分数（A）、提取时长（B）、提取轮次（C）和固液比（D）。采用正交试验设计方法，每个考察因素设置三个梯度水平（见REF_Ref196216911\h表1），通过L9(3^4)正交表安排实验方案，系统优化总黄酮的最佳提取工艺条件REF_Ref16848\r\h[20]。-1、0、1水平：A分别为60%、70%和80%；B分别为0.5、1和1.5h；C分别为1、2和3次；D分别为1:5、1:10和1:15（g:ml）。表SEQ表\*ARABIC1正交试验的因素与水平水平（A）乙醇浓度/%（B）提取时间/h（C）提取次数/次（D）料液比/(g:ml)1600.511:5270121:103801.531:15表SEQ表\*ARABIC2正交试验结果与分析试验号ABCD黄酮得率（%）111113.06212225.27313337.22421231.865223110.54623122.99731322.26832132.82933214.66k15.182.392.966.09k25.136.213.933.51k33.254.966.673.97极差R1.933.823.712.58基于正交试验设计的极差解析结果（REF_Ref16988\h表2）可以明确看出，各工艺参数对黄酮提取效率的调控作用存在显著性差异，其中提取时间（B）的对得率的贡献度最为突出，其后依次为提取次数（C）、料液比（D），而乙醇浓度（A）的影响权重最低。正交试验确定的优化工艺条件组合为A₁B₂C₃D₁，具体表现为60%乙醇浓度、1小时提取时间、3次提取次数以及1:5的料液比。2.2.4.2验证试验在正交实验基础上，选取最优参数组合（乙醇浓度60%、提取时间1小时、提取次数3次、料液比1:5），重复进行验证实验（n=3），并与对照组数据进行统计比较，验证优化结果的稳定性REF_Ref17448\r\h[21]。表SEQ表\*ARABIC3验证试验结果次数吸光度（A）黄酮得率（%）10.930411.0320.924210.9430.82879.66平均值0.894810.54以筛选的最优组合进行3次验证试验（见REF_Ref195109859\h表3），提取大黄-黄芪药对中的总黄酮，平均黄酮得率为10.54%，高于正交表中其他组合的提取结果，具一定的可行性。因此确定A₁B₂C₃D₁为大黄-黄芪药对黄酮提取工艺的最优组合。2.3讨论与小结方法学部分的系统评估涵盖精密度、稳定性、重复性与回收率等核心指标，均符合《中国药典》2020年版“9101分析方法验证指导原则”要求，确保了实验数据的真实性与结论的科学性REF_Ref18053\r\h[22]，为后续研究奠定了可靠的分析基础。相较于传统回流法（文献报道REF_Ref10969\r\h[23]黄酮得率5%~8%），优化后的超声辅助工艺（得率10.54%）显著提升了提取效率，其优势体现在：时间成本降低：1小时提取周期较常规2~3小时缩短50%以上；溶剂消耗减少：料液比1:5（g/mL）较传统1:10~1:15节约溶剂50%~67%，符合绿色提取理念。此外，本研究的一大亮点在于采用超声辅助提取工艺，不仅节约溶剂用量、缩短提取时间REF_Ref19058\r\h[24]，同时具备操作简便、成本可控等优势，适合在中药制剂生产中推广应用。所筛选的参数组合既满足实验效果的最大化，也兼顾了工艺的可持续性和工业放大的可行性，符合当前中药现代化发展的总体方向。后续研究可围绕工艺放大验证与成分特异性分析展开，推动该技术从实验室向实际生产的转化。参考文献熊皓舒,田埂,刘朋,等.中药生产过程质量控制关键技术研究进展[J].中草药,2020,51(16):4331–4337.程颖.大黄蒽醌代谢产物及单体成分对人结肠细胞潜在毒性作用的研究[D].西北大学,2021.陈学艳,魏文芝,张敏娟,等.UPLC法同时测定复方龙胆碳酸氢钠片中10种大黄蒽醌类成分及土大黄苷的含量[J].中国药房,2023,34(21):2595-2600.杨斐然.基于络病理论探讨消瘤平移方维持治疗晚期肺腺癌的临床疗效及其相关调控机制研究[D].山东中